"МУК 4.2.4063-24. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Организация и проведение исследований материалов из объектов окружающей среды на полиовирусы, неполиоэнтеровирусы. Методические указания по методам контроля"
(утв. Роспотребнадзором 27.09.2024)

1. Разработаны Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (Мельникова А.А., Фролова Н.В.); ФБУЗ "Федеральный центр гигиены и эпидемиологии" Роспотребнадзора (Михайлова Ю.М., Черепанова Е.А., Морозова Н.С., Зароченцев М.В.); ФГАНУ "ФНЦИРИП им. М.П. Чумакова РАН" (Институт полиомиелита) (Иванова О.Е., Козловская Л.И., Байкова О.Ю.); ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера (Канаева О.И., Романенкова Н.И.); ФБУН "ННИИЭМ им. академика И.Н. Блохиной" Роспотребнадзора (Голицына Л.Н., Новикова Н.Н.); ФБУН "Хабаровский НИИ эпидемиологии и микробиологии" Роспотребнадзора (Троценко О.Е., Сапега Е.Ю., Бутакова Л.В.); Управлением Роспотребнадзора по Ставропольскому краю (Ковальчук И.В.); Управлением Роспотребнадзора по Свердловской области (Скрябина С.В.); Управлением Роспотребнадзора по г. Москве (Сапожкова О.Б.); ФБУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии" в г. Москве (Ярмольская М.С., Бабкина Г.М.); Филиал ФБУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии в городе Москве" в ЗАО города Москвы (Кудрявцев Д.С.); ФБУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии" в Ставропольском крае (Романенко Е.Н., Зволибовская А.В., Межлумян Н.А.); ФБУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии" в Свердловской области (Снитковская Т.Э.); ФБУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии" в Хабаровском крае (Лебедева Л.А.).

2. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 27 сентября 2024 г.

3. МУК 4.2.4063-24 введены взамен МУК 4.2.2357-08 "Организация и проведение вирусологических исследований материалов из объектов окружающей среды на полиовирусы, другие (неполио) энтеровирусы", утвержденных руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 04.05.2008.

1.1. Настоящие методические указания по методам контроля (далее - МУК) описывают порядок сбора, упаковки, хранения, транспортирования и проведения лабораторных исследований материалов из объектов окружающей среды в целях слежения за циркуляцией полиовирусов, неполиоэнтеровирусов (далее - НПЭВ) среди населения <1>.

--------------------------------

<1> Глава XXXII СанПиН 3.3686-21 "Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней", утвержденных постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 28.01.2021 N 4 (зарегистрировано Минюстом России 15.02.2021, регистрационный N 62500), с изменениями, внесенными постановлениями Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 11.02.2022 N 5 (зарегистрировано Минюстом России 01.03.2022, регистрационный N 67587); от 25.05.2022 N 16 (зарегистрировано Минюстом России 21.06.2022, регистрационный N 68934) (далее - СанПиН 3.3686-21); План действий по поддержанию свободного от полиомиелита статуса Российской Федерации на 2022 - 2024 гг., утвержденный руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека/Министром здравоохранения Российской Федерации 02.02.2022 (далее - План действий на 2022 - 2024 гг.).

1.2. Настоящие МУК предназначены для специалистов органов и организаций, осуществляющих федеральный государственный санитарно-эпидемиологический контроль (надзор) в отношении полиомиелита, а также могут быть использованы специалистами научно-исследовательских и медицинских организаций (далее - МО) в целях обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия по полиомиелиту.

2.1. Исследования материалов из объектов окружающей среды (далее - ООС) на полиовирусы, НПЭВ являются элементом системы эпидемиологического надзора за полиомиелитом, осуществляемого в рамках реализации Национального плана действий по поддержанию свободного от полиомиелита статуса Российской Федерации <2>.

--------------------------------

<2> План действий на 2022 - 2024 гг.

2.2. Основной целью исследований материалов из ООС является получение данных о циркуляции полиовирусов среди населения <3>. При проведении исследований достоверно подтверждается наличие или отсутствие полиовирусов в каждой пробе и определяется происхождение каждого выделенного полиовируса (дикий (далее - ДПВ), вакцинного происхождения 1, 2, 3 типов (далее - ПВВП), вакциноподобные - подобные штаммам Сэбина 1, 2, 3 типов или штамму, входящему в состав новой оральной полиовирусной вакцины типа 2 (далее - нОПВ2).

--------------------------------

<3> Пункт 2526 СанПиН 3.3686-21.

2.3. Объектом исследования при мониторинге за циркуляцией полиовирусов среди населения являются неочищенные сточные воды, образующиеся в процессе хозяйственной деятельности населения <4>.

--------------------------------

<4> Пункты 2529, 2641 СанПиН 3.3686-21.

2.4. В связи с широкой циркуляцией НПЭВ (включая бессимптомные формы) среди населения, идентификация НПЭВ в пробах сточных вод в рамках эпидемиологического надзора за полиомиелитом является второстепенной задачей <5>.

--------------------------------

<5> ВОЗ. Руководство по надзору за вирусом полиомиелита в окружающей среде, 2003: fcgie.ru/page,6,koord_tsentr.html (в свободном доступе). (далее - ВОЗ. Руководство по надзору за вирусом полиомиелита в окружающей среде, 2003).

2.5. Исследование проб сточных вод позволяет установить связь полиовируса, выделяемого неизвестными лицами в сточные воды, с группой населения, которая обслуживается соответствующей частью системы канализации <6>.

--------------------------------

<6> ВОЗ. Руководство по надзору за вирусом полиомиелита в окружающей среде, 2003.

2.6. Частота обнаружения полиовирусов, НПЭВ в пробах сточных вод является одним из критериев эффективности проведения мониторинга. В странах умеренного климата она может составлять 30% и более и зависит от следующих факторов: места отбора проб, времени отбора проб, кратности отбора проб, условий доставки проб в лабораторию, метода концентрирования, метода исследования, наличия в пробе химических факторов, влияющих на выживаемость вируса [1, 2, 3]. Наибольшая концентрация полиовирусов и НПЭВ в сточных водах достигается в период пиковой нагрузки на канализационную сеть. В летнее время необходимо учитывать температуру окружающей среды, поскольку вирус быстрее деактивируется при нагревании <7>.

--------------------------------

<7> ВОЗ. Полевое руководство по проведению надзора за полиовирусом в окружающей среде, 2023 (англ. WHO. Field guidance for the implementation of environmental surveillance for poliovirus, 2023 - polioeradication.org (в свободном доступе) (далее - ВОЗ. Полевое руководство по проведению надзора за полиовирусом в окружающей среде, 2023).

2.7. При использовании в рамках национального календаря профилактических прививок и календаря профилактических прививок по эпидемическим показаниям <8> для иммунизации против полиомиелита оральной полиовирусной вакцины (далее - ОПВ), вакциноподобные (вакцинные) полиовирусы могут выделяться из проб сточной воды в течение всего года, наиболее интенсивно - во время проведения дополнительных мероприятий по иммунизации с применением ОПВ <9>.

--------------------------------

<8> Приказ Минздрава России от 06.12.2021 N 1122н "Об утверждении национального календаря профилактических прививок, календаря профилактических прививок по эпидемическим показаниям и порядка проведения профилактических прививок" (зарегистрирован Минюстом России 20.12.2021, регистрационный N 66435).

<9> ВОЗ. Полевое руководство по проведению надзора за полиовирусом в окружающей среде, 2023.

3.1. Выбор точек и места отбора проб осуществляется в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями <10>. На каждую точку, включенную в программу <11> планового мониторинга за циркуляцией полиовирусов среди населения, оформляется паспорт (приложение 1 к настоящим МУК).

--------------------------------

<10> Пункты 2528, 2529, 2641 СанПиН 3.3686-21.

<11> Пункты 2527, 2528, 2530, 2639, 2640, 2642 СанПиН 3.3686-21.

3.2. Рекомендованный размер группы населения, которую охватывает точка отбора проб сточных вод, составляет 100 - 300 тыс. человек <12>.

--------------------------------

<12> ВОЗ. Полевое руководство по проведению надзора за полиовирусом в окружающей среде, 2023.

3.2.1. Если точка охватывает группу населения менее 100 тыс. человек и рядом расположены другие точки отбора проб сточных вод и пробы в этих рядом расположенных точках отбираются одномоментным способом (см п. 5.1.1), допускается возможность исследования объединенных проб <13>.

--------------------------------

<13> ВОЗ. Руководство по надзору за вирусом полиомиелита в окружающей среде, 2003.

3.2.2. Если точка охватывает группу населения больше 300 тыс. человек, соответствующее снижение результативности мониторинга можно компенсировать более частым отбором проб <14>.

--------------------------------

<14> ВОЗ. Руководство по надзору за вирусом полиомиелита в окружающей среде, 2003.

3.3. Большой объем сточных вод, поступающих на очистные сооружения, в канализационный коллектор, может снизить результативность исследований вследствие фактора разбавления. Поэтому в крупных городах можно разбить <15> охватываемое население на группы и отбирать пробы на объектах, охватывающих эти группы, например, на социально значимых объектах <16>.

--------------------------------

<15> ВОЗ. Руководство по надзору за вирусом полиомиелита в окружающей среде, 2003.

<16> Пункт 2529 СанПиН 3.3686-21.

3.4. Исследования сточных вод в рамках производственного контроля не соответствуют цели мониторинга за циркуляцией полиовирусов среди населения. Точки отбора проб сточных вод в рамках производственного контроля в программу планового мониторинга за циркуляцией полиовирусов среди населения не включаются.

3.5. При необходимости введения в плановый мониторинг новой точки отбора сточных вод она проходит процедуру валидации в течение 6 - 12 месяцев до официального включения в программу планового мониторинга за циркуляцией полиовирусов среди населения.

3.6. Валидация включает анализ результативности исследований проб сточных вод в новой точке в течение первых шести месяцев после начала отбора проб <17>.

--------------------------------

<17> ВОЗ. Полевое руководство по проведению надзора за полиовирусом в окружающей среде, 2023.

3.6.1. Если в течение данного периода из проб, отобранных в новой точке, выделяются полиовирусы и НПЭВ, точка может быть включена в программу мониторинга на следующий год в качестве постоянной.

3.6.2. Если результаты исследований в течение первых 6 месяцев окажутся нулевыми, проводится оценка правильности выбора точки, кратности отбора проб, условий транспортирования проб, соблюдения алгоритма проведения лабораторных исследований. Выявленные нарушения корректируют, после чего, организуется дополнительный период наблюдения в течение шести месяцев. Если после истечения дополнительного периода наблюдения результативность исследований не улучшается, точку не включают в программу планового мониторинга.

3.7. Если точка, не прошедшая валидацию, охватывает популяцию, имеющую эпидемиологические риски <18>, определяют новую точку в той же зоне обслуживания (административной территории). Если найти новое место отбора в той же зоне обслуживания невозможно, выбирают альтернативное место отбора проб с похожими эпидемиологическими рисками <19>.

--------------------------------

<18> Пункт 2529 СанПиН 3.3686-21.

<19> ВОЗ. Полевое руководство по проведению надзора за полиовирусом в окружающей среде, 2023.

3.8. Отбор проб сточных вод в рамках планового мониторинга полиовирусов среди населения проводят в каждой точке в течение всего года в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями <20>.

--------------------------------

<20> Пункты 2530, 2642 СанПиН 3.3686-21.

3.9. При проведении плановой <21> паспортизации точек отбора проб сточных вод проводят оценку всех этапов мониторинга (от выбора точек на основании данных паспортов до выдачи результатов лабораторных исследований).

--------------------------------

<21> Пункт 2530 главы XXXII СанПиН 3.3686-21.

3.10. Если в течение 6 - 12 месяцев в точке отбора проб сточных вод, включенной в программу планового мониторинга, не выделяются полиовирусы или НПЭВ, необходимо провести оценку правильности выбора точки, кратности отбора проб, условий транспортирования проб, соблюдения алгоритма проведения лабораторных исследований, выявить причины низких результатов и осуществить корректирующие действия. Если в течение следующих 6 месяцев эффективность точки не улучшается, ее необходимо закрыть и валидировать новую точку отбора <22>.

--------------------------------

<22> ВОЗ. Полевое руководство по проведению надзора за полиовирусом в окружающей среде, 2023.

4.1. При возникновении эпидемических показаний территориальные органы, осуществляющие федеральный государственный санитарно-эпидемиологический контроль (надзор), принимают меры по увеличению объемов лабораторных исследований проб из ООС <23>.

--------------------------------

<23> Пункты 2534, 2542 СанПиН 3.3686-21.

4.2. Эпидемическим показанием для увеличения объемов лабораторных исследований проб из ООС является выявление ДПВ, ПВВП любых типов или вакциноподобных полиовирусов типа 2 (как подобных штамму Сэбина типа 2, так и штамму, входящему в состав нОПВ2) (далее - ПВ типа 2) из любой пробы, в том числе единичной (клинический материал от больных полиомиелитом, острыми вялыми параличами (далее - ОВП), энтеровирусной (неполио) инфекцией, контактных с ними в очаге, сточная вода).

4.3. Кратность отбора проб сточных вод по эпидемическим показаниям увеличивается до не менее двух раз в неделю на весь период выделения ДПВ, ПВВП любых типов или ПВ типа 2 и на период 12 месяцев от даты отбора последней пробы положительной на ДПВ, ПВВП или ПВ типа 2.

4.4. При выявлении эпидемиологических рисков, указывающих на возможное осложнение эпидемиологической ситуации в отношении энтеровирусной (неполио) инфекции, территориальными органами, осуществляющими федеральный государственный санитарно-эпидемиологический контроль (надзор), может быть принято решение о введении дополнительной точки отбора сточных вод и (или) об отборе проб из других ООС <24>.

--------------------------------

<24> Пункт 2646 СанПиН 3.3686-21.

5.1. Пробы отбирают одним из следующих методов:

5.1.1. Одномоментный <25> - отбирают определенный объем воды в определенное время, или серию проб определенного объема в разное, заранее выбранное время, из которых затем составляют объединенную пробу. Рекомендованный объем пробы - от 1,0 до 1,5 л для неочищенной сточной воды <26> и не менее 10 л воды из других ООС <27>. Рекомендованное время отбора должно соответствовать пиковой нагрузке на канализационную сеть.

--------------------------------

<25> ВОЗ. Полевое руководство по проведению надзора за полиовирусом в окружающей среде, 2023.

<26> ВОЗ. Руководство по надзору за вирусом полиомиелита в окружающей среде, 2003.

<27> МУК 4.2.2029-05 "Санитарно-вирусологический контроль водных объектов", утвержденные руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 18.11.2005.

5.1.2. Адсорбционный <28> - пакет с сорбентом или марлевый тампон с помощью прочной лески закрепляют в токе сточной воды на срок от 3 до 7 суток или в соответствии с инструкцией производителя.

--------------------------------

<28> ВОЗ. Руководство по надзору за вирусом полиомиелита в окружающей среде, 2003.

5.2. К отбору проб допускаются сотрудники, прошедшие обучение соответствующим процедурам отбора и имеющие защитные титры вируснейтрализующих антител к полиовирусам. Рекомендуется также вакцинация против столбняка, брюшного тифа, холеры, гепатита A <29>.

--------------------------------

<29> ВОЗ. Полевое руководство по проведению надзора за полиовирусом в окружающей среде, 2023.

5.3. Отбор проб проводят с использованием средств индивидуальной защиты - защитная одежда (водоотталкивающие комбинезоны), резиновые сапоги, резиновые перчатки, защитные очки и респиратор (или защитный экран) <30>.

--------------------------------

<30> ВОЗ. Полевое руководство по проведению надзора за полиовирусом в окружающей среде, 2023.

5.4. Для отбора проб воды одномоментным способом используют одноразовые емкости. Емкости должны иметь винтовые крышки с наружной резьбой. Крышки должны предохранять содержимое емкости от протечек <31>.

--------------------------------

<31> Пункт 2570 СанПиН 3.3686-21; ВОЗ. Руководство по надзору за вирусом полиомиелита в окружающей среде, 2003.

5.5. Сразу после отбора проб одномоментным способом поверхность емкости, в которую была отобрана проба, протирают дезинфицирующим средством, маркируют (номер пробы), помещают в термоконтейнеры или термосы, обеспечивающие температурный режим плюс 4 - 8 °C.

5.6. Пробы, отобранные адсорбционным методом, помещают в емкость, предотвращающую протечки <32>.

--------------------------------

<32> Пункт 2570 СанПиН 3.3686-21; ВОЗ. Руководство по надзору за вирусом полиомиелита в окружающей среде, 2003.

5.7. На каждую пробу оформляется акт отбора в двух экземплярах, с которым пробу доставляют в лабораторию. В акте отбора указывают место отбора, дату и время отбора (при одномоментном методе отбора проб) или дату и время установки сорбента, дату и время снятия сорбента (при адсорбционном методе отбора проб), данные сотрудника (ФИО, должность), проводившего отбор проб.

5.8. Пробы, отобранные одномоментным методом, доставляют в лабораторию в день отбора, адсорбционным методом в день снятия пакета с сорбентом или марлевого тампона. При проведении исследований в других субъектах Российской Федерации пробы целесообразно доставить в течение 72 часов. При задержке отправки пробы хранят при температуре плюс 4 - 8 °C не более 72 часов. О задержке доставки уведомляют лабораторию-получателя.

6.1. Сразу после доставки материалов в лабораторию упаковочную коробку, термоконтейнер или термос распаковывают в отведенной для этого зоне, с соблюдением требований биологической безопасности <33>.

--------------------------------

<33> ВОЗ. Руководство по лабораторным исследованиям на полиовирусы, 2004. (англ. WHO. Polio Laboratory Manual. 4th ed. 2004 - iris.who.int (в свободном доступе) (далее - ВОЗ. Руководство по лабораторным исследованиям на полиовирусы, 2004).

6.2. В зоне, где происходит распаковка, должны иметься емкость для мусора, тампоны, смоченные дезинфицирующим раствором, активным в отношении полиовирусов и НПЭВ, бокс микробиологической безопасности 2 класса (далее - БМБ 2 класса) <34>. Емкости с пробами помещаются на поднос или лоток, покрытый многослойной марлевой салфеткой, смоченной дезинфицирующим раствором. Персонал лаборатории использует маску, резиновые перчатки, халат, шапочку <35>.

--------------------------------

<34> Пункт 334 СанПиН 3.3686-21; ВОЗ. Руководство по лабораторным исследованиям на полиовирусы, 2004.

<35> Пункт 337 СанПиН 3.3686-21.

6.3. При распаковке материалов в лаборатории проверяют полноту сопроводительных документов, соответствие сведений на этикетке и в направлении, оценивают и фиксируют в рабочих записях состояние поступивших проб ("удовлетворительное" или "неудовлетворительное", нарушения упаковки, целостность емкостей с пробами, протечки проб, соблюдение температурного режима). "Удовлетворительными" считают пробы, доставленные в достаточном объеме, с соблюдением температурного режима, без нарушения упаковки и протечки проб, без нарушений при заполнении документации.

6.4. Каждой пробе присваивают идентификационный номер, который сопровождает все документы и емкости (центрифужные пробирки, флаконы или пробирки с культурой клеток), относящиеся к данной пробе в процессе ее исследования и хранения в лаборатории, проводящей исследования.

6.5. Приготовление проб к исследованию проводят в течение 24 - 48 часов с момента получения проб. В данный период пробы хранят при температуре плюс 2 - 8 °C. Если обработка планируется позже 48 часов, то пробу, отобранную одномоментным способом, хранят при температуре не выше минус 20 °C. Пробы, отобранные адсорбционным способом, замораживанию не подлежат. Пробы сточной воды хранятся отдельно от клинического материала.

6.6. Накопление проб в лаборатории и проведение ретроспективных исследований не допускается, так как это приводит к несвоевременным противоэпидемическим (профилактическим) мероприятиям в случаях, выделения из проб ДПВ, ПВВП любого типа, ПВ типа 2.

6.7. Для предотвращения перекрестной контаминации необходимо исключить одновременную обработку проб из ООС и проб, полученных в рамках эпидемиологического надзора за синдромом ОВП и от детей из "групп риска" <36>. Рекомендуется проводить обработку проб из ООС и проб, полученными в рамках эпидемиологического надзора за синдромом ОВП и от детей из "групп риска", в разных помещениях. Если такая возможность отсутствует, обработку проб из ООС и проб, полученными в рамках эпидемиологического надзора за синдромом ОВП и от детей из групп риска разделяют по времени. Между процедурами проводят обеззараживание рабочих поверхностей, оборудования и помещения в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями <37> и методическими документами <38>.

--------------------------------

<36> Примечание: к "группам риска" относятся дети, прибывшие из эндемичных или неблагополучных по полиомиелиту стран (территорий), из семей мигрантов и кочующих групп населения, беженцы, вынужденные переселенцы.

<37> Приложение 2 СанПиН 3.3686-21.

<38> МУ-287-113 "Дезинфекция, предстерилизационная очистка и стерилизации изделий медицинского назначения", утвержденные Минздравом России 30.12.1998 (далее - МУ-287-113).

6.8. Концентрирование проб, отобранных одномоментным способом, проводят методом двухфазного разделения или мембранной фильтрации (приложение 2 к настоящим МУК).

6.8.1. При использовании метода двухфазного разделения пробы, отобранные одномоментным способом, делят на две части до концентрирования. Одну часть подвергают концентрированию, другую хранят при температуре не выше минус 20 °C для возможного повторного исследования.

6.8.2. При использовании метода мембранной фильтрации пробы, отобранные одномоментным способом, делят на две части после концентрирования. Одну часть берут в исследование, другую хранят при температуре не выше минус 20 °C для возможного повторного исследования.

6.9. Концентрирование проб, отобранных адсорбционным методом, проводят в соответствии с инструкцией производителя.

7.1. Исследования проводят в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями <39>, при выполнении лабораторных исследований применяются средства измерений, вспомогательное и испытательное оборудование, расходные материалы и реактивы в соответствии с приложением 5 к настоящим МУК.

--------------------------------

<39> Пункты 2531, 2532, 2643, 2644 СанПиН 3.3686-21.

7.2. Исследованию подлежат концентраты проб. Перед началом исследований одну четверть концентрата пробы (1 - 3 мл) замораживают и хранят при температуре не выше минус 20 °C, кроме элюатов, полученных с сорбентов. Замораживание элюатов, полученных с сорбентов, до заражения культуры клеток не допускается.

7.3. Основной метод проведения исследований - вирусологический (изоляция вирусов на культурах клеток).

7.4. Метод полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (далее - ОТ-ПЦР) может быть использован как основной при отсутствии условий для проведения вирусологических исследований (отсутствие вирусологической лаборатории и (или) вирусолога) в учреждениях, обеспечивающих деятельность территориальных органов, осуществляющих федеральный государственный санитарно-эпидемиологический контроль (надзор) <40>.

--------------------------------

<40> Пункт 2456 СанПиН 3.3686-21.

7.5. Проведение исследований проб из ООС методом ОТ-ПЦР осуществляют тест-системами, зарегистрированными и разрешенными к применению в Российской Федерации в установленном порядке <41>, в соответствии с методическими документами <42> и инструкциями производителей. Интерпретация результатов исследований проб из ООС, проведенных методом ОТ-ПЦР, выполняется в соответствии с инструкциями производителей.

--------------------------------

<41> Часть 4 статьи 38 Федерального закона от 21.11.2011 N 323-ФЗ "Об основах охраны здоровья граждан в Российской Федерации" (далее - Федеральный закон от 21.11.2011 N 323-ФЗ); постановление Правительства Российской Федерации от 27.12.2012 N 1416 "Об утверждении Правил государственной регистрации медицинских изделий" (далее - постановление Правительства Российской Федерации от 27.12.2012 N 1416).

<42> МУ 1.3.2569-09 "Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащем микроорганизмы I - IV групп патогенности", утвержденные руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 22.12.2009 (далее - МУ 1.3.2569-09).

7.6. Алгоритм проведения вирусологического исследования приведен в приложении 3 к настоящим МУК. Вирусологическое исследование с предоставлением результатов проводится в течение 15 - 21 дней <43> с момента поступления пробы в лабораторию.

--------------------------------

<43> Пункт 2486 СанПиН 3.3686-21.

7.7. Изоляты полиовирусов (приложение 3 к настоящим МУК) доставляют в Национальную лабораторию по диагностике полиомиелита (далее - НЛДП) от момента получения результата с предварительным уведомлением <44>. Изоляты целесообразно доставлять в течение 72 часов. При выделении смеси полиовирусов и НПЭВ в НЛДП направляют неразделенный изолят. Каждый изолят или смесь сопровождается документом, который содержит сведения о лаборатории-отправителе (фамилия ответственного лица, адрес, телефон, электронный адрес), дате, месте и способе отбора пробы, культуре, на которой был выделен изолят, результаты предварительной идентификации, если проводилась.

--------------------------------

<44> Пункт 2450 СанПиН 3.3686-21.

7.8. Исследования проб из ООС методом ОТ-ПЦР в лабораториях, где отсутствуют условия для проведения вирусологических исследований (см. п. 7.4), проводят в течение 24 часов от момента обработки пробы в лаборатории.

7.9. При получении положительного результата исследования методом ОТ-ПЦР учреждения, указанные в п. 7.4, направляют материал на дальнейшие исследования в зависимости от полученного результата:

7.9.1. При обнаружении РНК полиовирусов или энтеровирусов группы C независимо от значения Ct концентраты проб доставляют в течение 72 часов от момента получения результата в Региональный центр по эпидемиологическому надзору за полиомиелитом и ОВП (далее - РЦ ПОЛИО/ОВП), за которым закреплен субъект Российской Федерации, с предварительным уведомлением <45>.

--------------------------------

<45> Пункт 2456 СанПиН 3.3686-21.

7.9.2. При обнаружении РНК энтеровирусов, не относящихся к группе C или полиовирусам, материал может быть направлен на идентификацию методом молекулярного типирования в референс-центр по мониторингу за энтеровирусными инфекциями, на базе ФБУН ННИИЭМ им. академика И.Н. Блохиной Роспотребнадзора (далее - референс-центр по мониторингу за энтеровирусными инфекциями), Дальневосточный региональный научно-методический центр по изучению энтеровирусных инфекций, на базе ФБУН Хабаровский НИИ эпидемиологии и микробиологии Роспотребнадзора или Урало-Сибирский региональный научно-методический центр по изучению энтеровирусных инфекций, на базе ФБУН ФНИИВИ "Виром" Роспотребнадзора <46> (далее - Дальневосточный или Урало-Сибирский региональные научно-методические центры по изучению энтеровирусных инфекций) по предварительному согласованию (сроки, количество, вид направляемого материала и значение Ct).

--------------------------------

<46> Приказ Роспотребнадзора от 01.12.2017 N 1116 "О совершенствовании системы мониторинга, лабораторной диагностики инфекционных и паразитарных болезней и индикации ПБА в Российской Федерации" (далее - приказ Роспотребнадзора от 01.12.2017 N 1116); приказ Роспотребнадзора от 19.12.2016 N 1236 "О совершенствовании эпидемиологического надзора за ЭВИ" (далее - приказ Роспотребнадзора от 19.12.2016 N 1236).

7.10. Для любых проб из ООС, исследованных методом ОТ-ПЦР, в сопровождающем документе указывают дату проведения исследования, наименование использованных тест-систем, значение Ct для каждой использованной тест-системы, место отбора, дату и время отбора (при одномоментном методе отбора проб) или дату и время установки сорбента, дату и время снятия сорбента (при адсорбционном методе отбора проб).

7.11. РЦ ПОЛИО/ОВП при получении из закрепленного субъекта Российской Федерации материала из ООС, в котором обнаружена РНК полиовирусов или энтеровирусов группы C, проводят вирусологическое исследование (приложение 3 к настоящим МУК). При выделении изолята полиовируса, в том числе в виде смеси с НПЭВ, целесообразно доставлять его в течение 72 часов в НЛДП с предварительным уведомлением. При выделении смеси полиовирусов и НПЭВ в НЛДП направляют неразделенный изолят. Каждый изолят сопровождается документом, оформленным в соответствии с п. 7.7.

7.12. Все материалы независимо от метода исследования при получении положительного результата хранят в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями <47> до получения окончательного результата из лаборатории, проводящей идентификацию (для полиовирусов - из НЛДП, для НПЭВ - из референс-центра по мониторингу за энтеровирусными инфекциями, Дальневосточного или Урало-Сибирского региональных научно-методических центров по изучению энтеровирусных инфекций) и после получения окончательного результата обеззараживают в автоклаве и утилизируют в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями <48>, а также методическими документами <49>, за исключением специальных распоряжений по хранению.

--------------------------------

<47> Пункт 2556 СанПиН 3.3686-21.

<48> Глава IV, таблица 7 приложения 2 СанПиН 3.3686-21.

<49> МУ-287-113.

7.12.1. При получении результата внутритиповой дифференциации (далее - ВТД), указывающего на содержание в пробе ДПВ, ПВВП любого типа, ПВ типа 2, все материалы (исходная проба, изолят) по согласованию с НЛДП обеззараживаются и утилизируются в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями <50>, а также методическими документами <51> или передаются в НЛДП, материалы целесообразно обеззараживать, утилизировать или направлять в НЛДП в течение 72 часов с момента получения результата ВТД.

--------------------------------

<50> Глава IV, таблица 7 приложения 2 СанПиН 3.3686-21.

<51> МУ-287-113.

7.13. НЛДП, РЦ ПОЛИО/ОВП, референс-центр по мониторингу за энтеровирусными инфекциями, Дальневосточный или Урало-Сибирский региональные научно-методические центры по изучению энтеровирусных инфекций передают результаты исследований в учреждения, обеспечивающие деятельность территориальных органов, осуществляющих федеральный государственный санитарно-эпидемиологический контроль (надзор), которые направляли материал. Результаты исследований рекомендуется направлять в течение 24 часов с момента их получения.

7.14. При получении результатов ВТД, указывающих на принадлежность полиовируса к ДПВ, ПВВП любых типов, ПВ типа 2, в том числе в виде смеси с вакцинными полиовирусами 1 и (или) 3 типов, и (или) НПЭВ:

- НЛДП сообщает об этом в Координационный центр профилактики полиомиелита и энтеровирусной (неполио) инфекции и РЦ ПОЛИО/ОВП;

- учреждение, проводившее первоначальные исследования, сообщает об этом в территориальный орган, осуществляющий федеральный государственный санитарно-эпидемиологический контроль (надзор).

8.1. Идентификацию выделенных L20B+ изолятов (определение их принадлежности к полиовирусам или НПЭВ) и ВТД полиовирусов проводит НЛДП методом ОТ-ПЦР.

8.2. Для идентификации изолятов полиовирусов могут быть использованы тест-системы для проведения исследований методом ОТ-ПЦР, зарегистрированные и разрешенные к применению в Российской Федерации в установленном порядке <52>.

--------------------------------

<52> Часть 4 статьи 38 Федерального закона от 21.11.2011 N 323-ФЗ; постановление Правительства Российской Федерации от 27.12.2012 N 1416.

8.3. ВТД полиовирусов проводится в течение 5 дней от момента получения изолята.

8.4. В случае получения результатов ВТД, указывающих на принадлежность полиовируса к ДПВ, ПВВП любых типов, ПВ типа 2, в том числе в виде смеси с вакцинными полиовирусами 1 и (или) 3 типов, и (или) НПЭВ, НЛДП в течение 7 дней от момента получения результатов проводит секвенирование участка генома белка VP1 изолята полиовируса.

8.5. Идентификация изолятов НПЭВ (установление типа) может быть выполнена с помощью молекулярно-генетического или серологического метода (в реакции нейтрализации на культуре клеток микрометодом).

8.5.1. Метод молекулярного типирования применяют в соответствии с методическими документами <53>. Изоляты НПЭВ могут быть направлены на идентификацию методом молекулярного типирования в референс-центр по мониторингу за энтеровирусными инфекциями, Дальневосточный или Урало-Сибирским региональные научно-методические центры по изучению энтеровирусных инфекций по предварительному согласованию <54> (сроки, количество, вид направляемого материала).

--------------------------------

<53> МР 4.2.0327-23 "Молекулярное типирование энтеровирусов", утвержденные руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 06.06.2023; пункт 3.1 приложения 3 МУ 3.1.1.4015-24 "Эпидемиологический надзор за энтеровирусной (неполио) инфекцией", утвержденных руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 18.03.2024.

<54> Пункт 2.2 приказа Роспотребнадзора от 01.12.2017 N 1116.

8.5.2. Для серологического метода используются иммунные к НПЭВ сыворотки, зарегистрированные и разрешенные к применению в Российской Федерации в установленном порядке <55>. Подготовку рабочих разведений сывороток, проведение теста микронейтрализации, интерпретацию результатов проводят в соответствии с инструкцией производителя. Типирование НПЭВ проводят на той культуре, на которой он был выделен.

--------------------------------

<55> Часть 4 статьи 38 Федерального закона от 21.11.2011 N 323-ФЗ; постановление Правительства Российской Федерации от 27.12.2012 N 1416

9.1. Мероприятия по обеспечению биологической безопасности при проведении исследований проб из ООС на полиовирусы организуются в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями <56>, а также методическими документами <57>.

--------------------------------

<56> Глава IV, пункты 2545 - 2571, приложения 2, 3 СанПиН 3.3686-21.

<57> МУ-287-113.

9.2. К работе допускаются сотрудники, имеющие защитные титры вируснейтрализующих антител к полиовирусам. Иммунизация лиц, работающих с материалом, инфицированным или потенциально инфицированным ДПВ, ПВВП любого типа, ПВ типа 2, проводится в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями <58>.

--------------------------------

<58> Пункты 2499, 2500 СанПиН 3.3686-21.

9.3. Все используемое лабораторное оборудование должно иметь инструкции по эксплуатации. Учтенные экземпляры инструкций хранятся раздельно в специальных местах в помещении "чистой зоны". Допустимо использование инструкций на бумажных и (или) электронных носителях.

9.4. Контейнеры из-под первичного материала, использованная одноразовая посуда, наконечники микропипеток, микротитровальные планшеты, пипетки и прочие расходные материалы во время проведения работ собирают в емкости, предназначенные для сбора отходов класса Б. После окончания работ - обеззараживают в автоклаве и утилизируют в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями <59>, а также методическими документами <60>. Стеклянную посуду обеззараживают дезинфицирующими средствами с вирулицидной активностью в отношении полиовирусов <61>, зарегистрированными и разрешенными к применению в Российской Федерации в установленном порядке <62>.

--------------------------------

<59> Глава IV, таблица 7 приложения 2 СанПиН 3.3686-21.

<60> МУ-287-113.

<61> Приложение 2 СанПиН 3.3686-21.

<62> Раздел II Единого перечня продукции (товаров), подлежащей государственному санитарно-эпидемиологическому надзору (контролю) на таможенной границе и таможенной территории Евразийского экономического союза, утвержденного решением Комиссии Таможенного союза от 28.05.2010 N 299, с изменениями, внесенными решениями Комиссии Таможенного союза от 17.08.2010 N 341, от 20.09.2010 N 383, от 14.10.2010 N 432, от 18.11.2010 N 456, от 02.03.2011 N 566, от 18.10.2011 N 828, от 09.12.2011 N 859, решениями Совета Евразийской экономической комиссии от 15.06.2012 N 36, от 24.08.2012 N 73, от 17.12.2012 N 115, от 18.09.2014 N 78, от 02.12.2015 N 82, от 14.06.2018 N 64, от 22.02.2019 N 8, от 09.09.2019 N 97, от 04.09.2020 N 65, от 29.10.2021 N 109, от 18.02.2022 N 15, от 17.03.2022 N 28, от 25.01.2023 N 6, от 14.05.2024 N 51.

9.5. Обеззараживание рабочих поверхностей, оборудования проводят дезинфицирующими средствами с вирулицидной активностью в отношении полиовирусов и последующей обработкой ультрафиолетом в соответствии с методическими документами <63>.

--------------------------------

<63> Р 3.5.1.4025-24 "Использование ультрафиолетового бактерицидного излучения для обеззараживания воздуха в помещениях", утвержденное руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 31.05.2024.

9.6. Для снижения риска распространения ДПВ, ПВВП любого типа, ПВ типа 2 соблюдают следующие правила:

- использование ДПВ, ПВВП любого типа, ПВ типа 2 прекращается во всех случаях, где ту же задачу можно выполнить при помощи аттенуированных вакцинных штаммов типа 1 и 3, инактивированных антигенов или НПЭВ;

- во всех случаях, когда отсутствует необходимость хранения полиовирусов, все запасы вирусов и потенциально инфицированных ими материалов обеззараживают в автоклаве и утилизируют в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями <64>, а также методическими документами <65>.

--------------------------------

<64> Глава IV, таблица 7 приложения 2 СанПиН 3.3686-21.

<65> МУ-287-113.

9.7. При приготовлении и титровании референс-штаммов полиовирусов (вакцинных штаммов Сэбина) (далее - референс-штаммы) (см. приложение 4 к настоящим МУК) одновременно работают только с вирусом одного типа. Оптимальным является работа с вирусом каждого типа в отдельные дни.

1.1. Объем осветленной центрифугированием сточной воды смешивают с выбранными объемами двух полимеров - декстрана и полиэтиленгликоля (далее - ПЭГ). Гомогенную смесь этих ингредиентов, полученную путем энергичного встряхивания, оставляют на ночь при температуре плюс 4 °C в делительной воронке. Это позволяет полимерам разделиться и сформировать в воронке два отчетливых слоя (две фазы). Энтеровирусы накапливаются в меньшем нижнем слое или на границе двух фаз (интерфаза). Нижний слой и интерфазу собирают капельным способом. Осадок, полученный после первоначального центрифугирования, вносят в этот концентрат, взвесь обрабатывают хлороформом и подвергают исследованию. Таким образом проба концентрируется в 50 - 100 раз.

1.2. Подготовка реактивов (для двух проб по 1,0 л):

- 22% декстран (по весу) - 40 г декстрана T40, 142 мл стерильной дистиллированной воды. Для растворения используют магнитную мешалку. Готовый раствор можно хранить 2 недели при температуре плюс 4 °C.

- 29% ПЭГ 6000 (по весу) - 363 г ПЭГ 6000 и 888 мл стерильной дистиллированной воды. Для растворения используют магнитную мешалку. Готовый раствор можно хранить 2 недели при температуре плюс 4 °C. Раствор можно автоклавировать (15 минут при температуре 45 °C).

150 мл (примерно) 5M NaCl.

1N <66> NaOH и 1N HCl для установки pH.

--------------------------------

<66> Примечание: N - нормальный.

1.3. Концентрирование пробы (0,5 л):

Жидкость пробы центрифугируют в течение 10 минут при 1000 g (если это необходимо, пробу делят на несколько порций), надосадочную жидкость переносят из пробирок в колбу Эрленмейера емкостью 1,0 л. Осадок хранят при температуре плюс 4 °C.

Перерасчет ускорения свободного падения (g) в число об/мин проводят по формуле (1):

где: g - ускорение свободного падения;

R - радиус в мм ротора центрифуги (от его оси до конца пробирки), мм;

N - скорость, об/мин.

Доводят pH надосадочной жидкости до нейтрального уровня (7,0 - 7,5). Для этого по каплям вводят 1N раствора NaOH. Измеряют конечный объем надосадочной жидкости.

К 500 мл надосадочной жидкости добавляют 39,5 мл 22% раствора декстрана, 287 мл 29% раствора ПЭГ 6000 и 35 мл 5 N раствора NaCl. Тщательно перемешивают и выдерживают 1 час при температуре плюс 4 °C, используя прибор горизонтального встряхивания или магнитную мешалку.

Для каждой пробы подготавливают стерильную коническую делительную воронку и закрепляют ее в штативе. Смазывают скользящие поверхности кранов так, чтобы не закрыть в них отверстие. Проверяют плотность кранов небольшим количеством воды. Приготовленную смесь переливают в воронку и оставляют на ночь при температуре плюс 4 °C.

На следующее утро осторожно открывают кран воронки, медленно выпускают жидкость и собирают в стерильную пробирку ее нижний слой и промежуточную фазу (5 - 10 мл от каждой пробы объемом 0,5 л).

К жидкости, собранной в пробирке добавляют осадок, хлороформ (20% от объема образовавшейся взвеси), встряхивают в течение 1 минуты. Центрифугируют 20 минут при 1500 g, отбирают водную фазу в стерильную пробирку и добавляют антибиотики (пенициллин и стрептомицин до конечной концентрации 100 МЕ/мл и 100 мг/мл, соответственно) <67>. Перерасчет ускорения свободного падения (g) в число об/мин проводят по формуле (1).

--------------------------------

<67> Примечание: одну часть полученного концентрата (1 мл) хранят при температуре не выше минус 20 °C (или при температуре не выше минус 70 °C, если есть возможность) для повторного исследования при необходимости. Вторую часть концентрата используют для проведения исследований.

Одну часть полученного концентрата (1 мл) хранят при температуре не выше минус 20 °C (или при температуре не выше минус 70 °C, если есть возможность) для повторного исследования при необходимости. Вторую часть концентрата используют для проведения исследований.

--------------------------------

<68> ВОЗ. Руководство по исследованиям объектов окружающей среды на полиовирусы, 2015 (англ. Guidelines on environmental surveillance for detection of poliovirus, 2015 - polioeradication.org/tools-and-library/policy-reports/gpln-publications (в свободном доступе).

2.1. Для фильтрования используют приборы напорного, вакуумного фильтрования.

Для фильтрования всех видов воды с малым количеством взвешенных частиц используют только микропористые мембраны с диаметром пор не более 0,2 мкм для осаждения вирусных частиц.

При фильтровании сточной или речной воды для освобождения от большого количества взвешенных частиц, затрудняющих фильтрацию, применяют дисковый предфильтр, который накладывают на селективную мембрану. Элюцию вирусных частиц проводят с селективной мембраны. Если использовался предфильтр, его сбрасывают в дезинфицирующий раствор или автоклавируют.

После окончания фильтрации мембрану разрезают стерильными (фламбированными) ножницами на тонкие полоски, помещают в стерильный флакон (50 - 100 мл с широким горлышком) и добавляют 10 мл <69> элюента. В качестве элюента используют 0,9% раствор NaCl. Флакон с элюентом с плотно закрытой крышкой тщательно встряхивают в течение 10 минут с помощью шейкера.

--------------------------------

<69> Приложение 2 МУ 1.3.2569-09.

Далее смыв с поверхности фильтра переносят в стерильные пробирки:

- для исследования вирусологическим методом 8 - 9 мл элюата отбирают в стерильную пробирку, добавляют стерильной пипеткой 1 мл хлороформа. Интенсивно встряхивают пробирку в течение 20 минут с помощью шейкера, затем центрифугируют 20 минут при температуре плюс 4 °C при 1500 g <70>. Перерасчет ускорения свободного падения (g) в число об/мин проводят по формуле (1);

--------------------------------

<70> Примечание: после центрифугирования надосадочную жидкость отбирают стерильной пипеткой, не захватывая хлороформ. Одну часть полученного концентрата (1 мл) хранят при температуре не выше минус 20 °C (или при температуре не выше минус 70 °C, если есть возможность) для повторного исследования при необходимости. Вторую часть концентрата используют для заражения культур клеток.

- для исследования методом ОТ-ПЦР отбирают 1 мл элюата в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл и центрифугируют при 10000 g в течение 10 минут. Перерасчет ускорения свободного падения (g) в число об/мин проводят по формуле (1).

1.1. Для выделения полиовирусов из проб используют перевиваемые линии культур клеток RD и L20B. Использование комбинации этих двух клеточных линий обеспечивает высокую чувствительность и специфичность выявления полиовирусов. Схема выделения вирусов на культурах клеток представлена на рис. 1. Поддержание клеточных культур выполняют в соответствии с руководством по лабораторным исследованиям <71>.

--------------------------------

<71> ВОЗ. Руководство по лабораторным исследованиям на полиовирусы, 2004.

1.2. RD - клетки рабдомиосаркомы человека чувствительные к полиовирусам, вирусам группы ECHO, некоторым вирусам группы Коксаки A (CVA), за исключением CVA1, CVA19, CVA22, энтеровирусам EV-A71, EV-D68. Вирусы группы Коксаки B могут проявлять цитопатический эффект (далее - ЦПЭ) на клетках RD.

1.3. L20B - линия мышиных клеток (L-клеток), способная экспрессировать рецептор полиовируса. Клетки L20B избирательно чувствительны к полиовирусам, которые вызывают в них характерный ЦПЭ. Ряд вирусов, не относящихся к энтеровирусам (аденовирусы, реовирусы), могут вызывать ЦПЭ в клетках L20B. Но вызываемый ЦПЭ отличается от ЦПЭ, свойственного полиовирусам.

1.4. Использование культуры клеток HEp-2 (Cincinnati), чувствительной к полиовирусам и вирусам Коксаки B, является факультативным.

1.5. НЛДП получает культуры клеток по запросу из лабораторий Глобальной лабораторной сети по полиомиелиту ВОЗ, РЦ ПОЛИО/ОВП - из НЛДП, учреждения, обеспечивающие деятельность территориальных органов, осуществляющих федеральный государственный санитарно-эпидемиологический контроль (надзор) - в РЦ ПОЛИО/ОВП, за которым они закреплены.

1.6. После получения клеточного материала РЦ ПОЛИО/ОВП создают банк клеток. Лаборатории учреждений, обеспечивающих деятельность органов, осуществляющих федеральный государственный санитарно-эпидемиологический контроль (надзор), закрепленные за РЦ ПОЛИО/ОВП, создают банк клеток при наличии возможностей. Запас каждой линии культуры клеток составляет не менее 12 ампул, которые используются по мере необходимости для создания рабочей линии клеток.

1.7. Для сохранения чистоты, аутентичности и стабильности клеточных культур следует заменять рабочую линию после 3-х месяцев или 15 пассажей культивирования в лаборатории.

1.8. Все действия с культурами клеток фиксируют в рабочих записях обозначая тип клеток, номер пассажа, дату получения, дату посева и все смены среды, наименования использованных реактивов, их серии и сроки годности.

1.9. Все работы с неинокулированными культурами клеток проводятся в БМБ 2 класса в отдельном боксированном помещении, расположенном в "заразной зоне" лаборатории.

1.10. Для предотвращения перекрестной контаминации между различными типами клеточных культур не допускается проводить работу с несколькими культурами клеток одновременно.

1.11. Все неинокулированные культуры клеток следует считать потенциально опасными, поэтому после окончания работы все культуральные жидкости и культуры обеззараживают в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями <72>, а также методическими документами <73>.

--------------------------------

<72> Глава IV, таблица 7 приложения 2 СанПиН 3.3686-21.

<73> МУ-287-113.

1.12. Для контроля чувствительности культур клеток к полиовирусам проводят ежеквартальное титрование референс-штаммов каждого типа на каждой культуре клеток после 8 - 10 пассажей (приложение 4 к настоящим МУК).

1.12.1. Если титр не отличается от установленного ранее или отличается в пределах +/- 0,5 lg, чувствительность клеток не изменилась.

1.12.2. Превышение ожидаемого значения на 0,5 lg или более может быть связано с погрешностями в приготовлении разведений вируса.

1.12.3. Снижение титра по сравнению с ожидаемым на 0,5 lg или более может указывать на снижение чувствительности клеток. В этом случае выполняют титрование новой порции референс-штамма. Одновременно проверяют возможные изменения в условиях культивирования клеток. Если низкий титр воспроизводится при титровании новой порции, а изменений в условиях культивирования клеток не выявлено, используемые клетки необходимо заменить из клеточного банка лаборатории или получить по запросу в НЛДП или РЦ ПОЛИО/ОВП.

1.13. Инокулирование культур клеток проводят в день обработки пробы или в течение 24 часа после завершения обработки.

1.14. Для исследования одного элюата используют по 1 флакону (50,0 мл, 25 см² клеточной поверхности в каждом) каждой культуры или по 2 пробирки на один пассаж. Оптимально использовать для заражения одной пробы 5 флаконов с культурой клеток L20B и 1 флакон с культурой клеток RD. Такой подход увеличивает вероятность выделения вирусов.

1.15. Использование микропланшетов для выделения вирусов не допускается.

1.16. После замены ростовой среды на 7,5 мл поддерживающей среды в каждый флакон вносят 0,5 мл обработанной пробы. Все использованные клеточные культуры следует инокулировать одновременно. Оставляют по одному незараженному контрольному флакону каждой культуры. Флаконы инкубируют в термостате при температуре плюс 36 °C. Ежедневно, обычно в течение 5 - 7 дней, проверяют культуры на наличие ЦПЭ. Все признаки ЦПЭ, токсичности, контаминации посторонними микроорганизмами регистрируют в рабочих записях. При появлении ЦПЭ (при охвате изменениями не менее 75% клеточного монослоя) прекращают инкубацию флаконов и сохраняют культуральную жидкость при температуре не выше минус 20 °C для следующего пассажа на той же культуре клеток. Содержимое каждого флакона с культурой клеток пассируют индивидуально, флаконы не объединяют. Для пассажа могут быть использованы культуры, выращенные в пробирках. Если при первичном заражении не наблюдали ЦПЭ, то делают так называемый "слепой" пассаж в той же культуре клеток. При отсутствии ЦПЭ в течение 5 - 7 дней культуры отбрасываются как негативные.

1.17. При наличии ЦПЭ в клетках L20B пробу следует считать содержащей полиовирусы. В случае обнаружения признаков ЦПЭ в клетках RD необходимо провести последовательный пассаж в клетках L20B. В случае получения признаков характерного ЦПЭ в клетках L20B считают пробу предположительно содержащей полиовирусы.

1.18. Изоляты, которые проявили ЦПЭ на культуре клеток RD, но без признаков ЦПЭ при пассаже с RD на L20B, следует считать содержащими НПЭВ.

1.19. При хорошем состоянии культуры клеток первичное заражение и один пассаж вместе составляют период наблюдения 10 дней. В ряде случаев (например, при выделении агента с низкой цитопатогенной активностью или при наличии в пробе вируса в небольшом количестве) необходимо сделать последующие пассажи. При этом следует помнить, что каждый последующий пассаж увеличивает риск перекрестной контаминации.

1.20. Если при первичном заражении в культуре клеток развивается быстрая (в течение 1 - 2 дней после внесения исследуемого субстрата) дегенерация клеток, то, скорее всего это связано с неспецифической токсичностью пробы. Такие культуры замораживают при температуре не выше минус 20 °C, оттаивают и выполняют пассаж. Если признаки токсичности обнаружатся вновь, то возвращаются к исходной пробе, разводят ее фосфатно-солевым буфером (далее - ФСБ) 1:10 и повторяют заражение. В случае бактериальной контаминации возвращаются к исходной пробе, обрабатывают ее хлороформом и повторяют процедуры заражения.

1.21. Для предупреждения перекрестной контаминации во время процедур заражения и пассирования не допускается сливать среду через край флакона или пробирки, в которые вносилась исследуемая проба, даже если ЦПЭ отсутствует. Удаление среды производят пипеткой, которую меняют после каждой процедуры.

1.22. При заражении с помощью автоматических микропипеток используют только наконечники с фильтрами. Необходимо избегать процедур, при которых образуются аэрозоли (например, энергичное пипетирование). Используют посуду с завинчивающимися крышками.

1.23. Применение метода адсорбции исследуемого материала на культуре клеток может способствовать выявлению вируса при его незначительных количествах в исследуемом материале, а также ускорить проявление ЦПЭ. При использовании этого метода в результате дополнительных открываний крышек возрастает вероятность перекрестной вирусной или бактериальной контаминации.

1.24. При использовании метода адсорбции из флакона и (или) пробирки удаляют ростовую среду, ополаскивают монослой стерильным ФСБ или культуральной средой, вносят исследуемую пробу и инкубируют флакон при температуре плюс 36 °C в течение 1 часа. Таким образом, создаются лучшие условия для адсорбции вируса клетками, если он присутствует в пробе. После истечения срока инкубации в каждый флакон и (или) пробирку вносят необходимое количество поддерживающей среды.

--------------------------------

<74> ВОЗ. Руководство по лабораторным исследованиям на полиовирусы, 2004.

1.1. Готовят флакон площадью 25 см² с культурой клеток HEp-2 (Cincinnati), сформировавшей сливной здоровый монослой в течение 2 - 3 дней. Маркируют флакон, указывая вид культуры, дату инокуляции, лабораторный номер референс-штамма.

1.2. Сливают ростовую среду и ополаскивают клеточный слой ФСБ.

1.3. Вносят во флакон 0,2 мл вируссодержащей жидкости из пробирки с прототипным референс-штаммом, полученным в НЛДП. Оставшееся количество прототипного референс-штамма хранят при температуре не выше минус 20 °C.

1.4. Инкубируют культуру при температуре плюс 36 °C в течение 1 часа, периодически осторожно покачивая флакон для лучшей адсорбции вируса.

1.5. Добавляют поддерживающую среду (около 10 мл), содержащую 5% сыворотки плодов коровы. Флакон помещают в термостат при температуре плюс 36 °C.

1.6. Культуру просматривают ежедневно. После распространения ЦПЭ на 75 - 100% клеточного монослоя, флакон трижды замораживают и оттаивают для разрушения клеток.

1.7. Содержимое флакона переносят в центрифужную пробирку, центрифугируют при 1500 g 20 минут. Перерасчет ускорения свободного падения (g) в число об/мин проводят по формуле (1). Надосадочную жидкость по 0,5 мл переносят в пробирки, предназначенные для хранения референс-штамма, с этикетками, на которых указывают тип клеток, вирусный штамм, дата приготовления. Приготовленные лабораторные референс-штаммы хранят при температуре не выше минус 20 °C.

1.8. Определяют титр референс-штамма (см. п.п. 2.1 - 2.7 приложения 4 к настоящему МУК).

1.9. Эти запасы вируса могут быть использованы для приготовления нужных объемов для проведения исследований, для проведения процедуры контроля чувствительности клеточных культур. Вирус на культуре HEp-2 пассируют не более 3-х раз.

--------------------------------

<75> ВОЗ. Руководство по лабораторным исследованиям на полиовирусы, 2004.

2.1. Готовят разведение 10^-1 исследуемого вируса: 0,1 мл вируса вносят в пробирку, содержащую 0,9 мл среды.

2.2. Готовят ряд последовательных разведений от 10^-2 до 10^-8. В маркированные соответствующим образом пробирки разливают по 9,0 мл среды, в первую вносят 1,0 мл разведения 10^-1 исследуемого вируса. Новой пипеткой перемешивают содержимое пробирки, переносят 1,0 мл в следующую, меняют пипетку, вновь перемешивают и переносят 1,0 мл, и т.д.

2.3. Переносят по 100 мкл разведения вируса из пробирок в лунки рядов A - H колонок 1 - 10 панели для микротитрования (рис. 2а). Для получения статистически достоверных результатов определения титра референс-штамма используют разведения 10^-5 - 10^-8, каждое разведение вносят в 20 лунок.

2.4. Вносят по 100 мкл поддерживающей среды в лунки колонок A11 - H рядов 11 - 12 для контроля клеток.

2.5. Готовят суспензию клеток в концентрации клеток/1,0 мл, вносят по 100 мкл во все лунки панели. Заклеивают панель пленкой и помещают в термостат при температуре плюс 36 °C.

2.6. Ежедневно микроскопируют панель, наблюдая за появлением ЦПЭ, окончательно учитывают результаты на 5 - 7 день. Тест считают действительным при образовании в лунках контроля сплошного монослоя нормальных клеток.

2.7. Расчет титра вируса проводят по формуле Кербера (2):

где: L = log наименьшего разведения сыворотки в опыте;

d = разница между lg последовательных разведений;

S = сумма пропорций тест-объектов (лунок с культурой клеток), давших положительный результат (ЦПЭ) в каждом разведении.

В примере на рис. 2б титр вируса равен 10^6,6 ТЦД₅₀/0,1 мл, рассчитан по формуле (3):

1. При проведении лабораторных исследований материалов из объектов окружающей среды на полиовирусы и неполиоэнтеровирусы применяют средства измерений, вспомогательное и испытательное оборудование, расходные материалы и реактивы, приведенные в таблицах П1.1 - П1.2.

1. Федеральный закон от 30.03.1999 N 52-ФЗ "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения".

2. Федеральный закон от 21.11.2011 N 323-ФЗ "Об основах охраны здоровья граждан в Российской Федерации".

3. Постановление Правительства Российской Федерации от 27.12.2012 N 1416 "Об утверждении Правил государственной регистрации медицинских изделий".

4. Единый перечень продукции (товаров), подлежащей государственному санитарно-эпидемиологическому надзору (контролю) на таможенной границе и таможенной территории Евразийского экономического союза.

5. План действий по поддержанию свободного от полиомиелита статуса Российской Федерации на 2022 - 2024 гг.

6. СанПиН 3.3686-21 "Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней".

7. Приказ Роспотребнадзора от 01.12.2017 N 1116 "О совершенствовании системы мониторинга и лабораторной диагностики инфекционных и паразитарных болезней и индикации ПБА в Российской Федерации".

8. Приказ Роспотребнадзора от 19.12.2016 N 1236 "О совершенствовании эпидемиологического надзора за ЭВИ".

9. Приказ Минздрава России от 06.12.2021 N 1122н "Об утверждении национального календаря профилактических прививок, календаря профилактических прививок по эпидемическим показаниям и порядка проведения профилактических прививок".

10. Р 3.5.1.4025-24 "Использование ультрафиолетового бактерицидного излучения для обеззараживания воздуха в помещениях".

11. МУ 3.1.1.4015-24 "Эпидемиологический надзор за энтеровирусной (неполио) инфекцией".

12. МУ 1.3.2569-09 "Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащем микроорганизмы I - IV групп патогенности".

13. МУ-287-113 "Дезинфекция, предстерилизационная очистка и стерилизации изделий медицинского назначения".

14. МУК 4.2.2029-05 "Санитарно-вирусологический контроль водных объектов".

15. МР 4.2.0327-23 "Молекулярное типирование энтеровирусов".

1. Battistone A., Buttinelli G., Bonomo P., Fiore S., Amato C., Mercurio P., Cicala A., Simeoni J., Foppa A., Triassi M. et al. Detection of enteroviruses in influent and effluent flow samples from wastewater treatment plants in Italy. Food Environ. Virol. 2014, 6, 13 - 22.

2. Bisseux M., Debroas D., Mirand A., Archimbaud C., Peigue-Lafeuille H., Bailly J.-L. Henquell C. Monitoring of enterovirus diversity in wastewater by ultra-deep sequencing: An effective complementary tool for clinical enterovirus surveillance. Water Res. 2020, 169, 115246.

3. Ivanova O.E., Yarmolskaya M.S., Eremeeva T.P., Babkina G.M., Baykova O.Y., Akhmadishina L.V., Krasota A.Y., Kozlovskaya L.I., Lukashev A.N. Environmental Surveillance for Poliovirus and Other Enteroviruses: Long-Term Experience in Moscow, Russian Federation, 2004 - 2017. Viruses. 2019 May 8; 11(5).