"МУК 4.1.3976-24. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств имидаклоприда в чае методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 19.02.2024)

1. Разработаны ФБУН "ФНЦГ им. Ф.Ф. Эрисмана" Роспотребнадзора (Ракитский В.Н., Федорова Н.Е., Мухина Л.П.).

2. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 19 февраля 2024 г.

3 Введены впервые.

1.1. Настоящие методические указания (далее - МУК) описывают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (далее - ВЭЖХ) для определения в чае массовой концентрации имидаклоприда в диапазоне 2,5 - 50,0 мг/кг.

1.2. МУК носят рекомендательный характер.

2.1. Имидаклоприд - (E)-1-(6-хлор-3-пиридилметил)-нитроимидазолидин-2-илиденамин <1>. Брутто-формула: C₉H₁₀ClN₅O₂. Молекулярная масса 255,7.

--------------------------------

<1> В соответствии с Международным союзом теоретической и прикладной химии (ИЮПАК, англ. International Union of Pure and Applied Chemistry, IUPAC).

2.2. Физические и химические свойства

Химически чистый имидаклоприд представляет собой бесцветные кристаллы со слабым характерным запахом. Температура плавления: плюс 144 °C. Давление паров 4·10^-7 мPa (при плюс 20 °C), 9·10⁶ мPa (при плюс 25 °C). Коэффициент распределения в системе н-октанол-вода K_ow lgP = 0,57 (pH 7, при плюс 20 °C). Растворимость (г/л) при плюс 20 °C: в воде - 0,61; дихлорметане - 67; изопропаноле - 2,3; толуоле - 0,69; н-гексане - < 0,1. Стабилен к гидролизу при pH 5 - 11.

2.3. Краткая токсикологическая характеристика

Острая пероральная токсичность (LD₅₀) для крыс - 450 мг/кг; острая дермальная токсичность (LD₅₀) для крыс - более 5000 мг/кг; острая ингаляционная токсичность (LC₅₀) для крыс - более 5323 мг/м³ воздуха.

3.1. При соблюдении условий проведения анализа <2> и методики, изложенной в настоящих МУК, погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 3.1 для соответствующих диапазонов концентраций.

--------------------------------

<2> ГОСТ Р ИСО 5725-1 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 1. Основные положения и определения", введенный в действие постановлением Госстандарта России от 23.04.2002 N 161-ст; ГОСТ Р ИСО 5725-2 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 2. Основной метод определения повторяемости и воспроизводимости стандартного метода измерений", введенный в действие постановлением Госстандарта России от 23.04.2002 N 161-ст, ГОСТ Р ИСО 5725-3 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 3. Промежуточные показатели прецизионности стандартного метода измерений", введенный в действие постановлением Госстандарта России от 23.04.2002 N 161-ст, ГОСТ Р ИСО 5725-4 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 4. Основные методы определения правильности стандартного метода измерений", введенный в действие постановлением Госстандарта России от 23.04.2002 N 161-ст; ГОСТ Р ИСО 5725-5 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 5. Альтернативные методы определения прецизионности стандартного метода измерений", введенный в действие постановлением Госстандарта России от 23.04.2002 N 161-ст, ГОСТ Р ИСО 5725-6 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике", введенный в действие постановлением Госстандарта России от 23.04.2002 N 161-ст (далее - ГОСТ Р ИСО 5725-(1 - 6)).

3.2. Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для всего диапазона измерений (n = 20) приведены в табл. 3.2.

4.1. Методика основана на определении вещества с помощью ВЭЖХ на обращенной фазе с ультрафиолетовым детектором.

4.2. Экстракцию имидаклоприда из пробы чая выполняют ацетонитрилом с использованием смеси солей для экстракции (смесь сульфата магния, хлорида натрия и цитрата натрия), очистку экстрактов проводят методом дисперсионной твердофазной экстракции с применением смеси сорбентов на основе амина, октадецилсилана, графитизированной сажи.

4.3. Нижний предел измерения имидаклоприда в анализируемом объеме пробы - 1 нг.

5.1. При выполнении измерений и подготовке проб применяют средства измерений, реактивы, вспомогательное оборудование, устройства и материалы, приведенные в табл. 5.1 - 5.3.

6.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами в соответствии с ГОСТ 12.1.007, требования по электробезопасности при работе с электроустановками в соответствии с ГОСТ Р 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостные хроматографы.

6.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения в соответствии с ГОСТ 12.4.009. Организуется обучение работников безопасности труда.

6.3. Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист, имеющий опыт работы на жидкостном хроматографе, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментальное соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений.

7.1. При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха плюс (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией на прибор.

8.1. Измерениям предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), приготовление компонентов подвижной фазы для ВЭЖХ, смеси растворителей для разбавления градуировочных растворов, градуировочных растворов, растворов внесения, смеси солей для экстракции и смеси сорбентов для очистки экстрактов, кондиционирование хроматографической колонки, установление градуировочных характеристик, отбор проб.

8.2. Очистка органических растворителей

Ацетонитрил кипятят с обратным холодильником над пентоксидом фосфора (на 1 дм³ ацетонитрила 20 г пентоксида фосфора) не менее 1 часа, после чего перегоняют, непосредственно перед употреблением ацетонитрил повторно перегоняют над прокаленным карбонатом калия (на 1 дм³ ацетонитрила 10 г карбоната калия). Хранят в емкости из темного стекла.

8.3. Подготовка подвижной фазы для ВЭЖХ. В мерную колбу вместимостью 1000 см³ помещают 200 см³ ацетонитрила и 800 см³ бидистиллированной или деионизованной воды, перемешивают, фильтруют и дегазируют. Подвижную фазу хранят в темном месте (в емкости из темного стекла) не более 14 дней.

8.4. Кондиционирование хроматографической колонки для ВЭЖХ. Промывают колонку подвижной фазой (приготовленной по п. 8.3) при скорости подачи растворителя 0,8 см³/мин до установления стабильной базовой линии.

8.5. Приготовление раствора уксусной кислоты в ацетонитриле с объемной долей 1% (1% раствор)

В мерную колбу вместимостью 1000 см³ помещают 300 - 400 см³ ацетонитрила, вносят 10 см³ ледяной уксусной кислоты, перемешивают, доводят ацетонитрилом до метки, вновь перемешивают. Раствор готовят при температуре плюс 20 °C и хранят в темном месте (в емкости из темного стекла) не более 14 дней.

8.6. Приготовление градуировочных растворов и растворов внесения

8.6.1. Исходный раствор имидаклоприда для градуировки и внесения (концентрация 100 мкг/см³).

В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают (0,0100 +/- 0,0005) г имидаклоприда, добавляют 50 - 70 см³ ацетонитрила, перемешивают, доводят ацетонитрилом до метки, вновь перемешивают. Раствор хранится в холодильнике при температуре плюс (4 +/- 2) °C не более 1 месяца. Растворы N 1 - 6 готовят объемным методом путем последовательного разбавления исходного раствора для градуировки.

8.6.2. Раствор N 1 имидаклоприда для градуировки и внесения (концентрация 10 мкг/см³).

В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 10 см³ исходного раствора имидаклоприда с концентрацией 100 мкг/см³ (п. 8.6.1), доводят ацетонитрилом до метки, перемешивают. Градуировочный раствор N 1 хранят в холодильнике при температуре плюс (4 +/- 2) °C не более 1 месяца.

8.6.3. Рабочие растворы N 2 - 6 имидаклоприда для градуировки (концентрация каждого вещества по 0,05 - 1,0 мкг/см³).

В 5 мерных колб вместимостью 100 см³ помещают по 0,5, 1,0, 2,0, 5,0 см³ и 10 см³ градуировочного раствора N 1 с концентрацией имидаклоприда 10 мкг/см³ (п. 8.6.2), доводят до метки подвижной фазой, приготовленной по п. 8.3, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы N 2 - 6 с концентрацией имидаклоприда 0,05; 0,1; 0,2; 0,5 и 1,0 мкг/см³ соответственно. Растворы готовят при температуре плюс 20 °C и хранят в холодильнике при температуре плюс (4 +/- 2) °C не более 10 дней.

8.7. Приготовление смеси солей для экстракции <3>

--------------------------------

<3> Примечание: допускается использование коммерческих наборов солей QuEChERS для экстракции проб фруктов и овощей массой 10 г.

Для приготовления одного набора смеси солей для экстракции смешивают (4 +/- 0,01) г магния сернокислого, (1 +/- 0,01) г натрия хлористого, (1 +/- 0,01) г натрия лимоннокислого трехзамещенного, 2-водного и (0,5 +/- 0,01) г натрия лимоннокислого двузамещенного, 1,5-водного, до использования хранят в герметичной упаковке (не более 6 месяцев).

8.8. Приготовление смеси сорбентов для очистки экстрактов <4>

--------------------------------

<4> Примечание: допускается использование коммерческих наборов солей QuEChERS для экстракции проб фруктов и овощей с маслом и пигментами массой 10 г, помещенных в полипропиленовые пробирки вместимостью 15 см³.

Для приготовления одного набора смеси сорбентов для очистки экстрактов в центрифужную полипропиленовую пробирку вместимостью 15 см³ помещают (400 +/- 1) мг сорбента для твердофазной экстракции на основе первичного-вторичного амина, (4 +/- 1) мг графитизированной сажи, (1200 +/- 2) мг магния сернокислого и твердофазного сорбента на основе октадецилсилана (400 +/- 1) мг, закрывают герметично крышкой, встряхивают для перемешивания, хранят не более 6 месяцев.

8.9. Установление градуировочной характеристики

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика от концентрации имидаклоприда в растворе (мкг/см³), устанавливают методом абсолютной калибровки по 5 растворам для градуировки. В инжектор хроматографа вводят по 20 мм³ каждого градуировочного раствора N 2 - 6 и анализируют в условиях хроматографирования, указанных в п. 10.3. Осуществляют не менее 5 параллельных измерений. Устанавливают площади пиков имидаклоприда, на основании которых строят градуировочную зависимость.

8.10. Контроль стабильности градуировочной характеристики

При контроле стабильности градуировочной характеристики проводят измерения не менее двух образцов концентраций для градуировки, содержание имидаклоприда в которых должно охватывать весь диапазон концентраций от 0,05 до 1,0 мкг/см³.

Градуировочная характеристика считается стабильной, если для каждого из используемых для контроля градуировочных растворов сохраняется соотношение (1), (2):

где A - величина расхождения, %;

X - концентрация вещества в пробе при контрольном измерении, мкг/см³;

C - известная концентрация градуировочного раствора, взятая для контроля стабильности градуировочной характеристики, мкг/см³;

B - норматив контроля стабильности градуировочной характеристики, % (равен 20% при P = 0,95).

9.1. Отбор проб осуществляют в соответствии с методическими документами <5>.

--------------------------------

<5> Унифицированные правила отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов, утвержденных Минздравом СССР 21.08.1979 N 2051-79; Методические указания по регистрационным испытаниям пестицидов в части биологической эффективности, утвержденные Минсельхозом России 15.11.2018, ГОСТ 32573 "Чай черный. Технические условия", введенный приказом Росстандарта от 19.03.2014 N 186-ст.

9.2. Пробы чая хранят при температуре плюс (4 +/- 2) °C не более 2 недель. Для длительного хранения образцы замораживают и хранят при температуре не выше минус 18 °C.

9.3. Перед анализом образцы тщательно измельчают.

10.1. Экстракция

Образец чая массой 2 г помещают в центрифужную полипропиленовую пробирку вместимостью 50 см³. В пробирку с пробой чая вносят 10 см³ бидистиллированной воды, перемешивают, оставляют на 5 мин. Затем в пробирки вносят 10 см³ 1% раствора уксусной кислоты в ацетонитриле, помещают в пробирку керамический гомогенизатор, закрывают крышку и интенсивно встряхивают вручную 30 сек, вносят в пробирку смесь солей для экстракции (приготовленную по п. 8.7), закрывают крышкой и интенсивно встряхивают (вручную) в течение 1 мин. Затем пробу центрифугируют в течение 5 мин при скорости вращения 4000 об/мин и подвергают очистке с применением дисперсионной твердофазной экстракции по п. 8.8.

10.2. Очистка экстракта

Аликвоту экстракта (верхний слой в пробирке после центрифугирования) объемом 7,5 - 8 см³ с помощью пипетки переносят в пропиленовую центрифужную пробирку вместимостью 15 см³, содержащую смесь сорбентов, приготовленную по п. 8.8. Закрывают крышку и интенсивно встряхивают вручную в течение 30 сек. Центрифугируют 15 мин при скорости вращения 4000 об/мин. Отбирают с помощью градуированной пипетки 1 см³ экстракта в пробирку градуированную на 10 см³ с притертой пробкой, разбавляют подвижной фазой, приготовленную по п. 8.3 в 10 раз (до 10 см³), фильтруют через мембранный фильтр (размер пор 0,22 мкм) в виалу вместимостью 2 см³ с фторопластовой прокладкой и навинчивающейся крышкой. Помещают в автосамплер хроматографа для анализа в условиях хроматографирования по п. 10.3.

10.3. Условия хроматографирования

Измерения выполняют при следующих режимных параметрах:

- жидкостный хроматограф с ультрафиолетовым детектором с переменной длиной волны;

- хроматографическая колонка стальная, длиной 250 мм, внутренним диаметром 4,6 мм, заполненная обращенно-фазным сорбентом с привитыми монофункциональными полярными группами C18, зернение 5 мкм:

- рабочая длина волны: 268 нм;

- температура колонки: комнатная;

- подвижная фаза: ацетонитрил - деонизованная вода (20:80, по объему);

- скорость потока элюента: 0,8 см³/мин;

- объем вводимой пробы: 20 мм³;

- линейный диапазон детектирования: 1 - 20 нг.

11.1. Содержание имидаклоприда в пробе чая (X, мг/кг) рассчитывают по формуле (3):

где A - концентрация имидаклоприда, найденная по градуировочному графику в соответствии с величинами площадей хроматографических пиков, мкг/см³;

V - объем экстракта (10 см³);

m - масса анализируемого образца, г;

C - коэффициент, учитывающий разбавление экстракта, взятого для анализа, C = 10.

11.2. Проверка приемлемости результатов параллельных определений

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости и удовлетворяет условию (4):

где X₁, X₂ - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости (табл. 3.1), при этом .

При невыполнении условия (4) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

12.1. Результат анализа представляют в виде формулы (5):

где - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

- граница абсолютной погрешности, мг/кг, рассчитанная по формуле (6):

где - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, таблица 3.1), %.

Если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде: "содержание имидаклоприда в пробе чая - менее 2,5 мг/кг" <6>.

--------------------------------

<6> Примечание: 2,5 мг/кг - предел обнаружения имидаклоприда в пробе чая.

13.1. Организация контроля качества измерений осуществляется в соответствии с методическими документами <7>.

--------------------------------

<7> ГОСТ Р ИСО 5725-(1 - 6).

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.

Величина добавки должна удовлетворять условию (7):

где - характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно), мг/кг, при равенстве (8):

где - граница абсолютной погрешности, мг/кг, рассчитанная по формуле (9):

где - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 3.1), %.

Результат контроля процедуры К_к рассчитывают по формуле (10):

где , , C_д - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11.2) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки соответственно, мг/кг.

Норматив контроля К рассчитывают по формуле (11):

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (К_к) с нормативом контроля (К).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию (12):

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (12) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (12) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости:

расхождение между результатами измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), не должно превышать предела воспроизводимости (13):

где X₁, X₂ - результаты измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), мг/кг;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций, таблица 3.1), %.

1. Федеральный закон от 30.03.1999 N 52-ФЗ "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения".

2. ГОСТ Р ИСО 5725-1 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 1. Основные положения и определения".

3. ГОСТ Р ИСО 5725-2 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 2. Основной метод определения повторяемости и воспроизводимости стандартного метода измерений".

4. ГОСТ Р ИСО 5725-3 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 3. Промежуточные показатели прецизионности стандартного метода измерений".

5. ГОСТ Р ИСО 5725-4 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 4. Основные методы определения правильности стандартного метода измерений".

6. ГОСТ Р ИСО 5725-5 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 5. Альтернативные методы определения прецизионности стандартного метода измерений".

7. ГОСТ Р ИСО 5725-6 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике".

8. ГОСТ Р 53228 "Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания".

9. ГОСТ OIML R 111-1 "Гири классов E(1), E(2), F(1), F(2), M(1), M(1-2), M(2), M(2-3) и M(3). Часть 1. Метрологические и технические требования".

10. ГОСТ 1770 "Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия".

11. ГОСТ 29227 "Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования".

12. ГОСТ 25336 "Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры".

13. ГОСТ 61-75 "Кислота уксусная. Технические условия"

14. ГОСТ 4221 "Калий углекислый. Технические условия".

15. ГОСТ 4233 "Натрий хлористый. Технические условия".

16. ГОСТ 22280 "Натрий лимоннокислый 5,5-водный. Технические условия".

17. ГОСТ Р 52501 "Вода для лабораторного анализа. Технические условия".

18. ГОСТ ISO 7886-1 "Шприцы инъекционные однократного применения стерильные. Часть 1. Шприцы для ручного использования".

19. ГОСТ 12.1.004 "Пожарная безопасность. Общие требования".

20. ГОСТ 12.1.007 "Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности".

21. ГОСТ 12.1.019 "Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты".

22. ГОСТ 12.4.009 "Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание".

23. ГОСТ 32573 "Чай черный. Технические условия".

24. Унифицированные правила отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов.

25. Методические указания по регистрационным испытаниям пестицидов в части биологической эффективности.