"МУК 4.2.3996-24. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Метод микробиологического измерения концентрации микроорганизмов Rhodococcus qingshengii штамм ARC52 ВКПМ Ac-2144 и Rhodococcus qingshengii штамм ARC51 ВКПМ Ac-2157 в воздухе рабочей зоны. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 19.02.2024)

1. Разработаны ФБУН "ФНЦГ им. Ф.Ф. Эрисмана" Роспотребнадзора (С.В. Кузьмин, Г.М. Трухина, О.О. Синицына, Н.А. Борисова, Е.А. Вишневская, Е.В. Чикова, А.А. Самотоина).

2. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 19 февраля 2024 г.

3. Введены впервые.

1.1. Настоящие методические указания (далее - МУК) описывают порядок применения метода микробиологического количественного анализа концентрации микроорганизма Rhodococcus qingshengii штамм ARC52 ВКПМ Ac-2144 (далее - микроорганизм Rhodococcus qingshengii штамм ARC52) и микроорганизма Rhodococcus qingshengii штамм ARC51 ВКПМ Ac-2157 (далее - микроорганизм Rhodococcus qingshengii штамм ARC51) в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 50 до 50 000 клеток в 1 м³ воздуха.

1.2. МУК носят рекомендательный характер.

2.1. Микроорганизм Rhodococcus qingshengii штамм ARC52 <1> предполагается применять в биотехнологии, микробиологии, экологии, охране окружающей среды, также микроорганизм Rhodococcus qingshengii штамм ARC52 может быть использован для очистки акваторий водоемов, береговой линии, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, при низкой, в том числе отрицательной, температуре.

--------------------------------

<1> Микроорганизм Rhodococcus qingshengii штамм ARC52 депонирован в Национальном Биоресурсном Центре Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов на базе ФГБУ "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов Национального исследовательского центра "Курчатовский институт" под номером ВКПМ Ac-2144 24.12.2020.

2.1.1. Способ получения штамма: выделен из образцов морской воды, отобранных в акватории Карского моря у западного берега полуострова Ямал. Является природным изолятом, не модифицирован. Обладает способностью к деструкции нефти и нефтепродуктов.

2.1.2. Таксономическое положение:

- царство Bacteria;

- тип Actinomycetota;

- класс Actinomycetia;

- порядок Mycobacteriales;

- семейство Nocardiaceae;

- род Rhodococcus;

- вид qingshengii;

- штамм ARC52.

2.1.3. Микробиологическая характеристика.

2.1.3.1. Колонии при температуре плюс (22 +/- 1) °C и инкубации в течение 4 суток на модифицированной плотной питательной среде (англ. Plate Count Agar, далее - mPCA) имеют следующие характеристики: колонии мелкие, до 4 мм, округлой формы, глянцевые, выпуклые, край ровный, мягкие, розовые, легко снимаются с агара, без запаха.

2.1.3.2. При микроскопии штамм представляет грамположительные палочки, кокки и коккобациллы в зависимости от стадии роста, которые располагаются хаотично. Спор не образуют. Культура неподвижная.

2.1.3.3. Микроорганизм Rhodococcus qingshengii штамм ARC52 грамположительный аэробный микроорганизм, оксидазоотрицательный, каталазоположительный, гидролизует эскулин и мочевину, не образует лецитиназу, гемолизотрицательный, не разлагает цитрат и малонат, подщелачивает D-лактат; обладает ферментами: Лейцинариламидаза, L-пролинариламидаза, Аланин-ариламидаза, Тирозинариламидаза, Ala-Phe-Pro ариламидаза, Аргининдигидролаза I; не ассимилирует сахара: D-глюкозу, сахарозу, лактозу, D-маннит, D-маннозу, амигдалин, D-ксилозу, D-сорбит, D-рибозу, D-мальтозу, D-рафинозу, D-трегалозу.

2.1.4. Оптимальная плотная питательная среда для выращивания и размножения микроорганизма Rhodococcus qingshengii штамм ARC52 - mPCA следующего состава (г/дм³): K₂HPO₄ - 1,5; KH₂PO₄ - 0,75; MgSO₄ - 1,0; (NH₄)₂SO₄ - 4,0; NaCl - 30; гидролизат казеина - 5,0; дрожжевой экстракт - 2,5; D-глюкоза - 1,0; агар - 14; дистиллированная вода - 1000 см³; pH 7,0.

2.1.5. Микроорганизм Rhodococcus qingshengii штамм ARC52 относится к микроорганизмам, непатогенным для человека. Работа с микроорганизмом Rhodococcus qingshengii штамм ARC52 не требует специальных мер предосторожности.

2.2. Микроорганизм Rhodococcus qingshengii штамм ARC51 предполагается применять в биотехнологии, микробиологии, экологии, охране окружающей среды, также микроорганизм Rhodococcus qingshengii штамм ARC51 может быть использован для очистки акваторий водоемов, береговой линии, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, при низкой, в том числе отрицательной, температуре.

2.2.1. Способ получения штамма: выделяется из образцов морской воды, отобранных в акватории Баренцева моря у побережья острова Матвеев. Является природным изолятом, не модифицирован. Обладает способностью к деструкции нефти и нефтепродуктов.

2.2.2. Таксономическое положение:

- царство Bacteria;

- тип Actinomycetota;

- класс Actinomycetia;

- порядок Mycobacteriales;

- семейство Nocardiaceae;

- род Rhodococcus;

- вид qingshengii;

- штамм ARC51.

2.2.3. Микробиологическая характеристика.

2.2.3.1. Колонии при температуре плюс (22 +/- 1) °C и инкубации в течение 4 суток на модифицированной плотной питательной среде (англ. Plate Count Agar, далее - mPCA) имеют следующие характеристики: колонии мелкие, размером от 2 мм до 4 мм, округлой формы, выпуклые, край ровный, однородной структуры, мягкой консистенции, легко снимаются с агара, слабо-розового цвета, без запаха.

2.2.3.2. При микроскопии представляет грамположительные форму палочки, кокков и коккобацилл в зависимости от стадии роста, которые располагаются хаотично. Спор не образуют. Культура неподвижная.

2.2.3.3. Микроорганизм Rhodococcus qingshengii штамм ARC51 грамположительный аэробный микроорганизм, оксидазоотрицательный, каталазоположительный, гидролизует мочевину, декарбоксилирует лизин, образует индол, не образует лецитиназу, гемолизотрицательный, не разлагает цитрат и малонат, не подщелачивает D-лактат; обладает ферментами: Лейцинариламидаза, L-пролинариламидаза, Аланинариламидаза, Тирозинариламидаза, Аргининдигидролаза I и II; не ассимилирует сахара: D-глюкозу, сахарозу, лактозу, D-маннит, D-маннозу, амигдалин, D-ксилозу, D-сорбит, D-рибозу, D-мальтозу, D-лактат, D-рафинозу, D-трегалозу.

2.2.4. Оптимальная плотная питательная среда для выращивания и размножения микроорганизма Rhodococcus qingshengii штамм ARC51 - mPCA следующего состава (г/дм³): K₂HPO₄ - 1,5; KH₂PO₄ - 0,75; MgSO₄ - 1,0; (NH₄)₂SO₄ - 4,0; NaCl - 30; гидролизат казеина - 5,0; дрожжевой экстракт - 2,5; D-глюкоза - 1,0; агар - 14; дистиллированная вода - 1000 см³, pH 7,0.

2.2.5. Микроорганизм Rhodococcus qingshengii штамм ARC51 относится к микроорганизмам, непатогенным для человека. Работа с микроорганизмом Rhodococcus qingshengii штамм ARC51 не требует специальных мер предосторожности.

3.1. Методика обеспечивает выполнение измерений количества клеток микроорганизмов в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 50 до 50 000 клеток в 1 м³ воздуха при доверительной вероятности P = 0,95.

4.1. Метод основан на аспирации из воздуха рабочей зоны клеток микроорганизма и подсчете количества выросших колоний по типичным культурально-морфологическим, тинкториальным признакам.

5.1. При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства, материалы, реактивы и питательные среды, приведенные в табл. 5.1 - 5.3.

6.1. Выполнение измерений концентрации клеток микроорганизма Rhodococcus qingshengii штамм ARC52 и микроорганизма Rhodococcus qingshengii штамм ARC51 в воздухе рабочей зоны осуществляют в соответствии с законодательством Российской Федерации <5>.

--------------------------------

<5> Федеральный закон от 30.03.1999 N 52-ФЗ "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения".

6.2. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования по электробезопасности при работе с электроустановками <6> и инструкции по эксплуатации прибора.

--------------------------------

<6> ГОСТ 12.1.009 "Электробезопасность. Термины и определения", введенный приказом Росстандарта от 07.11.2018 N 942-ст.

6.3. Работа с микроорганизмами проводится в боксированных помещениях либо в боксах микробиологической безопасности не ниже II класса <7>. Все виды работ с реактивами проводят в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями <8>.

--------------------------------

<7> Глава IV СанПиН 3.3686-21.

<8> Глава I СанПиН 1.2.3685-21 "Гигиенические нормативы и требования к обеспечению безопасности и (или) безвредности для человека факторов среды обитания", утвержденных постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 28.01.2021 N 2 (зарегистрировано Минюстом России 29.01.2021, регистрационный N 62296), с изменениями, внесенными постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 30.12.2022 N 24 (зарегистрировано Минюстом России 09.03.2023, регистрационный N 72558).

6.4. К выполнению измерений и обработке результатов допускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области микробиологических исследований.

7.1. Приготовление сред, подготовку к анализу проводят в следующих условиях:

- температура воздуха - плюс 15 - 25 °C;

- атмосферное давление - 760 +/- 20 мм рт. ст.;

- влажность воздуха - не более 60%.

8.1. Для приготовления mPCA используют отдельные компоненты среды следующего состава (г/1000 см³): K₂HPO₄ - 1,5; KH₂PO₄ - 0,75; MgSO₄ - 1,0; (NH₄)₂SO₄ - 4,0; NaCl - 30,0; гидролизат казеина - 5,0; дрожжевой экстракт - 2,5; D-глюкоза - 1,0; агар - 14,0; дистиллированная вода - 1000 см³; pH 7,0.

8.2. Сухие компоненты растворяют в 1000 см³ дистиллированной воды, тщательно перемешивают и нагревают до полного растворения агара.

8.3. Приготовленную среду разливают в стерильные колбы по 250 - 500 см³ и стерилизуют паром при 0,5 атм. в течение 30 мин.

8.4. Готовую среду хранят в защищенных от света условиях при температуре не выше плюс 8 °C не более 10 дней.

8.5. Для длительного хранения штамм лиофилизируют с применением защитной среды, содержащей обезжиренное молоко (10% вес) с добавлением глюкозы (7,5% вес).

9.1. Отбор проб воздуха.

Отбор проб воздуха проводят в соответствии с методическими документами <9>. Для этого воздух отбирают при помощи пробоотборника на поверхность плотной питательной среды в соответствии с технической документацией (инструкцией) на прибор. Время аспирации и объем отбираемого воздуха зависит от предполагаемой концентрации микроорганизма (табл. 9.1).

--------------------------------

<9> МУК 4.2.1054-01 "Измерение концентраций микроорганизмов-продуцентов, бактериальных препаратов и их компонентов в атмосферном воздухе населенных мест"; утвержденные Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации 06.06.2001; ГОСТ Р 8.563 "Государственная система обеспечения единства измерений. Методики (методы) измерений", введенный приказом Ростехрегулирования от 15.12.2009 N 1253-ст.

Аппарат перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают 96%-м этиловым спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора, наружную и внутреннюю стенку крышки. На подвижной диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо (количество питательной среды в чашки вносят в соответствии с инструкцией к прибору). После отбора пробы воздуха и остановки диска прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.

9.2. Выполнение анализа.

9.2.1. При выполнении анализа воздуха стерильную mPCA расплавляют; остужают до температуры плюс 50 - 60 °C и разливают в чашки Петри.

9.2.2. Контроль чистоты розлива проводят в соответствии с методами контроля. Для этого чашки с застывшей средой помещают в термостат при температуре плюс (37 +/- 1) °C не менее, чем на (18 +/- 2) часов. Проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха. Разлитую в чашки питательную среду хранят при температуре плюс 2 - 8 °C не более 10 дней.

9.2.3. После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в термостат с температурой плюс (24 +/- 2) °C. Через 4 - 5 суток производят подсчет выросших колоний по культурально-морфологическим и тинкториальным признакам.

9.2.4. Ростовые свойства используемой питательной среды должны быть проверены до проведения анализа воздуха в соответствии с ростовыми свойствами питательных сред. Для этого микроорганизм Rhodococcus qingshengii штамм ARC52 и микроорганизм Rhodococcus qingshengii штамм ARC51 высевают на 2 - 3 чашки используемой среды.

9.2.5. Лиофилизированную культуру микроорганизма Rhodococcus qingshengii штамм ARC52 и микроорганизма Rhodococcus qingshengii штамм ARC51 необходимо использовать 2 - 3 пассажа по избежание потери ими заданных ростовых свойств.

9.2.6. Идентификацию микроорганизма Rhodococcus qingshengii штамм ARC52 и микроорганизма Rhodococcus qingshengii штамм ARC51 до вида можно проводить с помощью анализа гена 16S РНК на основе ПЦР-реакции.

10.1. Расчет концентрации клеток производят до формуле (1):

где: К - концентрация штамма в воздухе, КОЕ/м³;

П - количество типичных колоний, выросших на чашке Петри;

1000 - коэффициент пересчета дм³ на м³ воздуха;

С - скорость аспирации воздуха, дм³/мин;

T - время аспирации, мин.

11.1. Результаты измерений оформляют на каждый штамм микроорганизма протоколом, приведенным в приложении к настоящим МУК.

1. Дата проведения анализа _________________________________________

2. Место отбора пробы (адрес, точка отбора пробы) _____________________

_____________________________________________________________________

3. Вид пробоотборника _____________________________________________

4. Дата последней метрологической поверки оборудования для отбора проб

_____________________________________________________________________

5. Питательная среда, время инкубации _______________________________

6. Результаты испытания ростовых свойств питательной среды ___________

_____________________________________________________________________

7. Количественная и качественная характеристика выросших колоний (количество типичных колоний)

_____________________________________________________________________

8. Результаты идентификации микроорганизма Rhodococcus qingshengii штамм ARC52 ВКПМ Ac-2144 или микроорганизма Rhodococcus qingshengii штамм ARC51 ВКПМ Ac-2157 (морфологические признаки)

_____________________________________________________________________

9. Результаты расчета концентрации штамма __________________________

10. Соотношение полученных результатов с уровнем ПДК _______________

_____________________________________________________________________

11. Отбор пробы произведен (Ф.И.О., должность, дата, подпись) _________

_____________________________________________________________________

12. Идентификация штамма и расчет концентрации произведены (Ф.И.О., должность, дата, подпись)

_____________________________________________________________________

1. Федеральный закон от 30.03.1999 N 52-ФЗ "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения".

2. Постановление Правительства Российской Федерации от 16.11.2020 N 1847 "Об утверждении перечня измерений, относящихся к сфере государственного регулирования обеспечения единства измерений".

3. СанПиН 3.3686-21 "Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней".

4. СанПиН 1.2.3685-21 "Гигиенические нормативы и требования к обеспечению безопасности и (или) безвредности для человека факторов среды обитания".

5. МУК 4.2.2316-08 "Методы контроля бактериологических питательных сред".

6. МУК 4.2.1054-01 "Измерение концентраций микроорганизмов-продуцентов, бактериальных препаратов и их компонентов в атмосферном воздухе населенных мест".

7. ГОСТ 12.1.009 "Электробезопасность. Термины и определения".

9. ГОСТ OIML R 76-1 "Государственная система обеспечения единства измерений. Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания".

10. ГОСТ OIML R 111-1 "Государственная система обеспечения единства измерений. Гири классов E(1), E(2), F(1), F(2), M(1), M(1-2), M(2), M(2-3) и M(3). Часть 1. Метрологические и технические требования".

11. ГОСТ 1770 "Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия".

12. ГОСТ 29228 "Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 2. Пипетки градуированные без установленного времени ожидания".

13. ГОСТ 28498 "Термометры жидкостные стеклянные. Общие технические требования. Методы испытаний".

14. ГОСТ 13646 "Термометры стеклянные ртутные для точных измерений. Технические условия".

15. ГОСТ Р 51945 "Аспираторы. Общие технические условия".

16. ГОСТ 28311 "Дозаторы медицинские лабораторные. Общие технические требования и методы испытаний".

17. ГОСТ 27987 "Анализаторы жидкости потенциометрические ГСП. Общие технические условия".

18. ГОСТ 13350 "Анализаторы жидкости кондуктометрические ГСП. Общие технические условия".

19. ГОСТ 31598 "Стерилизаторы паровые большие. Общие технические требования и методы испытаний".

20. ГОСТ Р ЕН 13060 "Стерилизаторы паровые малые".

21. ГОСТ 22340 "Аквадистилляторы медицинские электрические. Общие технические требования и методы испытаний".

22. ГОСТ 28489 "Микроскопы световые. Термины и определения".

23. ГОСТ 25706 "Лупы. Типы, основные параметры. Общие технические требования".

24. ГОСТ 25336 "Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры".

25. ГОСТ 23932 "Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Общие технические условия".

26. ГОСТ 9412 "Марля медицинская. Общие технические условия".

27. ГОСТ 5556 "Вата медицинская гигроскопическая. Технические условия".

28. ГОСТ 12026 "Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия".

29. ГОСТ Р ЕН 12469 "Биотехнология. Технические требования к боксам микробиологической безопасности".

30. ГОСТ 17206 "Агар микробиологический. Технические условия".

31. ГОСТ Р 58144 "Вода дистиллированная. Технические условия".

32. ГОСТ 4233 "Реактивы. Натрий хлористый. Технические условия".

33. ГОСТ 2493 "Реактивы. Калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный. Технические условия".

34. ГОСТ 4198 "Реактивы. Калий фосфорнокислый однозамещенный. Технические условия".

35. ГОСТ 4523 "Магний серно-кислый 7-водный. Технические условия".

36. ГОСТ 9097 "Сульфат аммония. Технические условия".

37. ГОСТ 31689 "Казеин. Технические условия".

38. ГОСТ 6038 "Реактивы. D-глюкоза. Технические условия".

39. ГОСТ 17299 "Спирт этиловый технический. Технические условия".

40. ГОСТ 5962 "Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия".