"Метод выявления дрожжей и плесневых грибов в пищевых продуктах. Методические рекомендации"
(утв. Минздравом России 20.02.2004 N 24ФЦ/900)

1. Разработаны: Федеральным центром госсанэпиднадзора Минздрава России, ОАО "Лианозовский молочный комбинат", фирмой "Лаб-БиоМед".

2. Утверждены и введены в действие Заместителем главного государственного санитарного врача Российской Федерации - Главным врачом Федерального центра госсанэпиднадзора Минздрава России Е.Н. Беляевым.

3. Введены впервые.

1.1. Настоящие Методические рекомендации устанавливают методы проведения лабораторных исследований по выявлению дрожжей и плесневых грибов в определенной навеске пищевых продуктов.

1.2. Методические рекомендации разработаны в соответствии с Федеральным законом "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения", Положением о государственном санитарно-эпидемиологическом нормировании, Положением о государственной санитарно-эпидемиологической службе Российской Федерации.

1.3. Методические рекомендации предназначены для применения в лабораториях пищевой промышленности, осуществляющих производственный контроль пищевых продуктов.

2.1. Федеральный закон "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения" N 52-ФЗ от 30 марта 1999 г.

2.2. Закон РФ "О защите прав потребителей" от 7 февраля 1992 г.

2.3. Закон РФ "О качестве и безопасности пищевых продуктов" N 29-ФЗ от 2 января 2000 г.

2.4. "Положение о государственной санитарно-эпидемиологической службе Российской Федерации", утвержденное Постановлением Правительства Российской Федерации N 554 от 24 июля 2000 г.

2.5. "Положение о государственном санитарно-эпидемиологическом нормировании", утвержденное Постановлением Правительства Российской Федерации N 554 от 24 июля 2000 г.

2.6. СП 1.2.731-99 Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности и гельминтами.

2.7. ГОСТ 26668-85 Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов.

2.8. ГОСТ 26669-85 Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов.

2.9. ГОСТ 26670-91 Продукты пищевые. Методы культивирования микроорганизмов.

2.10. ГОСТ Р 51446-99 (ИСО 7218-96) Микробиология. Продукты пищевые. Общие правила микробиологических исследований.

2.11. ГОСТ 10444.12-88 Продукты пищевые. Метод определения дрожжей и плесневых грибов.

2.12. ГОСТ 9225-84 Молоко и молочные продукты. Методы микробиологического анализа.

2.13. ГОСТ 26809-86 Молоко и молочные продукты. Правила приемки, методы отбора и подготовки проб к анализу.

2.14. ГОСТ 28805-90 Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества осмотолерантных дрожжей и плесневых грибов.

2.15. ГОСТ 19569-89 Стерилизаторы паровые медицинские. Общие технические требования и методы испытаний.

2.16. ГОСТ 24104-2001 Весы лабораторные общего назначения и образцовые. Общие технические условия.

2.17. ГОСТ 29227-91 Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования.

2.18. ГОСТ 16317-87 Приборы холодильные электрические бытовые. Общие технические условия.

2.19. ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры.

2.20. ГОСТ 23932-90 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Общие технические условия.

2.21. ГОСТ 18300-87 Спирт этиловый ректификованный технический. Технические условия.

3.1. Требования безопасности, общее расположение лаборатории, а также ее инфраструктура должны удовлетворять требованиям СП 1.2.731, ГОСТ Р 51446.

--------------------------------

<*> Производство питательных сред компании Merck KGaA имеет международный сертификат качества ISO 9001:2000.

Допускается применение других средств измерения и оборудования с аналогичными характеристиками.

Метод основан на высеве определенного количества продукта в жидкую среду для обогащения; инкубировании посевов; последующем пересеве культуральной жидкости на поверхность агаризованной селективной среды с антибиотиком для выделения и дифференциации дрожжей и плесневых грибов по характеру роста.

Отбор проб пищевых продуктов, маркировка, сопроводительная документация, транспортировка и хранение в соответствии с ГОСТ 26668, ГОСТ 26809, ГОСТ 92225 и нормативно-технической документацией на анализируемый вид продукта.

7.1. Подготовка посуды и материалов в соответствии с ГОСТ 9225.

7.2. Состав, приготовление и условия хранения питательных сред.

7.2.1. Жидкая среда Сабуро 2% глюкозы (п. 4.17).

Состав среды в (г/куб. дм)

Пептон из мяса - 5,0;

Пептон из казеина - 5,0;

Глюкоза - 20,0.

Приготовление среды

В 1 куб. дм дистиллированной воды растворить 30 г сухой питательной среды. Стерилизовать в автоклаве при температуре (121 +/- 1) °С 15 минут.

Жидкая среда прозрачная, слегка желтоватая.

рН приготовленной среды: 5,6 +/- 0,2 при 25 °С.

Условия хранения

Приготовленная среда храниться в холодильнике при температуре (2 - 4) °С. Срок хранения готовой среды - 3 месяца.

7.2.2. Селективный агар YGC с хлорамфениколом (п. 4.18).

Состав среды в (г/куб. дм)

Дрожжевой экстракт - 5,0;

Глюкоза - 20,0;

Хлорамфеникол - 0,1;

Агар-агар - 14,9.

Приготовление среды

В 1 куб. дм дистиллированной воды растворить 40 г сухой питательной среды. Стерилизовать в автоклаве при температуре (121 +/- 1) °С 15 минут.

Приготовленные чашки со средой прозрачные, слегка желтоватые.

рН приготовленной среды: 6,6 +/- 0,2 при 25 °С.

Условия хранения

Чашки со средой хранить в холодильнике при температуре (2 - 4) °С. Срок хранения готовой среды на чашках - 4 месяца.

7.3. Приготовление раствора метиленового синего (концентрация 10 г/куб. дм).

Метиленовый синий в количестве 1,0 г перенести в фарфоровую ступку и растворить в дистиллированной воде. Раствор перенести в мерную колбу вместимостью 100 куб. см и долить до метки.

Раствор хранить в закрытой посуде из темного стекла при комнатной температуре не более 3 месяцев.

7.4. Подготовка проб к испытанию

7.4.1. Подготовку проб пищевых продуктов проводят в соответствии с ГОСТ 26669, ГОСТ 9225.

8.1. Для посева навеску продукта, в массе (объеме) которой предусматривается отсутствие дрожжей и плесневых грибов, отобрать весовым или объемным методом, внести в жидкую среду Сабуро, приготовленную по п. 7.2.1, и тщательно перемешать.

Соотношение массы (объема) продукта и жидкой среды 1:4.

Твердые образцы при необходимости следует измельчить в гомогенизаторе.

Посевы инкубировать при температуре (30 +/- 1) °С в течение (48 +/- 3) часа.

Дополнительно.

Рост дрожжей в жидкой среде Сабуро сопровождается, как правило, появлением мути, специфического запаха, брожения и газа.

8.2. После инкубирования по п. 8.1, посевы в количестве 0,1 куб. см внести на поверхность селективной агаризованной среды, YGC с хлорамфениколом, приготовленной по п. 7.2.2, и равномерно растереть шпателем.

8.2.1. Для предварительного выявления дрожжей и плесневых грибов инкубировать при температуре (30 +/- 1) °С в течение (24 +/- 2) часа.

8.2.2. Для окончательного выявления дрожжей и плесневых грибов инкубировать при температуре (30 +/- 1) °С в течение (48 +/- 3) часа.

8.3. После инкубирования по п. 8.2.1 провести предварительную оценку результатов.

8.3.1. Наличие видимого роста колоний на селективной агаризованной среде YGC с хлорамфениколом указывает на присутствие дрожжей и плесневых грибов в исследуемом продукте.

8.3.2. Отсутствие роста на агаризованной среде YGC с хлорамфениколом указывает на возможное отсутствие дрожжей и плесневых грибов в исследуемом продукте.

8.4. После инкубирования по п. 8.2.2 провести окончательную оценку результатов.

8.4.1. Отсутствие роста на агаризованной среде YGC с хлорамфениколом указывает на отсутствие дрожжей и плесневых грибов в исследуемом продукте.

8.4.2. Наличие характерных колоний на селективной агаризованной среде YGC с хлорамфениколом указывает на присутствие дрожжей или плесневых грибов в исследуемом продукте.

Рост дрожжей на агаризованной среде сопровождается образованием выпуклых, блестящих или матовых серовато-белых колоний.

Рост плесневых грибов сопровождается появлением плоских или пушистых разрастающихся колоний, часто с окрашенными, плодоносящими или спорообразующими структурами; окраска варьирует.

Дополнительно.

При необходимости для дифференциации дрожжей и плесневых грибов провести микроскопическое исследование. Дня этого из отдельных колоний приготовить мазки и окрасить их раствором метиленового синего, приготовленного по п. 7.3, выдержать 5 мин., слить краску, высушить на воздухе и микроскопировать. При микроскопировании дрожжи - одноклеточные микроорганизмы, клетки круглой, овальной или продолговатой формы, часто почкующиеся. Плесневые грибы состоят из нитей-гифов без перегородок; гифы образуют боковые выросты и разветвления.

Схема проведения испытаний приведена в Приложении N 1.

Если при испытании продукта на питательных средах обнаружен характерный рост дрожжей или плесневых грибов, то выдается заключение о наличии этих микроорганизмов в продуктах.

Результаты выявления дрожжей и плесневых грибов в определенной навеске продукта записывают:

Дрожжи или/и плесневые грибы выявлены (не выявлены) в Х г (куб. см) продукта, где Х - масса (объем) навески продукта, в которой выявляли дрожжи и плесневые грибы.