"МУК 4.1.3999-24. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств оксифлуорфена в луке-репке методом капиллярной газожидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 19.02.2024)

1. Разработаны ФГБОУ ВО "Российский государственный аграрный университет - МСХА имени К.А. Тимирязева", Учебно-научным консультационным центром "Агроэкология пестицидов и агрохимикатов" Минсельхоза России (А.В. Довгилевич, О.И. Рыбакова, Е.Н. Тестова, Н.С. Фролова).

2. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 19 февраля 2023 г.

3. Введены впервые.

1.1. Настоящие методические указания (далее - МУК) описывают порядок применения метода капиллярной газожидкостной хроматографии (далее - ГЖХ) для определения уровня остаточных количеств оксифлуорфена в луке-репке в диапазоне 0,05 - 0,5 мг/кг.

1.2. МУК носят рекомендательный характер.

1.3. Физико-химические свойства оксифлуорфена.

Название вещества <1>: 2-хлор-1-(3-этокси-4-нитрофенокси)-4-трифторметил бензол.

--------------------------------

<1> В соответствии с классификацией Международного союза теоретической и прикладной химии (ИЮПАК) (англ. International Union of Pure and Applied Chemistry, IUPAC).

Эмпирическая формула: C₁₅H₁₁ClF₃NO₄.

Молекулярная масса: 361,7.

Агрегатное состояние: красно-коричневое кристаллическое твердое вещество.

Цвет, запах: красно-коричневый, без запаха.

Давление насыщенного пара (при плюс 25 °C): 2,0 x 10^-6 Па.

Температура плавления: плюс 85 - 90 °C.

Коэффициент распределения в системе октанол/вода (при плюс 20 °C): K_ow log P = 4,47.

Растворимость в воде (при плюс 25 °C): 0,116 мг/дм³.

Растворимость в органических растворителях (г/дм³, при плюс 20 °C): ацетон - 134; этилацетат - 132; хлороформ - 50 - 55; метанол - 30; н-гептан - 3,8.

Стабильность к гидролизу при плюс 25 °C: гидролитически стабилен, несущественный гидролиз в 28 дней при pH 5 - 9.

Период полураспада в почве (ДТ₅₀): 292 дня.

1.4. Краткая токсикологическая характеристика: оксифлуорфен относится к веществам, малоопасным по острой оральной (полулетальная доза (далее - ЛД₅₀) для крыс более 5000 мг/кг) и дермальной токсичности ЛД₅₀ (для кроликов более 10000 мг/кг), но к умеренно опасным веществам по ингаляционной токсичности (полулетальная концентрация (ЛК₅₀) для крыс при экспозиции в течение 4 часов более 5400 мг/м³ воздуха).

1.5. Область применения: оксифлуорфен - селективный контактный гербицид. Используется для борьбы с однолетними широколиственными сорняками в посевах подсолнечника, лука, чеснока.

2.1. Метод основан на определении оксифлуорфена методом капиллярной ГЖХ с использованием электронозахватного детектора.

2.2. Определение оксифлуорфена в луке-репке проводится после его экстракции из образцов ацетоном, дальнейшей очистки экстракта перераспределением между двумя несмешивающимися фазами и очистки экстракта концентрированной серной кислотой.

2.3. Идентификация вещества проводится по времени удерживания, а количественное определение - методом абсолютной калибровки.

2.4. В условиях проведения анализа <2> и методики, изложенной в настоящих МУК, метод специфичен. Специфичность обеспечивается подбором хроматографической колонки и условий хроматографирования.

--------------------------------

<2> ГОСТ Р ИСО 5725-1 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 1. Основные положения и определения", введенный в действие постановлением Госстандарта России от 23.04.2002 N 161-ст; ГОСТ Р ИСО 5725-2 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 2. Основной метод определения повторяемости и воспроизводимости стандартного метода измерений", введенный в действие постановлением Госстандарта России от 23.04.2002 N 161-ст; ГОСТ Р ИСО 5725-3 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 3. Промежуточные показатели прецизионности стандартного метода измерений", введенный в действие постановлением Госстандарта России от 23.04.2002 N 161-ст; ГОСТ Р ИСО 5725-4 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 4. Основные методы определения правильности стандартного метода измерений", введенный в действие постановлением Госстандарта России от 23.04.2002 N 161-ст; ГОСТ Р ИСО 5725-5 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 5. Альтернативные методы определения прецизионности стандартного метода измерений", введенный в действие постановлением Госстандарта России от 23.04.2002 N 161-ст; ГОСТ Р ИСО 5725-6 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике", введенный в действие постановлением Госстандарта России от 23.04.2002 N 161-ст (далее - ГОСТ Р ИСО 5725-(1 - 6).

3.1. При соблюдении условий проведения анализа и методики, изложенной в настоящих МУК, погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 3.1, для соответствующих диапазонов концентраций.

4.1. При выполнении измерений и подготовке проб применяют средства измерений, реактивы, вспомогательное оборудование и материалы, приведенные в табл. 4.1 - 4.3.

5.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами в соответствии с ГОСТ 12.1.007, требования по электробезопасности при работе с электроустановками в соответствии с ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на газовый хроматограф.

5.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения в соответствии с ГОСТ 12.4.009. Организуется обучение работников безопасности труда.

6.1. Измерения в соответствии с методикой, изложенной в настоящих МУК, может выполнять специалист, имеющий опыт работы на газовом хроматографе, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений.

7.1. Отбор проб производится в соответствии с методическими документами <3>.

--------------------------------

<3> Унифицированные правила отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов, утвержденные заместителем Главного государственного санитарного врача СССР 21.08.1979 N 2051-79; Методические указания по регистрационным испытаниям пестицидов в части биологической эффективности. Общая часть, утвержденные Научно-техническим советом (секции земледелия и растениеводства) Министерства сельского хозяйства Российской Федерации (протокол N 15 от 16.11.2018); ГОСТ 34306 "Лук репчатый свежий. Технические условия", введенный в действие приказом Росстандарта от 28.11.2017 N 1844-ст.

7.2. Пробы лука-репки хранят в холодильнике при температуре плюс (4 +/- 2) °C не более суток, для длительного хранения пробы замораживают и хранят в полиэтиленовой таре в морозильной камере при температуре минус 18 °C.

8.1. При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха плюс 15 - 30 °C, относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на газовом хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

9.1. Выполнению измерений предшествуют: очистка растворителей (при необходимости), приготовление растворов, кондиционирование хроматографической колонки, установление градуировочной характеристики

9.2. Подготовка органических растворителей.

9.2.1. Очистка ацетона.

Ацетон, содержащий воду, предварительно осушают, добавляя в него гранулированный безводный хлористый кальций из расчета не менее 100 г/дм³. Выдерживают его над осушителем в течение 5 - 6 ч. Затем ацетон сливают с осушителя в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 см³ аппарата для перегонки растворителей, прибавляют марганцовокислый калий из расчета 100 мг/дм³.

Ацетон перегоняют при температуре плюс 56,0 - 56,5 °C, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше плюс 56,0 - 56,5 °C, отбрасывают.

9.2.2. Очистка гексана.

Гексан, содержащий воду, предварительно осушают, добавляя в него гранулированный безводный хлористый кальций из расчета не менее 100 г/дм³. Выдерживают его над осушителем в течение 5 - 6 ч. Затем гексан сливают с осушителя в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 см³ аппарата для перегонки растворителей.

Гексан перегоняют при температуре плюс 68,5 - 69,0 °C, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше плюс 68,5 - 69,0 °C, отбрасывают.

9.3. Приготовление растворов для проведения анализа.

9.3.1. Приготовление градуировочных растворов.

9.3.1.1. Стандартный раствор N 1 с концентрацией оксифлуорфена 1000 мкг/см³.

Взвешивают 100 мг оксифлуорфена в мерной колбе объемом 100 см³. Навеску растворяют в гексане и доводят объем до метки гексаном. Полученный стандартный раствор N 1 используется для приготовления стандартных растворов для хроматографического исследования и установления градуировочной характеристики. Стандартный раствор N 1 хранится в холодильнике при температуре плюс (4 +/- 2) °C не более 6 месяцев.

9.3.1.2. Стандартный раствор N 2 с концентрацией оксифлуорфена 10,0 мкг/см³.

Из стандартного раствора N 1 отбирают пипеткой 1 см³, помещают в мерную колбу объемом 100 см³ и доводят объем до метки гексаном. Стандартный раствор N 2 используется для приготовления стандартных растворов для хроматографического исследования и установления градуировочной характеристики. Стандартный раствор N 2 хранится в холодильнике при температуре плюс (4 +/- 2) °C не более 1 месяца.

9.3.1.3. Стандартный раствор N 3 с концентрацией оксифлуорфена 1,0 мкг/см³.

Из стандартного раствора N 2 отбирают пипеткой 1 см³, помещают в мерную колбу объемом 10 см³ и доводят объем до метки гексаном. Стандартный раствор N 3 используется для приготовления стандартных растворов для установления градуировочной характеристики. Стандартный раствор N 3 хранится в холодильнике при температуре плюс (4 +/- 2) °C не более 1 месяца.

9.3.1.4. Стандартный раствор N 4 с концентрацией оксифлуорфена 0,5 мкг/см³.

Из стандартного раствора N 3 отбирают пипеткой 5 см³, помещают в мерную колбу объемом 10 см³ и доводят объем до метки гексаном. Стандартный раствор N 4 используется для приготовления стандартных растворов для установления градуировочной характеристики. Стандартный раствор N 4 хранится в холодильнике при температуре плюс (4 +/- 2) °C не более 1 месяца.

9.3.1.5. Стандартный раствор N 5 с концентрацией оксифлуорфена 0,25 мкг/см³.

Из стандартного раствора N 4 отбирают пипеткой 5 см³, помещают в мерную колбу объемом 10 см³ и доводят объем до метки гексаном. Стандартный раствор N 5 используется для установления градуировочной характеристики и хранится в холодильнике при температуре плюс (4 +/- 2) °C не более 1 месяца.

9.3.1.6. Стандартный раствор N 6 с концентрацией оксифлуорфена 0,1 мкг/см³.

Из стандартного раствора N 3 отбирают пипеткой 1 см³, помещают в мерную колбу объемом 10 см³ и доводят объем до метки гексаном. Стандартный раствор N 6 используется для установления градуировочной характеристики и хранится в холодильнике при температуре плюс (4 +/- 2) °C не более 1 месяца.

9.3.1.7. Стандартный раствор N 7 с концентрацией оксифлуорфена 0,05 мкг/см³.

Из стандартного раствора N 4 отбирают пипеткой 1 см³, помещают в мерную колбу объемом 10 см³ и доводят объем до метки гексаном. Стандартный раствор N 7 используется для установления градуировочной характеристики и хранится в холодильнике при температуре плюс (4 +/- 2) °C не более 1 месяца.

9.3.1.8. Стандартный раствор N 8 с концентрацией оксифлуорфена 0,025 мкг/см³.

Из стандартного раствора N 5 отбирают пипеткой 1 см³, помещают в мерную колбу объемом 10 см³ и доводят объем до метки гексаном. Стандартный раствор N 8 используется для установления градуировочной характеристики и хранится в холодильнике при температуре плюс (4 +/- 2) °C не более 1 месяца.

9.3.1.9. Стандартный раствор N 9 с концентрацией оксифлуорфена 0,01 мкг/см³.

Из стандартного раствора N 6 отбирают пипеткой 1 см³, помещают в мерную колбу объемом 10 см³ и доводят объем до метки гексаном. Стандартный раствор N 9 используется для установления градуировочной характеристики и хранится в холодильнике при температуре плюс (4 +/- 2) °C не более 1 месяца.

9.3.1.10. Стандартные растворы оксифлуорфена с концентрацией 5,0; 2,0; 1,0 и 0,5 мкг/см³ для внесения в контрольные образцы лука-репки.

Методом последовательного разведения ацетоном стандартного раствора N 2 готовят растворы, содержащие по 5,0; 2,0; 1,0 и 0,5 мкг/см³ оксифлуорфена и используют эти растворы для внесения в контрольные образцы лука-репки. Стандартные растворы для внесения хранятся в холодильнике при температуре плюс (4 +/- 2) °C не более 1 месяца.

9.4. Установление и контроль стабильности градуировочной характеристики.

9.4.1. Установление градуировочной характеристики.

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади (высоты) пика от концентрации оксифлуорфена в растворе (мкг/см³), устанавливают методом абсолютной калибровки по 5 растворам для градуировки с концентрацией 0,25; 0,10; 0,05 и 0,025 и 0,01 мкг/см³.

В инжектор хроматографа вводят по 1 мм³ каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 10.2. Осуществляют не менее 5 параллельных измерений.

9.4.2. Контроль стабильности градуировочной характеристики.

Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят в начале и по окончании каждой серии анализов.

При контроле стабильности градуировочной характеристики проводят измерения не менее двух образцов концентраций для градуировки, содержание оксифлуорфена в которых должно охватывать весь диапазон концентраций от 0,01 до 0,25 мкг/см³.

Градуировочная характеристика считается стабильной, если для каждого используемого для контроля градуировочного раствора сохраняется соотношение (1):

где: X - концентрация оксифлуорфена контрольного измерения, мкг/см³;

C - известная концентрация градуировочного раствора оксифлуорфена в гексане, взятая для контроля стабильности градуировочной характеристики, мкг/см³;

10 - погрешность градуировочной характеристики, %.

Если величина расхождения (A) превышает 10%, делают вывод о невозможности применения градуировочной характеристики для дальнейших измерений. В этом случае выясняют и устраняют причины нестабильности градуировочной характеристики и повторяют контроль ее стабильности с использованием других градуировочных растворов оксифлуорфена, предусмотренных методикой выполнения измерений. При повторном обнаружении нестабильности градуировочной характеристики определяют ее заново согласно п. 9.4.1.

10.1. Лук-репка.

10.1.1. Экстракция.

Образец лука-репки массой 10 г помещают в стеклянный стакан объемом 500 см³, прибавляют 50 см³ ацетона и экстрагируют 3 минуты при помощи погружного миксера. Экстракт фильтруют через бумажный фильтр низкой плотности в отгонную колбу объемом 250 см³. Остаток на фильтре промывают 20 см³ ацетона. Экстракты объединяют в отгонной колбе объемом 250 см³ и выпаривают до водного остатка при температуре не выше плюс 30 °C.

10.1.2. Очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей.

К остатку в отгонной колбе, полученному по п. 10.1.1, прибавляют 100 см³ дистиллированной воды, обмывают стенки колбы и переносят в делительную воронку объемом 250 см³. К водной фракции в делительной воронке добавляют 5 г хлорида натрия и встряхивают воронку до полного растворения осадка. Исходную колбу обмывают 30 см³ гексана и переносят в делительную воронку с водной фазой. Встряхивают делительную воронку 2 минуты. После полного разделения фаз в делительной воронке нижний (водный) слой собирают в плоскодонную колбу объемом 250 см³, а верхний слой (гексан) в отгонную колбу объемом 250 см³, пропуская его через слой безводного сульфата натрия. Повторяют экстракцию оксифлуорфена еще двумя порциями гексана объемом по 30 см³, встряхивая делительную воронку каждый раз по 2 минуты. Гексановые экстракты, содержащие оксифлуорфен, объединяют в отгонной колбе объемом 250 см³ и выпаривают на ротационном вакуумном испарителе досуха при температуре не выше плюс 30 °C.

10.1.3. Очистка экстракта концентрированной серной кислотой <4>.

--------------------------------

<4> Примечание: процесс очистки экстракта концентрированной серной кислотой проводится только в работающей тяге. При добавлении воды возможно разбрызгивание раствора и разогрев посуды.

К сухому остатку в отгонной колбе, полученному по п. 10.1.2, последовательно прибавляют две порции гексана по 5 см³ каждая, обмывают стенки колбы и переносят в стеклянную виалу объемом 40 см³.

В виалу добавляют 1 см³ концентрированной серной кислоты и плотно закрывают крышкой. Смесь встряхивают и оставляют на 10 мин.

Затем в виалу добавляют 10 см³ дистиллированной воды, смесь аккуратно встряхивают. После полного разделения фаз из верхнего гексанового слоя отбирают аликвоту 5 см³, переносят в отгонную колбу объемом 100 см³ и выпаривают на ротационном вакуумном испарителе досуха при температуре не выше плюс 30 °C.

Сухой остаток растворяют в 10 см³ гексана и 1 мм³ хроматографируют.

10.2. Условия хроматографирования.

10.2.1. Хроматографическая система, включающая:

- хроматограф газовый с ЭЗД с пределом детектирования по линдану менее 0,8 x 10^-14 г/с, снабженный приспособлениями для капиллярной колонки, и с возможностью использования стандартного автосамплера с дозирующим объемом от 1 до 10 мм³ для автоматического ввода пробы в хроматографическую систему;

- компьютерное программное обеспечение, контролирующее работу всего прибора, обеспечивающее сбор и хранение всех хроматограмм в процессе проведения хроматографического анализа, обеспечивающее обработку результатов измерений, вывод и расчет хроматограмм и количественный анализ.

Колонка хроматографическая капиллярная из кварцевого стекла, с внутренним диаметром 0,32 мм, длиной 30 м, с неподвижной фазой, содержащей 5% дифенила и 95% диметилполисилоксана и толщиной пленки 0,25 мкм.

Температура детектора - плюс 300 °C, поток газа поддувки (азот) - 30,0 см³/мин.

Температура испарителя - плюс 260 °C, газ-носитель - гелий; режим с делением потока (сплит), деление потока 80:1, общий поток 213,6 см³/мин, поток обдува септы - 3,0 см³/мин.

Температура колонки: градиентный нагрев колонки, начиная с плюс 170 °C (выдержка 1 мин) по 10 град/мин до плюс 240 °C (выдержка 2 мин). Поток газа-носителя (гелий) - 2,6 см³/мин, скорость 48,1 см/сек.

Объем вводимой пробы: 1 мм³.

Линейный диапазон детектирования сохраняется в пределах 0,25 - 0,01 нг.

Образцы, дающие пики больше, чем стандартный раствор оксифлуорфена с концентрацией 0,25 мкг/см³, соответственно разбавляют. В этом случае разбавление учитывают в конечной формуле расчета содержания оксифлуорфена в пробах.

11.1. Для обработки результатов хроматографического анализа используется компьютерное программное обеспечение химического анализа, которое входит в хроматографическую систему.

11.2. Альтернативная обработка результатов.

Содержание оксифлуорфена в пробах рассчитывают по формуле (2), без учета полноты извлечения вещества из проб:

где: X - содержание оксифлуорфена в пробе, мг/кг;

A - концентрация оксифлуорфена, полученная по градуировочному графику в соответствии с величинами площадей хроматографических пиков, мкг/см³;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, см³;

m - масса анализируемого образца, г;

K - коэффициент, учитывающий объем экстракта, взятого для анализа (для лука-репки K = 2).

12.1. За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости, формула (3):

где: X₁, X₂ - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости (табл. 3.1), при этом .

При невыполнении условия выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

13.1. Результат анализа представляют в виде (формула 4):

где - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

- граница абсолютной погрешности, мг/кг (формула 5);

где - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 3.1), %.

В случае, если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде: "Содержание оксифлуорфена в луке-репке - менее 0,05 мг/кг".

14.1. Контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с методическими документами <5>.

--------------------------------

<5> ГОСТ Р ИСО 5725-(1 - 6).

Периодичность и формы контроля определяется системой менеджмента качества лаборатории.

1. Федеральный закон от 30.03.1999 N 52-ФЗ "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения".

2. ГОСТ Р 8.563 "Государственная система обеспечения единства измерений. Методики (методы) измерений".

3. ГОСТ Р ИСО 5725-(1 - 6) "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

4. ГОСТ 12.1.007 "Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности".

5. ГОСТ 12.1.019 "Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты".

6. ГОСТ 12.1.004 "Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования".

7. ГОСТ 12.4.009 "Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание".

8. ГОСТ Р 53228 "Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания".

9. ГОСТ 1770 "Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия".

10. ГОСТ 29227 "Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования".

11. ГОСТ 25336 "Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры".

12. ГОСТ Р 58144 "Вода дистиллированная. Технические условия".

13. ГОСТ Р 52501 "Вода для лабораторного анализа. Технические условия".

14. ГОСТ 5556 "Вата медицинская гигроскопическая. Технические условия".

15. ГОСТ 9293 "Азот газообразный и жидкий. Технические условия".

16. ГОСТ 2603 "Реактивы. Ацетон. Технические условия"

17. ГОСТ 20490 "Реактивы. Калий марганцовокислый. Технические условия".

18. ГОСТ 4204 "Реактивы. Кислота серная. Технические условия".

19. ГОСТ 4166 "Реактивы. Натрий сернокислый. Технические условия".

20. ГОСТ 4233 "Реактивы. Натрий хлористый. Технические условия".

21. ГОСТ 34306 "Лук репчатый свежий. Технические условия".

22. Унифицированные правила отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов.

23. Методические указания по регистрационным испытаниям пестицидов в части биологической эффективности.