"МУК 4.1.4014-24. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств флудиоксонила в масле кукурузы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 19.02.2024)

1. Разработаны Обществом с ограниченной ответственностью "Центр экопестицидных исследований" (Р.А. Стрелецкий, В.С. Горбатов).

2. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 19 февраля 2024 г.

3. Введены впервые.

1.1. Настоящие методические указания (далее - МУК) описывают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (далее - ВЭЖХ) для определения остаточных количеств флудиоксонила в масле кукурузы в диапазоне от 0,02 до 0,2 мг/кг.

1.2. МУК носят рекомендательный характер.

2.1. Флудиоксонил - 4-(2,2-дифтор-1,3-бензодиоксол-4-ил)-пиррол-3-карбоновой кислоты <1>. Регистрационный номер CAS: 131341-86-1. Молекулярная масса 248,2.

--------------------------------

<1> В соответствии с классификацией Международного союза теоретической и прикладной химии (ИЮПАК) (англ. International Union of Pure and Applied Chemistry, IUPAC).

2.2. Физико-химические свойства флудиоксонила.

Бесцветное кристаллическое вещество без запаха, температура плавления: плюс 199,8 °C, давление паров при плюс 25 °C: 3,9 x 10 мПа, хорошо растворим в ацетоне, этаноле, метаноле, н-октаноле, плохо растворим в гексане; растворимость в воде: 1,5 - 1,8 мг/л. Коэффициент распределения н-октанол/вода: 4,12 (плюс 25 °C).

2.3. Флудиоксонил - пестицид, фунгицид широкого спектра действия, ингибирует рост мицелия.

3.1. При соблюдении условий проведения анализа <2> и методики, изложенной в настоящих МУК, погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 3.1 для соответствующих диапазонов концентраций.

--------------------------------

<2> ГОСТ Р ИСО 5725-1 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 1. Основные положения и определения", введенный в действие постановлением Госстандарта России от 23.04.2002 N 161-ст; ГОСТ Р ИСО 5725-2 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 2. Основной метод определения повторяемости и воспроизводимости стандартного метода измерений", введенный в действие постановлением Госстандарта России от 23.04.2002 N 161-ст; ГОСТ Р ИСО 5725-3 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 3. Промежуточные показатели прецизионности стандартного метода измерений", введенный в действие постановлением Госстандарта России от 23.04.2002 N 161-ст; ГОСТ Р ИСО 5725-4 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 4. Основные методы определения правильности стандартного метода измерений", введенный в действие постановлением Госстандарта России от 23.04.2002 N 161-ст; ГОСТ Р ИСО 5725-5 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 5. Альтернативные методы определения прецизионности стандартного метода измерений", введенный в действие постановлением Госстандарта России от 23.04.2002 N 161-ст; ГОСТ Р ИСО 5725-6 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике", введенный в действие постановлением Госстандарта России от 23.04.2002 N 161-ст (далее - ГОСТ Р ИСО 5725-(1-6).

4.1. Метод основан на определении флудиоксонила с помощью ВЭЖХ с использованием ультрафиолетового (далее - УФ) детектора.

4.2. Определение флудиоксонила в масле кукурузы проводится после его экстракции ацетонитрилом, очистки и концентрирования в системе несмешивающихся растворителей и на картриджах с силикагелем.

4.3. Идентификация флудиоксонила проводится по времени удерживания. Концентрацию флудиоксонила определяют по площадям соответствующих хроматографических пиков на хроматограммах по методу абсолютной калибровки.

В предлагаемых условиях анализа метод специфичен. Специфичность обеспечивается подбором колонки и условий хроматографирования.

4.4. Нижний предел измерения флудиоксонила в анализируемом объеме пробы - 1 нг. Количественное определение проводится методом ВЭЖХ с УФ-детектированием.

5.1. При выполнении измерений и подготовке проб применяют средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы, приведенные в табл. 5.1 - 5.3.

6.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами в соответствии с ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками в соответствии с ГОСТ Р 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на комплекс жидкостного хроматографа.

6.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Организуется обучение работников безопасности труда.

6.3. Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист, имеющий опыт работы на жидкостном хроматографе с УФ-детектором, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений.

7.2. При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха плюс 15 - 30 °C, относительной влажности не более 80% и нормальном атмосферном давлении;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе с УФ-детектором проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

8.1. Выполнению измерений предшествуют следующие операции: очистка растворителей (при необходимости), приготовление растворов, кондиционирование хроматографической колонки, установление градуировочных характеристик.

8.2. Подготовка органических растворителей.

При использовании растворителей необходимой чистоты не возникает необходимости в дополнительной очистке.

8.3. Приготовление растворов для проведения анализа

8.3.1. Приготовление рабочих растворов.

8.3.1.1. Приготовление смеси ацетонитрил:вода (3:7).

В мерную колбу объемом 1 дм³ помещают 300 см³ ацетонитрила и доводят до метки дистиллированной водой. Раствор хранится не более месяца в таре, исключающей испарение при комнатной температуре.

8.3.1.2. Приготовление смеси гексана и диэтилового эфира (4:1).

В мерную колбу объемом 1 дм³ помещают 200 см³ диэтилового эфира и доводят до метки гексаном. Раствор хранится не более месяца в таре, исключающей испарение при комнатной температуре.

8.3.1.3. Приготовление 5% раствора ацетона в гексане.

В мерную колбу объемом 1 дм³ помещают 200 см³ гексана, приливают 50 см³ ацетона и доводят до метки гексаном. Раствор хранится не более месяца в таре, исключающей испарение при комнатной температуре.

8.3.2. Приготовление градуировочных растворов.

8.3.2.1. Стандартный раствор N 1 с концентрацией флудиоксонила 1,0 мг/см³.

Взвешивают 10 мг флудиоксонила в мерной колбе объемом 10 см³. Навеску растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом. Полученный стандартный раствор N 1 используется для приготовления стандартных раствора N 2. Стандартный раствор N 1 хранится в холодильнике в течение 3 месяцев.

8.3.2.2. Промежуточный раствор N 2 с концентрацией флудиоксонила 10,0 мкг/см³.

Из стандартного раствора N 1 отбирают пипеткой 1 см³ и помещают в мерную колбу объемом 100 см³. Доводят объем до метки ацетонитрилом при перемешивании. Промежуточный раствор N 2 используется для для хроматографического исследования и установления градуировочной характеристики. Промежуточный раствор N 2 хранят в холодильнике в течение 30 суток.

8.3.2.3. Стандартный раствор N 3 с концентрацией флудиоксонила 0,5 мкг/см³.

Из стандартного раствора N 2 отбирают пипеткой 0,5 см³, помещают в мерную колбу объемом 10 см³ и доводят объем до метки ацетонитрилом. Стандартный раствор N 3 используется для установления градуировочной характеристики и готовится непосредственно перед использованием.

8.3.2.4. Стандартный раствор N 4 с концентрацией флудиоксонила 0,25 мкг/см³.

Из стандартного раствора N 3 отбирают пипеткой 5 см³, помещают в мерную колбу объемом 10 см³ и доводят объем до метки ацетонитрилом. Стандартный раствор N 4 используется для установления градуировочной характеристики и готовится непосредственно перед использованием.

8.3.2.5. Стандартный раствор N 5 с концентрацией флудиоксонила 0,1 мкг/см³.

Из стандартного раствора N 3 отбирают пипеткой 2 см³, помещают в мерную колбу объемом 10 см³ и доводят объем до метки ацетонитрилом. Стандартный раствор N 5 используется для установления градуировочной характеристики и готовится непосредственно перед использованием.

8.3.2.6. Стандартный раствор N 6 с концентрацией флудиоксонила 0,05 мкг/см³.

Из стандартного раствора N 3 отбирают пипеткой 1 см³, помещают в мерную колбу объемом 10 см³ и доводят объем до метки ацетонитрилом. Стандартный раствор N 6 используется для установления градуировочной характеристики и готовится непосредственно перед использованием.

8.4. Установление градуировочной характеристики.

Градуировочную характеристику, выражающую отношение поглощения при длине волны 268 нм от концентрации флудиоксонила в растворе (мкг/см³), устанавливают путем определения соотношения площади пиков, отвечающих идентифицируемому компоненту, и концентрации аналитического стандарта по 4 растворам для установления градуировочной характеристики.

Градуировочную зависимость для определения флудиоксонила в масле кукурузы устанавливают по 4 растворам для градуировки с концентрацией 0,05, 0,1, 0,25 и 0,5 мкг/см³, приготовленным согласно п.п. 8.3.2.3 - 8.3.2.6.

В инжектор хроматографа вводят по 20 мм³ каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 10.5. Осуществляют не менее 5 параллельных измерений.

8.5. Подготовка концентрирующих картриджей на основе силикагеля для очистки экстрактов и проверка хроматографического поведения флудиоксонила на них.

8.5.1. Подготовка силикагеля для очистки экстракта.

Скорость потока растворов через картридж не должна превышать 2 капли/сек.

Картридж устанавливается в вакуумный манифолд.

Кондиционирование: картридж промывают 10 см³ 5% раствора ацетона в гексане (п. 9.2.1.3), затем 10 см³ смеси гексана. Элюаты отбрасывают.

Не допускают высыхания поверхности картриджа.

8.5.2. Проверка хроматографического поведения флудиоксонила на силикагеле.

В концентратор объемом 50 см³ вносят 1 см³ стандартного раствора флудиоксонила в ацетонитриле с концентрацией 10,0 мкг/см³ и упаривают его досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C.

В концентратор помещают 3 см³ 5% раствора ацетона в гексане (п. 8.2.1.3), обрабатывают концентратор 30 сек в ультразвуковой ванне и вносят раствор на подготовленный картридж. Элюат собирают порциями по 2 см³ в концентратор объемом 50 см³ и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C. Картридж нельзя обсушивать!

Далее на картридж наносят 15 см³ гексана и собирают элюат порциями по 5 см³ в отдельные концентраторы объемом 50 см³ и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C.

Флудиоксонил смывают 20 см³ 5% раствора ацетона в гексане (п. 8.2.1.3) и собирают элюат порциями по 2 см³ в отдельные концентраторы объемом 50 см³ и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C.

Сухой остаток каждой фракции растворяют в 1 см³ ацетонитрила для ВЭЖХ, обрабатывая колбы в ультразвуковой ванне в течение 30 сек, и хроматографируют.

Определяют фракции, содержащие флудиоксонил, полноту смывания с картриджа и необходимый объем элюента.

Изучение поведения флудиоксонила на картридже с силикагелем проводят каждый раз при отработке методики или поступлении новой партии картриджа.

8.6. Подготовка и кондиционирование колонки для жидкостной хроматографии.

Хроматографическую колонку устанавливают в термостате хроматографа и стабилизируют при температуре плюс 25 °C 3 - 4 часа.

8.7. Контроль стабильности градуировочной характеристики

Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят в начале каждой серии измерений, анализируя один из градуировочных растворов не менее двух раз.

Градуировочная характеристика считается стабильной, если для каждого из используемого для контроля градуировочного раствора сохраняется соотношение (1):

где: X - концентрация флудиоксонила контрольного измерения, мкг/см³;

C - известная концентрация градуировочного раствора флудиоксонила в ацетонитриле, взятая для контроля стабильности градуировочной характеристики, мкг/см³;

10 - точность градуировочной характеристики, %.

Если величина расхождения (A) превышает указанные значения, делают вывод о невозможности применения градуировочной характеристики для дальнейших измерений. В этом случае выясняют и устраняют причины нестабильности градуировочной характеристики и повторяют контроль ее стабильности с использованием других градуировочных растворов флудиоксонила, предусмотренных методикой измерения. При повторном обнаружении нестабильности градуировочной характеристики определяют ее заново согласно п. 8.7.

9.1. Отбор проб производится в соответствии с методическими документами <3>. Пробы масла кукурузы хранят в холодильнике температуре 0 - плюс 4 °C. Также масло можно получить экстракцией неполярными растворителями из зерен кукурузы непосредственно перед проведением анализа.

--------------------------------

<3> Унифицированные правила отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов, утвержденные заместителем Главного государственного санитарного врача СССР 21.08.1979 N 2051-79.

10.1. Экстракция.

Образец масла кукурузы массой 5 г растворяют в 10 см³ гексана в стакане объемом 50 см³ и переносят в делительную воронку объемом 125 см³. Далее в стакан приливают 20 см³ гексана, обмывают стенки и также помещают в делительную воронку. Затем в воронку приливают 30 см³ ацетонитрила и экстрагируют интенсивным встряхиванием в течение 2 мин. После полного разделения фаз нижний ацетонитрильный слой собирают в химический стакан объемом 250 см³. Экстракцию повторяют еще дважды 20 см³ ацетонитрила.

10.2. Подготовка экстракта для определения флудиоксонила.

Полученный экстракт (п. 10.1) переносят в делительную воронку объемом 250 см³, приливают 20 см³ гексана и интенсивно встряхивают в течение 2 мин. После полного разделения фаз нижний ацетонитрильный слой собирают в отгонную колбу объемом 50 см³ и упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре водяной бани плюс 40 °C досуха.

10.3. Очистка полученного экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей.

К экстракту (п. 10.2) приливают 20 см³ смеси ацетонитрила:вода (3:7) (п. 8.3.1.1), обрабатывают в ультразвуковой ванне в течение 30 сек, после чего переносят в делительную воронку объемом 100 см³. Далее приливают 20 см³ смеси гексана и диэтилового эфира (4:1) (п. 8.3.1.2) и экстрагируют интенсивным встряхиванием в течение 2 мин. Жидкости в воронке дают расслоиться и отбирают верхний слой в отгонную колбу на 100 см³. Экстракцию повторяют еще дважды 15 см³ смеси гексана и диэтилового эфира (4:1) (п. 8.3.1.2), экстракты объединяют и упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре водяной бани плюс 40 °C досуха.

10.4. Очистка полученного экстракта на картриджах с силикагелем.

К экстракту в концентраторе (п. 10.3) добавляют 3 см³ 5% раствора ацетона в гексане (п. 8.3.1.3), обрабатывают концентратор в течение 30 сек в ультразвуковой ванне и вносят раствор на подготовленный картридж (п. 8.5.1). Элюат отбрасывают. Не допускают высыхания поверхности картриджа.

Далее на картридж наносят 15 см³ гексана, элюат отбрасывают.

Флудиоксонил смывают 20 см³ 5% раствора ацетона в гексане (п. 8.3.1.3), первые 5 см³ элюата отбрасывают, остальные 15 см³ элюата собирают в остродонную колбу концентратор объемом 50 см³ упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C.

Сухой остаток растворяют в 2 см³ ацетонитрила для ВЭЖХ, обрабатывают концентратор в ультразвуковой ванне в течение 30 сек и переносят экстракт в хроматографическую виалу объемом 2 см³ для последующего хроматографирования.

10.5. Условия хроматографирования описаны в табл. 10.1.

11.1. Для обработки результатов хроматографического анализа используется компьютерное программное обеспечение химического анализа, которое входит в хроматографическую систему, которое рассчитывает флудиоксонила в анализируемом объеме. Концентрацию флудиоксонила в образце рассчитывают по формуле (2):

где: X - содержание флудиоксонила в пробе, мг/кг;

V - объем экстракта, см³ (2 см³);

C - концентрация флудиоксонила в экстракте, мкг/см³ (рассчитана при помощи программного обеспечения хроматографической системы);

m - масса анализируемого образца, г.

11.2. Проверка приемлемости результатов параллельных определений.

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (3):

где: X₁, X₂ - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости (табл. 3.1), при этом .

При невыполнении условия (3) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

12.1. Результат анализа представляют в виде формулы (4):

где: X - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг; которая определяется по формуле (5):

где: - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 3.1), %.

В случае если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде: "< 0,02 мг/кг".

13.1. Контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с методическими документами. Периодичность и формы контроля определяется руководством по качеству.

1. Федеральный закон от 30.03.1999 N 52-ФЗ "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения".

2. ГОСТ Р 53228 "Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания".

3. ГОСТ 1770 "Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия"

4. ГОСТ 29227 "Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования".

5. ГОСТ 25336 "Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры".

6. ГОСТ 12026 "Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия".

7. ГОСТ 9147 "Посуда и оборудование лабораторные фарфоровые. Технические условия".

8. ГОСТ 34037 "Упаковка стеклянная для химических реактивов и особо чистых химических веществ. Общие технические условия".

9. ГОСТ Р 58144 "Вода дистиллированная. Технические условия".

10. ГОСТ Р 52501 "Вода для лабораторного анализа. Технические условия".

11. ГОСТ ISO 7886-1 "Шприцы инъекционные однократного применения стерильные. Часть 1. Шприцы для ручного использования".

12. ГОСТ 12.1.007 "Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности".

13. ГОСТ Р 12.1.019 "Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты".

14. ГОСТ 12.1.004 "Пожарная безопасность. Общие требования".

15. ГОСТ 12.4.009 "Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание".

16. ГОСТ 12.0.230 "Системы управления охраной труда. Общие требования".

17. ГОСТ Р ИСО 5725-1 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 1. Основные положения и определения".

18. ГОСТ Р ИСО 5725-2 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 2. Основной метод определения повторяемости и воспроизводимости стандартного метода измерений".

19. ГОСТ Р ИСО 5725-3 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 3. Промежуточные показатели прецизионности стандартного метода измерений".

20. ГОСТ Р ИСО 5725-4 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 4. Основные методы определения правильности стандартного метода измерений".

21. ГОСТ Р ИСО 5725-5 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 5. Альтернативные методы определения прецизионности стандартного метода измерений".

22. ГОСТ Р ИСО 5725-6 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике".

23. Унифицированные правила отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов.