"МУК 4.1.4012-24. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств бентазона в клубнях картофеля методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 19.02.2024)

1. Разработаны Обществом с ограниченной ответственностью "Центр экопестицидных исследований" (Р.А. Стрелецкий, В.С. Горбатов).

2. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 19 февраля 2024 г.

3. Введены впервые.

1.1. Настоящие методические указания (далее - МУК) описывают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (далее - ВЭЖХ) для определения остаточных количеств бентазона в клубнях картофеля в диапазоне 0,025 - 0,25 мг/кг.

1.2. МУК носят рекомендательный характер.

2.1. Бентазон - 3-изопропил-1H-2,1,3-бензотиадиазин-4(3H)-один2,2-диоксид <1>. Регистрационный номер CAS: 25057-89-0. Молекулярная масса 240,3.

--------------------------------

<1> В соответствии с классификацией Международного союза теоретической и прикладной химии (ИЮПАК) (англ. International Union of Pure and Applied Chemistry, IUPAC).

2.2. Физико-химические свойства бентазона.

Бесцветное кристаллическое вещество. Температура плавления: плюс 139,4 - 141 °C. Плотность при температуре плюс 20 °C - 1,41. Давление паров при температуре плюс 25 °C: 0,17 мПа. Растворимость в органических растворителях (г/дм, плюс 20 °C): ацетон - 1387, метанол - 1061, этилацетат - 582, дихлорметан - 206, н-гептан - 0,5·10. Растворимость в воде при плюс 20 °C - 570 мг/дм (pH 7). Растворимость в воде натриевой соли бентазона - 2,3·10 г/дм. Коэффициент распределения н-октанол/вода: 0,77 (pH 5), -0,46 (pH 7), -0,55 (pH 9). Устойчив к гидролизу в кислой и щелочной средах. Разрушается на свету, pКа 3,3 (плюс 24 °C).

2.3. Бентазон - пестицид, послевсходовый гербицид контактного действия.

3.1. При соблюдении условий проведения анализа <2> и методики, изложенной в настоящих МУК, погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 3.1 для соответствующих диапазонов концентраций.

--------------------------------

<2> ГОСТ Р ИСО 5725-1 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 1. Основные положения и определения", введенный в действие постановлением Госстандарта России от 23.04.2002 N 161-ст; ГОСТ Р ИСО 5725-2 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 2. Основной метод определения повторяемости и воспроизводимости стандартного метода измерений", введенный в действие постановлением Госстандарта России от 23.04.2002 N 161-ст; ГОСТ Р ИСО 5725-3 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 3. Промежуточные показатели прецизионности стандартного метода измерений", введенный в действие постановлением Госстандарта России от 23.04.2002 N 161-ст; ГОСТ Р ИСО 5725-4 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 4. Основные методы определения правильности стандартного метода измерений", введенный в действие постановлением Госстандарта России от 23.04.2002 N 161-ст; ГОСТ Р ИСО 5725-5 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 5. Альтернативные методы определения прецизионности стандартного метода измерений", введенный в действие постановлением Госстандарта России от 23.04.2002 N 161-ст; ГОСТ Р ИСО 5725-6 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике", введенный в действие постановлением Госстандарта России от 23.04.2002 N 161-ст (далее ГОСТ Р ИСО 5725-(1 - 6)).

4.1. Метод основан на определении бентазона с помощью ВЭЖХ с использованием ультрафиолетового (далее - УФ) детектора.

4.2. Определение бентазона в клубнях картофеля проводится после его экстракции ацетонитрилом, очистки и концентрирования в системе несмешивающихся растворителей и на колонках с силикагелем.

4.3. Идентификация бентазона проводится по времени удерживания. Концентрацию бентазона определяют по площадям соответствующих хроматографических пиков на хроматограммах по методу абсолютной калибровки.

В предлагаемых условиях анализа метод специфичен. Специфичность обеспечивается подбором колонки и условий хроматографирования.

4.4. Нижний предел измерения бентазона в анализируемом объеме пробы - 5 нг. Количественное определение проводится методом ВЭЖХ с УФ-детектированием.

5.1. При выполнении измерений и подготовке проб применяют средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы, приведенные в табл. 5.1 - 5.3.

6.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами в соответствии с ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками в соответствии с ГОСТ Р 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на комплекс жидкостного хроматографа.

6.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Организуется обучение работников безопасности труда.

6.3. Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист, имеющий опыт работы на жидкостном хроматографе с УФ-детектором, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений.

7.1. При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха плюс 15 - 30 °C, относительной влажности не более 80% и нормальном атмосферном давлении;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе с УФ-детектором проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

8.1. Выполнению измерений предшествуют следующие операции: очистка растворителей (при необходимости), приготовление растворов, кондиционирование хроматографической колонки, установление градуировочных характеристик.

8.2. Подготовка органических растворителей.

При использовании растворителей необходимой чистоты не возникает необходимости в дополнительной очистке.

8.3. Приготовление растворов для проведения анализа.

8.3.1. Приготовление рабочих растворов.

8.3.1.1. Приготовление 0,25 М раствора калия фосфорнокислого двузамещенного.

В мерную колбу объемом 1 дм³ помещают 57,05 грамма фосфата калия двузамещенного 3-водного, приливают 500 см³ дистиллированной воды, перемешивают до полного растворения и доводят до метки водой. При помощи pH-метра (иономера) проверяется pH приготовленного раствора (доводится до 9 единиц). Раствор хранится не более месяца в таре, исключающей испарение при комнатной температуре.

8.3.1.2. Приготовление смеси гексана и этилацетата (1:1).

В мерную колбу объемом 1 дм³ помещают 500 см³ этилацетата и доводят до метки гексаном. Раствор хранится не более месяца в таре, исключающей испарение при комнатной температуре.

8.3.1.3. Приготовление смеси гексана и этилацетата (2:8).

В мерную колбу объемом 1 дм³ помещают 200 см³ этилацетата и доводят до метки гексаном. Раствор хранится не более месяца в таре, исключающей испарение при комнатной температуре.

8.3.2. Приготовление градуировочных растворов.

8.3.2.1. Стандартный раствор N 1 с концентрацией бентазона 1,0 мг/см³.

Взвешивают 10 мг бентазона в мерной колбе объемом 10 см³. Навеску растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом. Полученный стандартный раствор N 1 используется для приготовления стандартного раствора N 2. Стандартный раствор N 1 хранится в холодильнике в течение 3 месяцев.

8.3.2.2. Промежуточный раствор N 2 с концентрацией бентазона 10,0 мкг/см³.

Из стандартного раствора N 1 отбирают пипеткой 1 см³ и помещают в мерную колбу объемом 100 см³. Доводят объем до метки ацетонитрилом при перемешивании. Промежуточный раствор N 2 используется для хроматографического исследования и установления градуировочной характеристики. Промежуточный раствор N 2 хранят в холодильнике в течение 30 суток.

8.3.2.3. Стандартный раствор N 3 с концентрацией бентазона 2,5 мкг/см³.

Из стандартного раствора N 2 отбирают пипеткой 2,5 см³, помещают в мерную колбу объемом 10 см³ и доводят объем до метки ацетонитрилом. Стандартный раствор N 3 используется для установления градуировочной характеристики и готовится непосредственно перед использованием.

8.3.2.4. Стандартный раствор N 4 с концентрацией бентазона 1,0 мкг/см³.

Из стандартного раствора N 2 отбирают пипеткой 1 см³, помещают в мерную колбу объемом 10 см³ и доводят объем до метки ацетонитрилом. Стандартный раствор N 4 используется для установления градуировочной характеристики и готовится непосредственно перед использованием.

8.3.2.5. Стандартный раствор N 5 с концентрацией бентазона 0,5 мкг/см³.

Из стандартного раствора N 4 отбирают пипеткой 5 см³, помещают в мерную колбу объемом 10 см³ и доводят объем до метки ацетонитрилом. Стандартный раствор N 5 используется для установления градуировочной характеристики и готовится непосредственно перед использованием.

8.3.3.6. Стандартный раствор N 6 с концентрацией бентазона 0,25 мкг/см³.

Из стандартного раствора N 5 отбирают пипеткой 5 см³, помещают в мерную колбу объемом 10 см³ и доводят объем до метки ацетонитрилом. Стандартный раствор N 6 используется для установления градуировочной характеристики и готовится непосредственно перед использованием.

8.4. Приготовление элюентов для ВЭЖХ.

8.4.1. Приготовление 0,1% раствора уксусной кислоты в воде (Элюент А).

В мерную колбу объемом 1 дм³ помещают 500 см³ деонизированной воды, добавляют 1 см³ уксусной кислоты, перемешивают и доводят до метки деионизированной водой.

8.4.2. Приготовление 0,1% раствора уксусной кислоты в ацетонитриле (Элюент Б).

В мерную колбу объемом 1 дм³ помещают 500 см³ ацетонитрила (ВЭЖХ), добавляют 1 см³ уксусной кислоты, перемешивают и доводят ацетонитрилом до метки.

8.5. Установление градуировочной характеристики.

Градуировочную характеристику, выражающую отношение поглощения при длине волны 230 нм от концентрации бентазона в растворе (мкг/см³), устанавливают путем определения соотношения площади пиков, отвечающих идентифицируемому компоненту, и концентрации аналитического стандарта по 4-м растворам для установления градуировочной характеристики.

Градуировочную зависимость для определения бентазона в клубнях картофеля устанавливают по 4 растворам для градуировки с концентрацией 0,25; 0,5; 1,0 и 2,5 мкг/см³, приготовленным согласно п.п. 9.2.2.3 - 9.2.2.6.

В инжектор хроматографа вводят по 20 мм³ каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по пункту 10.5. Осуществляют не менее 5 параллельных измерений.

8.6. Подготовка концентрирующих силикагеля для очистки экстрактов и проверка хроматографического поведения бентазона на них.

8.6.1. Подготовка силикагеля для очистки экстракта.

Скорость потока растворов через сорбент не может превышать 2 капли/сек.

Силикагель в количестве 5 г вносится в 30 см³ смеси гексан:этилацетат (1:1) в стеклянную колонку с внутренним диаметром 1 см и длиной 25 см, на дно которой помещена вата.

Кондиционирование: колонку промывают 20 см³ смеси гексана и этилацетата 2:8 (см. п. 8.3.1.2), затем 20 см³ смеси гексана и этилацетата 1:1 (см. п. 8.3.1.3). Элюаты отбрасывают.

Не допускают высыхания поверхности сорбента.

8.6.2. Проверка хроматографического поведения бентазона на силикагеле.

В концентратор объемом 50 см³ вносят 1 см³ стандартного раствора бентазона в ацетонитриле с концентрацией 1,0 мкг/см³ и упаривают его досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C.

В концентратор помещают 10 см³ смеси гексана и этилацетата 1:1 (см. п. 8.3.1.2), обрабатывают концентратор 30 сек в ультразвуковой ванне и вносят раствор на подготовленный сорбент. Элюат собирают порциями по 2 см³ в отдельные концентраторы объемом 50 см³ и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C. Сорбент не обсушивают.

Далее на сорбент наносят 25 см³ смеси гексана и этилацетата 1:1 (см. п. 8.3.1.2) и собирают элюат порциями по 5 см³ в отдельные концентраторы объемом 50 см³ и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C.

Бентазон смывают 40 см³ смеси гексана и этилацетата 2:8 (см. п. 8.3.1.3) и собирают элюат порциями по 5 см³ в отдельные концентраторы объемом 50 см³ и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C. Сухой остаток каждой фракции растворяют в 1 см³ ацетонитрила для ВЭЖХ, обрабатывая колбы в ультразвуковой ванне в течение 30 сек и хроматографируют.

Определяют фракции, содержащие бентазон, полноту смывания с сорбента и необходимый объем элюента.

Изучение поведения бентазона на силикагеле проводят каждый раз при отработке методики или поступлении новой партии сорбента.

8.7. Подготовка и кондиционирование колонки для жидкостной хроматографии.

Хроматографическую колонку с предколонкой устанавливают в термостате хроматографа и стабилизируют при температуре плюс 25 °C 3 - 4 ч.

8.8. Контроль стабильности градуировочной характеристики.

Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят в начале каждой серии измерений, анализируя один из градуировочных растворов не менее 2 раз.

Градуировочная характеристика считается стабильной, если для каждого из используемого для контроля градуировочного раствора сохраняется соотношение (1):

где: X - концентрация бентазона контрольного измерения, мкг/см³;

C - известная концентрация градуировочного раствора бентазона в ацетонитриле, взятая для контроля стабильности градуировочной характеристики, мкг/см³;

10 - точность градуировочной характеристики, %.

Если величина расхождения (A) превышает указанные значения, делают вывод о невозможности применения градуировочной характеристики для дальнейших измерений. В этом случае выясняют и устраняют причины нестабильности градуировочной характеристики и повторяют контроль ее стабильности с использованием других градуировочных растворов бентазона, предусмотренных методикой измерения. При повторном обнаружении нестабильности градуировочной характеристики ее определяют заново согласно п. 8.8.

9.1. Отбор проб производится в соответствии с методическими документами <3>. Пробы клубней картофеля хранят в холодильнике в полиэтиленовых пакетах при температуре от 0 до плюс 4 °C в течение суток. Для длительного хранения пробы замораживают и хранят в морозильной камере при температуре минус 18 °C.

--------------------------------

<3> Унифицированные правила отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов, утвержденные заместителем Главного государственного санитарного врача СССР 21.08.1979 N 2051-79.

10.1. Экстракция.

Образец клубней картофеля массой 10 г помещают в коническую плоскодонную колбу на 250 см³, добавляют 40 см³ этилацетата и помещают на 15 мин в ультразвуковую ванну, после чего фильтруют при помощи воронки Бюхнера через фильтр красная лента. Экстракцию повторяют еще раз, переливают экстракт вместе с пробой (не отстаивая) в воронку Бюхнера, и фильтруют, объединяя экстракты.

10.2. Подготовка экстракта для определения бентазона.

Полученный экстракт (см. п. 10.1) упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре водяной бани плюс 40 °C до объема 30 см³.

10.3. Очистка полученного экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей.

Экстракт (см. п. 10.2) обрабатывают в ультразвуковой ванне в течение 30 сек, после чего переносят в делительную воронку объемом 250 см³. Далее приливают 40 см³ 0,25 М раствора калия фосфорнокислого двузамещенного (см. п. 8.3.1.1) и экстрагируют интенсивным встряхиванием в течение 2 мин. Жидкости в воронке дают расслоиться и отбирают нижний слой в химический стакан объемом 250 см³. Экстракцию повторяют еще дважды 30 см³ 0,25 М раствора калия фосфорнокислого двузамещенного (см. п. 8.3.1.1), экстракты объединяют. Далее pH экстракта доводят до 3 единиц при помощи концентрированной соляной кислоты, контролируя pH при помощи иономера. После этого переносят экстракт в делительную воронку объемом 250 см³, приливают 30 см³ хлористого метилена и экстрагируют интенсивным встряхиванием в течение 2 мин. Нижний слой отбирают в колбу-концентратор объемом 250 см³. Экстракцию повторяют еще дважды 30 см³ хлористого метилена, экстракты объединяют и упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре водяной бани плюс 40 °C досуха.

В случае плохого разделения фаз в водный экстракт можно добавить хлорид натрия.

10.4. Очистка полученного экстракта при колоночной хроматографии на силикагеле.

К экстракту в концентраторе (см. п. 10.3) добавляют 10 см³ смеси гексана и этилацетата 1:1 (см. п. 8.3.1.2), обрабатывают концентратор в течение 30 сек в ультразвуковой ванне и вносят раствор на подготовленный сорбент (см. п. 8.6.1). Элюат отбрасывают. Сорбент не обсушивают.

Далее на сорбент наносят еще 25 см³ смеси гексана и этилацетата 1:1 (см. п. 8.3.1.2), элюат отбрасывают.

Бентазон смывают 40 см³ смеси гексана и этилацетата 2:8 (см. п. 8.3.1.3), собирают элюат в остродонную колбу концентратор объемом 100 см³, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C.

Сухой остаток растворяют в 1 см³ ацетонитрила для ВЭЖХ, обрабатывают концентратор в ультразвуковой ванне в течение 30 сек и переносят экстракт в хроматографическую виалу объемом 2 см³ для последующего хроматографирования.

10.5. Условия хроматографирования описаны в табл. 10.1.

11.1. Для обработки результатов хроматографического анализа используется компьютерное программное обеспечение химического анализа, которое входит в хроматографическую систему, которое рассчитывает концентрацию бентазона в анализируемом объеме. Концентрацию бентазона в образце рассчитывают по формуле (2):

где: X - содержание бентазона в пробе, мг/кг;

C - концентрация бентазона в экстракте, мкг/см³ (рассчитана при помощи программного обеспечения хроматографической системы);

V - объем экстракта, см³ (1 см³);

m - масса анализируемого образца, г.

11.2. Проверка приемлемости результатов параллельных определений.

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (3):

где: X₁, X₂ - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости (табл. 3.1), при этом .

При невыполнении условия (3) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

12.1. Результат анализа представляют в виде выражения (4):

где - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

- граница абсолютной погрешности, мг/кг, которая определяется по формуле (5):

где - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 3.1), %.

В случае если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде: "< 0,025 мг/кг".

13.1. Контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с методическими документами. Периодичность и формы контроля определяются руководством по качеству.

--------------------------------

<4> ГОСТ Р ИСО 5725-(1 - 6).

1. Федеральный закон от 30.03.1999 N 52-ФЗ "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения".

2. ГОСТ Р 53228 "Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания".

3. ГОСТ 1770 "Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия".

4. ГОСТ 29227 "Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования".

5. ГОСТ 25336 "Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры".

6. ГОСТ 12026 "Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия".

7. ГОСТ 9147 "Посуда и оборудование лабораторные фарфоровые. Технические условия".

8. ГОСТ 34037 "Упаковка стеклянная для химических реактивов и особо чистых химических веществ. Общие технические условия".

9. ГОСТ Р 58144 "Вода дистиллированная. Технические условия".

10. ГОСТ Р 52501 "Вода для лабораторного анализа. Технические условия".

11. ГОСТ 61 "Реактивы. Кислота уксусная. Технические условия".

12. ГОСТ 4233 "Реактивы. Натрий хлористый. Технические условия".

13. ГОСТ 3118 "Реактивы. Кислота соляная. Технические условия".

14. ГОСТ 2493 "Реактивы. Калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный. Технические условия".

15. ГОСТ 12.1.007 "Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности".

16. ГОСТ 12.1.019 "Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты".

17. ГОСТ 12.1.004 "Пожарная безопасность. Общие требования".

18. ГОСТ 12.4.009 "Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание".

19. ГОСТ Р ИСО 5725-1 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 1. Основные положения и определения".

20. ГОСТ Р ИСО 5725-2 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 2. Основной метод определения повторяемости и воспроизводимости стандартного метода измерений".

21. ГОСТ Р ИСО 5725-3 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 3. Промежуточные показатели прецизионности стандартного метода измерений".

22. ГОСТ Р ИСО 5725-4 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 4. Основные методы определения правильности стандартного метода измерений".

23. ГОСТ Р ИСО 5725-5 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 5. Альтернативные методы определения прецизионности стандартного метода измерений".

24. ГОСТ Р ИСО 5725-6 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике".

25. Унифицированные правила отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов.