"МУК 4.1.3735-21. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств оксатиапипролина в салате, хмеле, плодах тыквенных культур (огурцы, кабачки, арбуз, дыня), луке на перо методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 28.12.2021)

1. Разработаны ФБУН "Федеральный научный центр гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана" Роспотребнадзора (В.Н. Ракитский, Н.Е. Федорова, М.С. Гречина); ФГБОУ ДПО "Российская медицинская академия непрерывного профессионального образования" (И.З. Мустафина).

2. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 28 декабря 2021 г.

3. Введены впервые.

1.1. Настоящие методические указания (далее - МУК) устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения в салате, хмеле, плодах тыквенных культур (огурцы, кабачки, арбуз, дыня), луке на перо массовой концентрации оксатиапипролина в диапазонах 0,05 - 0,5 мг/кг (салат, лук на перо, плоды тыквенных культур) и 0,1 - 1,0 мг/кг (хмель).

1.2. МУК предназначены для органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, а также могут быть использованы организациями, осуществляющими исследования в области безопасности и качества пищевой продукции и продовольственного сырья.

1.3. МУК носят рекомендательный характер.

2.1. Оксатиапипролин - 1-(4-{4-[(5RS)-5-(2,2-дифторфенил)-4,5-дигидро-1,2-оксазол-3-ил)]-1,3-тиазол-2-ил}-пиперидил-1-ил)-2-(5-метил-3-трифторметил-1H-диразол-1-ил)этанон <1>. Брутто формула: C₂₄H₂₂F₅N₅O₂S. Молекулярная масса 539,5.

--------------------------------

<1> В соответствии с Международным союзом теоретической и прикладной химии (ИЮПАК, англ. International Union of Pure and Applied Chemistry, IUPAC).

2.2. Физические и химические свойства. Белое порошкообразное вещество без запаха. Температура плавления 138,7 - 146,4 °C. Давление паров 1,4 x 10^-3 мПа (при 25 °C). Растворимость в органических растворителях при 20 °C (в г/дм³): ацетонитрил - 111; ацетон - 147,3; н-гексан - 0,01; дихлорметан - 347,3; о-ксилол - 5,7; н-октанол - 0,04; этилацетат - 31,7. Растворимость в воде при 20 °C - 0,184 мг/дм³.

2.3. Краткая токсикологическая характеристика: острая пероральная токсичность (LD₅₀) для крыс > 5000 мг/кг; острая ингаляционная токсичность (LC₅₀) для крыс > 5000 мг/м³.

2.4. Область применения. Оксатиапипролин - фунгицид химического класса оксазолов, рекомендуется для защиты лука, картофеля, томатов, винограда от ложной мучнистой росы и фитоспороза.

3.1. При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 3.1 для соответствующих диапазонов концентраций.

3.2. Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для всего диапазона измерений (n = 20) приведены в табл. 3.2.

4.1. Методика основана на определении вещества с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (далее - ВЭЖХ) на обращенной фазе с тройным квадрупольным масс-спектрометрическим детектором (далее - МС/МС).

4.2. Оксатиапипролин в салате, луке на перо и плодах тыквенных культур определяют после экстракции проб смесью ацетонитрил-вода-муравьиная кислота. Экстракт хмеля дополнительно очищают гексаном, а затем на концентрирующем патроне (картридже) для твердофазной экстракции.

4.3. Нижний предел измерения оксатиапипролина в анализируемом объеме пробы - 0,0025 нг.

5.1. При выполнении измерений и подготовке проб применяют средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы, приведенные в табл. 5.1 - 5.3.

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.

Примечание. Допускается использование вспомогательных устройств и материалов с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

6.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостные хроматографы.

6.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004.

6.3. При работе с газами, находящимися в баллонах под давлением до 15 МПа (150 кгс/см³), необходимо соблюдать нормы и правила <2>. Запрещается открывать вентиль баллона, не установив в нем понижающий редуктор.

--------------------------------

<2> Приказ Ростехнадзора от 15.12.2020 N 536 "Об утверждении федеральных норм и правил в области промышленной безопасности "Правила промышленной безопасности при использовании оборудования, работающего под избыточным давлением" (зарегистрирован Минюстом России 31.12.2020, регистрационный N 61998).

6.4. Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист, имеющий опыт работы на жидкостном хроматографе, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений.

7.1. При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха плюс (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

8.1. Измерениям предшествуют следующие операции: приготовление подвижной фазы для ВЭЖХ, растворов, подготовка концентрирующих патронов для очистки экстрактов, приготовление градуировочных растворов, раствора внесения, кондиционирование хроматографической колонки, установление градуировочной характеристики.

8.2. Подготовка подвижной фазы для ВЭЖХ

Компонент А: в мерную колбу вместимостью 1000 см³ помещают 500 см³ деионизированной воды, вносят 0,5 см³ муравьиной кислоты, доводят до метки деионизированной водой, перемешивают, фильтруют через мембранный фильтр, дегазируют.

Компонент Б: в мерную колбу вместимостью 1000 см³ помещают 500 см³ метанола, вносят 0,1 см³ муравьиной кислоты, доводят до метки метанолом, перемешивают, фильтруют через мембранный фильтр, дегазируют.

Каждый компонент подвижной фазы хранят в темном месте (в емкости из темного стекла) не более 14 дней.

8.3. Приготовление смеси растворителей для разбавления проб и приготовления рабочих растворов

В мерную колбу вместимостью 1000 см³ помещают 700 см³ ацетонитрила, доводят до метки деионизованной водой, перемешивают.

Раствор хранят в темном месте (в емкости из темного стекла) не более 14 дней.

8.4. Приготовление смеси растворителей для экстракции проб

Смешивают ацетонитрил, воду и муравьиную кислоту в соотношении 12:4:0,1 по объему. Раствор хранят в темном месте (в емкости из темного стекла) не более 14 дней.

8.5. Приготовление 1%-го раствора муравьиной кислоты в воде

В мерную колбу вместимостью 500 см³ помещают 5 см³ муравьиной кислоты, доводят до метки деионизованной водой, перемешивают.

Раствор хранят в темном месте (в емкости из темного стекла) не более 14 дней.

8.6. Приготовление раствора для разбавления экстракта

В мерную колбу вместимостью 500 см³ помещают 350 см³ 1%-го раствора муравьиной кислоты в воде, приготовленного по п. 8.5, доводят до метки ацетонитрилом, перемешивают.

Раствор хранят в темном месте (в емкости из темного стекла) не более 14 дней.

8.7. Подготовка концентрирующих патронов для очистки экстрактов

Патрон устанавливают на аллонж с прямым отводом для вакуума.

Концентрирующие патроны промывают с помощью разрежения, создаваемого водоструйным насосом, со скоростью прохождения растворителя через патрон 1 - 2 капли в секунду: последовательно 5 см³ ацетонитрила и 10 см³ раствора, приготовленного по п. 8.6. Патроны готовят непосредственно перед использованием и не допускают их высыхания.

8.8. Приготовление градуировочных растворов и растворов внесения

8.8.1. Исходный раствор оксатиапипролина для градуировки (концентрация 100 мкг/см³). В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 0,0101 г оксатиапипролина, добавляют 50 - 70 см³ ацетонитрила, перемешивают, доводят ацетонитрилом до метки, вновь перемешивают. Раствор хранится в морозильной камере при температуре не выше минус 18 °C не более 3 месяцев.

Растворы N 1 - 5 готовят объемным методом путем последовательного разбавления исходного раствора для градуировки.

8.8.2. Раствор N 1 оксатиапипролина для градуировки и внесения (концентрация 10 мкг/см³)

В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 10 см³ исходного раствора оксатиапипролина (п. 8.8.1) с концентрацией 100 мкг/см³ доводят до метки ацетонитрилом, тщательно перемешивают, получают рабочий раствор N 1 с концентрацией оксатиапипролина 10 мкг/см³. Раствор N 1 хранится в морозильной камере при температуре не выше минус 18 °C не более месяца.

8.8.3. Раствор N 2 оксатиапипролина для градуировки и внесения (концентрация 0,1 мкг/см³)

В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 10 см³ раствора N 1 оксатиапипролина (п. 8.8.2) с концентрацией 10 мкг/см³, доводят до метки смесью растворителей, приготовленной по п. 8.2, тщательно перемешивают, получают рабочий раствор N 2 с концентрацией оксатиапипролина 0,1 мкг/см³. Раствор N 2 хранится в морозильной камере при температуре не выше минус 18 °C не более месяца.

8.8.4. Рабочие растворы N 3 - 7 оксатиапипролина для градуировки (концентрация 0,5 - 10 нг/см³)

В 5 мерных колб вместимостью 100 см³ помещают 10, 5, 2, 1 и 0,5 см³ градуировочного раствора N 2 с концентрацией оксатиапипролина 0,1 мкг/см³ (п. 8.8.3), доводят до метки смесью растворителей, приготовленной по п. 8.3, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы N 3 - 7 с концентрацией оксатиапипролина 10, 5, 2, 1 и 0,5 нг/см³, соответственно.

Растворы хранятся в морозильной камере при температуре не выше минус 18 °C не более недели.

8.9. Кондиционирование хроматографической колонки для ВЭЖХ

Промывают колонку подвижной фазой (смесь компонентов А и Б, приготовленных по п. 9.1, в соотношении 1:1) при скорости подачи растворителя 0,4 см³/мин до установления стабильной базовой линии.

8.10. Установление градуировочной характеристики

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика (I) от концентрации оксатиапипролина в растворе (нг/см³), устанавливают методом абсолютной калибровки по 5 растворам для градуировки.

В инжектор хроматографа вводят по 5 мм³ каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 10.3. Осуществляют не менее 5 параллельных измерений.

9.1. Отбор проб осуществляют в соответствии с ГОСТ 33985, ГОСТ 31854, ГОСТ 34214, ГОСТ 1726, ГОСТ 21946 и другими методическими документами <3>. Растительные пробы хранят при температуре плюс (4 +/- 2) °C не более недели. Для длительного хранения образцы замораживают и хранят при температуре не выше минус 18 °C.

--------------------------------

<3> "Унифицированные правила отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов", утвержденные Минздравом СССР 21.08.1979 N 2051-79.

Перед анализом образцы измельчают.

10.1. Салат, лук на перо, плоды тыквенных культур

Измельченный образец растительной продукции массой 5 г помещают в полипропиленовую центрифужную пробирку на 50 см³, вносят 5 см³ воды для увлажнения. Выдерживают 5 - 10 минут. Вносят 15 см³ смеси для экстракции, приготовленной по п. 8.3 и перемешивают вручную 2 минуты. Затем помещают на аппарат для встряхивания на 15 минут, после центрифугируют 5 минут при 4 500 об./мин. Экстракт переносят в цилиндр на 50 см³. Повторяют экстракцию еще дважды с использованием 15 см³ и 10 см³ смеси для экстракции. Уровень объединенных экстрактов в цилиндре доводят до 50 см³.

Затем к аликвоте экстракта 1 см³ добавляют 9 см³ смеси для разбавления экстракта, приготовленной по п. 8.5. При необходимости пробу дополнительно пропускают через мембранный фильтр (размер пор 0,2 мкм) и анализируют в условиях хроматографирования по п. 8.3.

10.2. Хмель

Измельченный образец хмеля массой 2,5 г помещают в полипропиленовую центрифужную пробирку на 50 см³, вносят 10 см³ воды для увлажнения. Выдерживают 5 - 10 минут. Вносят 15 см³ смеси для экстракции, приготовленной по п. 8.3, и перемешивают вручную 2 минуты. Затем проводят экстракцию с помощью ультразвуковой ванны в течение 15 минут, после центрифугируют 5 минут при 4 500 об./мин. Экстракт переносят в цилиндр на 50 см³. Повторяют экстракцию еще дважды с использованием 15 см³ и 10 см³ смеси для экстракции. Уровень объединенных экстрактов в цилиндре доводят до 50 см³.

Затем аликвоту экстракта 2 см³ отбирают в центрифужную пробирку на 15 см³, добавляют 1 см³ гексана и встряхивают вручную 1 - 2 минуты. Центрифугируют 2 минуты при 4 500 об./мин. Отбирают 1 см³ очищенного экстракта в новую центрифужную пробирку на 15 см³ и добавляют 4 см³ 1%-го раствора муравьиной кислоты, приготовленного по п. 8.4, и хорошо перемешивают. Проводят очистку экстракта на концентрирующем патроне (картридже). Растворы, находящиеся в пробирках, пропускают через концентрирующий патрон, подготовленный по п. 8.6, со скоростью прохождения раствора 1 - 2 см³/мин, дополнительно промывая пробирку 5 см³ смеси для разбавления экстрактов, приготовленной по п. 8.5. После нанесения пробы оксатиапипролин элюируют 10 см³ ацетонитрила (2 раза по 5 см³). При необходимости фильтруют через мембранный фильтр и анализируют в условиях хроматографирования по п. 10.3.

10.3. Условия хроматографирования

Измерения выполняют при следующих режимных параметрах:

- жидкостный хроматограф с тандемным масс-спектрометрическим детектором: тройной квадруполь с источником ионизации, оснащенным соосной подачей горячего азота для эффективной десольвации ионов;

- источник ионизации: электростатическое распыление;

- режим работы: регистрация дочерних положительных ионов после разрушения материнских ионов (регистрация "перехода");

- материнский ион (масса/заряд): 540,2;

- дочерние ионы (масса/заряд): 500,1 (количественный расчет), 163;

- напряжение на фрагментаторе, В: 119;

- энергия разрушения (соударения), В: 25 (540,2 -> 500,1), 49 (540,2 -> 163);

- скорость сканирования: 200 мс;

- давление на распылителе: 35 psi;

- скорость осушающего газа 1 (азот): 10 дм³/мин;

- температура газа 1: плюс 350 °C;

- скорость газа 2 (азот): 12 дм³/мин;

- температура газа 2: плюс 400 °C;

- температура квадруполей (1 и 3): плюс 100 °C;

- хроматографическая колонка стальная длиной 50 мм, внутренним диаметром 2,1 мм, заполненная обращенно-фазным сорбентом с привитыми монофункциональными полярными группами C18, зернением 1,8 мкм;

- температура колонки: плюс 40 °C;

- скорость потока элюента: 0,4 см³/мин;

- объем вводимой пробы: 5 мм³;

- подвижная фаза: 0,05%-й раствор муравьиной кислоты в воде - 0,01%-й раствор муравьиной кислоты в метаноле (30:70, по объему).

Линейный диапазон детектирования 2,5 - 50 нг.

Образцы, дающие пики, большие, чем градуировочный раствор с концентрацией 10 нг/см³, разбавляют подвижной фазой (не более чем в 50 раз).

11.1. Содержание оксатиапипролина в пробах салата, лука на перо, плодах тыквенных, культур и хмеле (X, мг/кг) рассчитывают по формуле:

где A - концентрация оксатиапипролина, найденная по градуировочному графику в соответствии с величинами площадей хроматографических пиков, нг/см³;

V_кон - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, см³;

Кр - кратность разбавления (если экстракт подвергался разбавлению);

m - масса анализируемого образца, г;

C - коэффициент, учитывающий объем экстракта, взятого для анализа, C = 50.

12.1. За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

где r - значение предела повторяемости (табл. 3.1), при этом .

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

13.1. Результат анализа представляют в виде:

где - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

- граница абсолютной погрешности, мг/кг;

где - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 3.1), %.

Если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде: "Содержание оксатиапипролина в пробах салата, лука на перо, плодах тыквенных культур менее 0,05 мг/кг; в пробах хмеля менее 0,1 мг/кг" <4>.

--------------------------------

<4> 0,05 мг/кг и 0,1 мг/кг - пределы обнаружения оксатиапипролина в пробах салата, лука на перо, плодах тыквенных культур и хмеля, соответственно.

14.1. Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1 - 6.

14.2. Контроль стабильности градуировочной характеристики

Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят в начале и по окончании каждой серии анализов.

При контроле стабильности градуировочной характеристики проводят измерения не менее двух образцов концентраций для градуировки, содержание оксатиапипролина в которых должно охватывать весь диапазон концентраций от 0,5 до 10 нг/см³.

Градуировочная характеристика считается стабильной, если для каждого из используемого для контроля градуироводного раствора сохраняется соотношение:

где X - концентрация оксатиапипролина в пробе при контрольном измерении, нг/см³;

C - известная концентрация градуировочного раствора оксатиапипролина, взятая для контроля стабильности градуировочной характеристики, нг/см³;

B - норматив контроля погрешности градуировочной характеристики, % (равен 10% при P = 0,95).

Если величина расхождения (A) превышает 10%, делают вывод о невозможности применения градуировочной характеристики для дальнейших измерений. В этом случае выясняют и устраняют причины нестабильности градуировочной характеристики и повторяют контроль ее стабильности с использованием других градуировочных растворов оксатиапипролина, предусмотренных методикой измерения. При повторном обнаружении нестабильности градуировочной характеристики устанавливают ее заново согласно п. 8.9.

14.3. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.

Величина добавки C_д должна удовлетворять условию:

где - характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно), мг/кг, при этом:

где - граница абсолютной погрешности, мг/кг;

где - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 3.1), %.

Результат контроля процедуры К_к рассчитывают по формуле:

где , , C_д - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 13.1) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки, соответственно, мг/кг.

Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (К_к) с нормативом контроля (К).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию:

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

14.4. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости

Расхождение между результатами измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), не должно превышать предела воспроизводимости (R)

где X₁, X₂ - результаты измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), мг/кг;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 3.1), %.

1. Федеральный закон от 30.03.1999 N 52-ФЗ "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения".

2. Приказ Ростехнадзора от 15.12.2020 N 536 "Об утверждении федеральных норм и правил в области промышленной безопасности "Правила промышленной безопасности при использовании оборудования, работающего под избыточным давлением".

3. "Унифицированные правила отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов", утвержденные Минздравом СССР 21.08.1979 N 2051-79.

4. ГОСТ Р ИСО 5725-(1 - 6) "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

5. ГОСТ Р 53228 "Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания".

6. ГОСТ 1770 (ИСО 1042, ИСО 4788) "Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия".

7. ГОСТ OIML R 111-1 "Государственная система обеспечения единства измерений (ГСИ). Гири классов E(1), E(2), F(1), F(2), M(1), M(1-2), M(2), M(2-3) и M(3). Часть 1. Метрологические и технические требования".

8. ГОСТ 29227 "Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные".

9. ГОСТ 9293 (ИСО 2435-73) "Межгосударственный стандарт. Азот газообразный и жидкий. Технические условия".

10. ГОСТ 25336 "Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры".

11. ГОСТ 21946 "Хмель-сырец. Технические условия".

12. ГОСТ 33985 "Салат-латук, эндивий кудрявый, эндивий эскариол свежие. Технические условия".

13. ГОСТ 31854 "Лук порей свежий, реализуемый в розничной торговле".

14. ГОСТ 34214 "Лук свежий зеленый. Технические условия".

15. ГОСТ 1726 "Огурцы свежие. Технические условия".

18. ГОСТ 12.0.004 "Система стандартов безопасности труда (ССБТ). Организация обучения безопасности труда. Общие положения".

19. ГОСТ 12.4.009 "Система стандартов безопасности труда (ССБТ). Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание".

20. ГОСТ 12.1.004 "Система стандартов безопасности труда (ССБТ). Пожарная безопасность. Общие требования".

21. ГОСТ 12.1.007 "Система стандартов безопасности труда (ССБТ). Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности".