"МУК 4.1.3780-22. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. определение остаточных количеств тетраконазола в капусте белокочанной методом капиллярной газожидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 22.08.2022)

Разработаны: ФГБНУ "Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений" (В.Ф. Павлова, Е.А. Лебедева, Плахов Д.А.); ООО "Инновационный центр защиты растений" (Т.Д. Черменская, В.И. Долженко).

2. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 22 августа 2022 г.

3. Введены впервые.

1.1. Настоящие методические указания (далее - МУК) устанавливают порядок применения метода капиллярной газожидкостной хроматографии (далее - ГЖХ) для определения массовой концентрации тетраконазола в капусте белокочанной в диапазоне концентраций от 0,05 до 0,5 мг/кг включительно.

1.2. МУК предназначены для органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, осуществляющих контроль качества и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов, а также могут быть использованы организациями, аккредитованными в установленном порядке на проведение исследований продовольственного сырья, пищевых продуктов.

1.3. МУК носят рекомендательный характер.

2.1. Тетраконазол. (RS)2-(2,4-дихлорфенил)-3-(1H-1,2,4-триазол-1-ил) пропил-1,1,2,2 терафторэтиловый эфир (ИЮПАК) <1>. Брутто-формула: C₁₃H₁₁C₁₂F₄N₃O. Молекулярная масса 372,1. Химически чистый тетраконазол представляет собой бесцветную вязкую жидкость, разлагается при плюс 240 °C до кипения, давление паров 0,18 mPa, показатель преломления 1,432 (плюс 20 °C). Коэффициент распределения в системе н-октанол-вода K_ow lgP = 3/56 (плюс 20 °C). Растворимость: в воде 156 мг/л (pH 7, плюс 20 °C); хорошо растворим в 1,2-дихлорэтане, ацетоне, метаноле. Стабилен в разбавленных водных растворах с pH (5 - 9).

--------------------------------

<1> В соответствии с Международным союзом теоретической и прикладной химии (ИЮПАК, англ. International Union of Pure and Applied Chemistry, IUPAC).

2.2. Краткая токсикологическая характеристика. ЛД₅₀ для крыс 1248 мг/кг.

2.3. Область применения: фунгицид широкого спектра действия, применяется для борьбы против септориоза, разного вида ржавчины, пиреноспороза, мучнистой росы, окаймленной пятнистости листьев в виде 12,5% водной эмульсии.

3.1. При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 3.1 для соответствующих диапазонов концентраций.

4.1. Определение тетраконазола основано на экстракционном извлечении определяемого компонента из проб капусты белокочанной органическим растворителем, очистке экстракта на сорбенте методом твердофазной экстракции и последующем анализе экстракта методом капиллярной ГЖХ с использованием электронозахватного детектора (далее - ЭЗД). Идентификация тетраконазола проводится по времени удерживания, количественное определение - методом абсолютной калибровки. Избирательность метода обеспечивается сочетанием условий подготовки проб и хроматографирования.

5.1. При выполнении измерений и подготовке проб применяют средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы, приведенные в таблицах 5.1 - 5.3.

Примечание: допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание: допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.

Примечание: допускается использование вспомогательных средств измерений, устройств и материалов с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

6.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф и тандемный масс-селективный детектор.

6.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004.

6.3. При работе с газами, находящимися в баллонах под давлением до 15 МПа (150 кгс/см²), необходимо соблюдать нормы и правила <2>. Запрещается открывать вентиль баллона, не установив в нем понижающий редуктор.

--------------------------------

<2> Приказ Ростехнадзора от 15.12.2020 N 536 "Об утверждении федеральных норм и правил в области промышленной безопасности "Правила промышленной безопасности при использовании оборудования, работающего под избыточным давлением" (зарегистрирован Минюстом России 31.12.2020, регистрационный N 61998).

6.4. Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист, имеющий опыт работы методом капиллярной газожидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений.

7.1. При выполнении измерений выполняют следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха плюс (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на газовом хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

8.1. Выполнению измерений предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), приготовление растворов, подготовка концентрирующего патрона для твердофазной экстракции, приготовление основного и градуировочных растворов, кондиционирование хроматографической колонки, проверка хроматографического поведения тетраконазола на патроне, построение градуировочного графика.

Растворители, используемые для анализа, специальной подготовки не требуют. Рекомендуется проверить чистоту применяемых растворителей. При обнаружении примесей, которые могут мешать определению, растворители очищают общепринятыми методами.

8.2. Приготовление растворов.

8.3. Приготовление элюента N 1 (смесь гексан-ацетон 6:1): в плоскодонную колбу на 250 см³ вносят 120 см³ н-гексана и 20 см³ ацетона. Используется в день приготовления.

8.4. Приготовление элюента N 2 (смесь гексан-ацетон 2:1): в плоскодонную колбу на 250 см³ вносят 120 см³ н-гексана и 60 см³ ацетона. Используется в день приготовления.

8.5. Подготовка концентрирующего патрона для твердофазной экстракции.

8.6. Концентрирующий патрон промывают 3 см³ элюента N 2 и затем 5 см³ гексана со скоростью 1 - 2 капли в секунду.

8.7. Кондиционирование колонки.

8.8. Перед началом анализа капиллярную колонку кондиционируют в токе азота при температуре термостата колонок плюс 250 °C до стабилизации нулевой линии.

8.9. Приготовление основного и градуировочных растворов.

8.9.1. Основной раствор с концентрацией 100 мкг/см³: точную навеску тетраконазола (0,0100 +/- 0,0001) г помещают в мерную колбу на 100 см³, растворяют в ацетоне и доводят объем до метки тем же растворителем.

Градуировочные растворы тетраконазола с концентрациями 0,25, 0,5, 1,0 и 2,5 мкг/см³ готовят методом последовательного разбавления основного раствора по объему, используя гексан.

8.9.2. Раствор N 1 с концентрацией тетраконазола 2,5 мкг/см³: в мерную колбу на 100 см³ пипеточным дозатором вносят 2,5 см³ основного раствора и доводят объем до метки гексаном.

8.9.3. Раствор N 2 с концентрацией тетраконазола 1,0 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 100 см³ пипеточным дозатором вносят 1,0 см³ основного раствора и доводят объем до метки гексаном.

8.9.4. Раствор N 3 с концентрацией тетраконазола 0,5 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 25 см³ пипеточным дозатором вносят 5 см³ раствора N 1 и доводят объем до метки гексаном.

8.9.5. Раствор N 4 с концентрацией тетраконазола 0,25 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 25 см³ пипеточным дозатором вносят 2,5 см³ раствора N 1 и доводят объем до метки гексаном.

8.9.6. Основной раствор можно хранить в холодильнике при температуре плюс (0 - 4) °C в течение 6 месяцев, градуировочные растворы - в течение 2 недель.

8.9.7. Для внесения в образец при определении полноты извлечения используют соответствующие градуировочные растворы тетраконазола.

8.10. Проверка хроматографического поведения тетраконазола на патроне для твердофазной экстракции.

Отбирают 2 см³ стандартного раствора тетраконазола в гексане с концентрацией 1 мкг/см³ и вносят его на подготовленный патрон. Вносят на патрон еще 1 см³ гексана. Промывают патрон 10 см³ смеси гексан-ацетон (6:1). Элюат отбрасывают. Затем промывают 15 см³ смеси гексан-ацетон (2:1), отбирая фракции по 5 см³ в круглодонные колбы. Каждую фракцию упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C, растворяют в 1 см³ гексана и анализируют на содержание тетраконазола. Фракции, содержащие тетраконазол, объединяют, упаривают досуха, остаток растворяют в 1 см³ гексана и вновь анализируют на содержание тетраконазола. Рассчитывают содержание тетраконазола в элюате, определяют полноту вымывания с патрона и необходимый для этого объем элюента.

8.11. Установление градуировочной характеристики.

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика от концентрации тетраконазола в растворе (мкг/см³), устанавливают методом абсолютной калибровки по не менее, чем 4 растворам для градуировки.

В инжектор хроматографа микрошприцем вводят по 1 мм³ каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.3. Осуществляют не менее 3 параллельных измерений. Устанавливают площади пиков вещества, на основании которых строят градуировочную зависимость.

Градуировку признают удовлетворительной, если значение коэффициента линейной корреляции оказывается не ниже 0,99.

8.12. Отбор проб и хранение.

Отбор проб производится в соответствии с методическим документом <3>. Пробы до анализа хранят в герметичной п/э упаковке в морозильной камере при температуре не выше минус 18 °C. Перед анализом пробы, не размораживая, измельчают ножом или в гомогенизаторе.

--------------------------------

<3> Унифицированные правила отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов, утвержденные Минздравом СССР 21.08.1979 N 2051-79.

9.1. Экстракция тетраконазола из капусты белокочанной.

Навеску капусты (10 г) помещают в полипропиленовую центрифужную пробирку вместимостью 50 см³. Далее к навеске добавляют 10 см³ ацетонитрила, тщательно взбалтывают в течение одной минуты. Затем вносят смесь, состоящую из 4 г безводного сульфата магния и 1 г хлористого натрия, 1 г натрия лимоннокислого трехзамещенного 2-водного, 0,5 г натрия лимоннокислого двузамещенного 1,5-водного. Пробирку плотно закрывают и помещают в перемешивающее устройство на 10 мин, затем центрифугируют в течение 10 мин при 4000 об./мин. От верхнего ацетонитрильного слоя отбирают пипеточным дозатором 7 см³, переносят в центрифужную пробирку вместимостью 15 см³, содержащую 150 мг сорбента на основе силикагеля с привитыми пропиламинными группами (PSA) и 900 мг безводного сульфата магния. Пробирку плотно закрывают и помещают в перемешивающее устройство на 10 мин, затем центрифугируют в течение 10 мин при 4000 об./мин. От верхнего слоя пипеточным дозатором отбирают 5 см³ в стеклянную пробирку и упаривают досуха в токе воздуха при температуре не выше плюс 40 °C.

Далее проводят очистку экстракта по п. 9.2.

9.2. Очистка экстракта на патронах для твердофазной экстракции.

К сухому остатку, полученному по п. 9.1 добавляют 1 см³ гексана, тщательно перемешивают, помещают в ультразвуковую ванну на 10 сек. и вносят на подготовленный патрон. Ополаскивают пробирку 1 см³ гексана и также вносят на патрон. Промывают патрон 10 см³ смеси гексан-ацетон (6:1). Элюат отбрасывают. Затем тетраконазол элюируют 6 см³ смеси гексан-ацетон (2:1). Элюат упаривают досуха в токе воздуха при температуре не выше плюс 40 °C. Остаток растворяют в 1 см³ гексана, помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин и анализируют на содержание тетраконазола.

9.3. Условия хроматографирования.

Газовый хроматограф с ЭЗД. Кварцевая капиллярная колонка длиной 30 м, внутренним диаметром 0,32 мм с толщиной слоя неподвижной фазы, состоящей из (5% фенил)-метилполисилоксана, 0,25 мкм. Температура колонки: программирование от плюс 160 °C (1 мин) до плюс 280 °C со скоростью 20 °C/мин. Температура испарителя плюс 270 °C. Температура детектора - плюс 320 °C. Режим с делением потока 1:30. Расход газа-носителя (азот) через колонку - 2,0 см³/мин, дополнительного газа (азот) к ЭЗД - 30 см³/мин. Хроматографируемый объем 1 мм³. Ориентировочное время удерживания тетраконазола 5,4 мин.

10.1. Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки. Содержание тетраконазола в пробе X (мг/кг) вычисляют по формуле:

где C - концентрация вещества, найденная по градуировочному графику в соответствии с величинами площадей хроматографического пика, мкг/см³;

f - полнота извлечения тетраконазола, приведенная в табл. 3.2, %;

V - объем пробы, подготовленной для хроматографического анализа, см³ (1 см³);

P - навеска анализируемого образца (аликвота), г.

Содержание остаточных количеств тетраконазола в образце вычисляют как среднее из двух параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор тетраконазола с концентрацией 0,5 мкг/см³, разбавляют гексаном.

11.1. За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:

где X₁, X₂ - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости (приведен в табл. 3.1).

При невыполнении условия выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

12.1. Результат анализа представляют в виде:

где X_ср - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

- граница абсолютной погрешности, мг/кг;

где - граница относительной погрешности методики (приведена в табл. 3.1), %.

В случае, если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

содержание вещества в пробе "менее нижней границы определения",

например: менее 0,05 мг/кг*, где * - 0,05 мг/кг - предел определения тетраконазола в капусте.

13.1. Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1 - 6.

Контроль стабильности градуировочной характеристики.

Градуировочную характеристику следует проверять перед каждой серией измерений, при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы.

Градуировочную зависимость признают стабильной при выполнении следующего условия:

где C - аттестованное значение массовой концентрации тетраконазола в градуировочном растворе,

C_К - результат контрольного измерения массовой концентрации тетраконазола в градуировочном растворе,

- норматив контроля градуировочного коэффициента, % ( при P = 0,95).

Если расхождение превышает 10%, делают вывод о невозможности применения градуировочной характеристики для дальнейших измерений. В этом случае выясняют и устраняют причины нестабильности градуировочной характеристики и повторяют контроль ее стабильности с использованием других градуировочных растворов тетраконазола. При повторном обнаружении нестабильности градуировочной характеристики устанавливают ее заново.

Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

Величина добавки C_д должна удовлетворять условию:

где - характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой, соответственно), мг/кг; при этом:

где - граница абсолютной погрешности, мг/кг:

где - граница относительной погрешности методики (приведена в табл. 3.1), %.

Результат контроля процедуры K_к рассчитывают по формуле:

где X'_ср, X_ср, C_д - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11.1) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки, соответственно, мг/кг.

Норматив контроля K рассчитывают по формуле:

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (K_к) с нормативом контроля (K).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию:

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении этого условия процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

где X₁, X₂ - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций) (приведен в табл. 3.1), %.

1. Федеральный закон от 30.03.1999 N 52-ФЗ "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения".

2. Приказ Ростехнадзора от 15.12.2020 N 536 "Об утверждении федеральных норм и правил в области промышленной безопасности "Правила промышленной безопасности при использовании оборудования, работающего под избыточным давлением".

3. Унифицированные правила отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов от 21.08.1979 N 2051-79.

4. ГОСТ Р ИСО 5725-1 - 6 "Государственный стандарт Российской Федерации. Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Части 1 - 6".

5. ГОСТ 12.1.007 "Межгосударственный стандарт. Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности".

6. ГОСТ 12.1.019 "Межгосударственный стандарт. Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты".

7. ГОСТ 12.1.004 "Межгосударственный стандарт. Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования".

8. ГОСТ 12.4.009 "Межгосударственный стандарт. Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание".

9. ГОСТ 12.0.004 "Межгосударственный стандарт. Система стандартов безопасности труда. Организация обучения безопасности труда. Общие положения".

10. ГОСТ Р 53228 "Национальный стандарт Российской Федерации. Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания".

11. ГОСТ Р 52501 "Национальный стандарт Российской Федерации. Вода для лабораторного анализа. Технические условия".

12. ГОСТ 9293 (ИСО 2435) "Межгосударственный стандарт. Азот газообразный и жидкий. Технические условия".

13. ГОСТ 25336 "Межгосударственный стандарт. Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры".

14. ГОСТ 4233 "Межгосударственный стандарт. Реактивы. Натрий хлористый. Технические условия".

15. ГОСТ 9737 "Межгосударственный стандарт. Посуда лабораторная стеклянная. Шлифы сферические взаимозаменяемые".

16. ГОСТ 28311 "Межгосударственный стандарт. Дозаторы медицинские лабораторные. Общие технические требования и методы испытаний".

17. ГОСТ 1770 "Межгосударственный стандарт. Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия".