"МУК 4.1.3941-23. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств флорасулама в корнеплодах и ботве свеклы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 04.07.2023)

1. Разработаны ООО "Центр экопестицидных исследований" (Стрелецкий Р.А., Горбатов, В.С., Никитина М.А., Суетина С.В.).

2. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защите прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой "04" июля 2023 г.

3. Введены впервые.

1.1. Настоящие методические указания (далее - МУК) устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (далее - ВЭЖХ) для определения остаточных количеств флорасулама <1> в ботве и корнеплодах свеклы в диапазоне от 0,01 до 0,1 мг/кг.

--------------------------------

<1> Флорасулам, N CAS 145701-23-1, [K-(2,6-дифторфенил)-8-фтор-5метокси-1,2,4-триазоло[1,5-c]пиримидин-2-сульфонамид] - пестицид, гербицид системного действия.

1.3. МУК носят рекомендательный характер.

2.1. Метод основан на определении флорасулама с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием ультрафиолетового детектора (далее - ВЭЖХ-УФ).

Определение флорасулама в корнеплодах и ботве свеклы проводится после его экстракции ацетонитрилом, очистки и концентрирования в системе несмешивающихся растворителей и на концентрирующих картриджах.

Идентификация флорасулама проводится по времени удерживания. Концентрацию флорасулама определяют по площадям соответствующих хроматографических пиков на хроматограммах по методу абсолютной калибровки.

В предлагаемых условиях анализа метод специфичен. Специфичность обеспечивается подбором колонки и условий хроматографирования.

3.1. При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в таблице 3.1 для соответствующих диапазонов концентраций.

4.1. При выполнении измерений и подготовке проб применяют средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы, приведенные в таблицах 4.1 - 4.3.

5.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на комплекс жидкостного хроматографа.

5.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать гигиенических нормативов <2>. Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004.

--------------------------------

<2> СанПиН 1.2.3685-21 "Гигиенические нормативы и требования к обеспечению безопасности и (или) безвредности для человека факторов среды обитания", утвержденные постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 28.01.2021 N 2 (зарегистрировано Минюстом России 29.01.2021 N 62296).

6.1. К выполнению измерений и обработке их результатов допускаются специалисты, имеющие опыт работы в химической лаборатории, прошедшие обучение и владеющие техникой проведения анализа, освоившие метод анализа в процессе тренировки и уложившиеся в нормативы контроля при проведении процедуры контроля погрешности анализа.

7.1. Отбор проб производится в соответствии с методическими документами Пробы ботвы сахарной свеклы, а также корнеплодов свеклы хранят в холодильнике в полиэтиленовых пакетах при температуре плюс (0 - 4) °C в течение суток. Для длительного хранения пробы замораживают и хранят в морозильной камере при температуре минус 18 °C.

8.1. При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха плюс (15 - 30) °C, относительной влажности не более 80% и нормальном атмосферном давлении;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе с УФ-детектором проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

9.1. Выполнению измерений предшествуют следующие операции: очистка растворителей (при необходимости), приготовление растворов, кондиционирование хроматографической колонки, установление градуировочных характеристик.

Подготовка органических растворителей.

При необходимости производится дополнительная очистка растворителей общепринятыми способами. При использовании растворителей необходимой чистоты как правило не возникает необходимости в дополнительной очистке.

9.2. Приготовление растворов для проведения анализа.

9.2.1. Приготовление рабочих растворов.

9.2.1.1. Приготовление 0,01 М раствора соляной кислоты.

В мерную колбу объемом 1 дм³ помещают 500 см³ дистиллированной воды, вносят 0,86 см³ грамма соляной кислоты (плотность 1,179 г/см³), перемешивают и доводят до метки водой.

9.2.1.2. Приготовление смеси гексана и ацетона (1:1).

В мерную колбу объемом 1 дм³ помещают 500 см³ ацетона и доводят до метки гексаном.

9.2.1.3. Приготовление смеси гексана и ацетона (9:1).

В мерную колбу объемом 1 дм³ помещают 100 см³ ацетона и доводят до метки гексаном.

9.2.1.4. Приготовление смеси гексана и ацетона (5:1).

В химическую бутыль объемом 1 дм³ помещают 100 см³ ацетона и 500 см³ гексана.

9.2.2. Приготовление градуировочных растворов.

9.2.2.1. Стандартный раствор N 1 с концентрацией флорасулама 1,0 мг/см³

Взвешивают 10 мг флорасулама в мерной колбе объемом 10 см³. Навеску растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом. Полученный стандартный раствор N 1 используется для приготовления стандартных раствора N 2. Стандартный раствор N 1 хранится в холодильнике в течение 14 суток.

9.2.2.2. Промежуточный раствор N 2 с концентрацией флорасулама 10,0 мкг/см³.

Из стандартного раствора N 1 отбирают пипеткой 1 см³ и помещают в мерную колбу объемом 100 см³. Доводят объем до метки ацетонитрилом при перемешивании. Промежуточный раствор N 2 используется для хроматографического исследования и установления градуировочной характеристики. Промежуточный раствор N 2 хранят в холодильнике в течение 14 суток.

9.2.2.3. Стандартный раствор N 3 с концентрацией флорасулама 1,0 мкг/см³.

Из стандартного раствора N 2 отбирают пипеткой 1 см³, помещают в мерную колбу объемом 10 см³ и доводят объем до метки ацетонитрилом. Стандартный раствор N 3 используется для установления градуировочной характеристики и готовится непосредственно перед использованием.

9.2.2.4. Стандартный раствор N 4 с концентрацией флорасулама 0,5 мкг/см³.

Из стандартного раствора N 3 отбирают пипеткой 5 см³, помещают в мерную колбу объемом 10 см³ и доводят объем до метки ацетонитрилом. Стандартный раствор N 4 используется для установления градуировочной характеристики и готовится непосредственно перед использованием.

9.2.2.5. Стандартный раствор N 5 с концентрацией флорасулама 0,2 мкг/см³.

Из стандартного раствора N 3 отбирают пипеткой 2 см³, помещают в мерную колбу объемом 10 см³ и доводят объем до метки смесью ацетонитрилом. Стандартный раствор N 5 используется для установления градуировочной характеристики и готовится непосредственно перед использованием.

9.2.3.6. Стандартный раствор N 6 с концентрацией флорасулама 0,1 мкг/см³.

Из стандартного раствора N 5 отбирают пипеткой 5 см³, помещают в мерную колбу объемом 10 см³ и доводят объем до метки ацетонитрилом. Стандартный раствор N 6 используется для установления градуировочной характеристики и готовится непосредственно перед использованием.

9.2.2.7. Стандартные растворы флорасулама с концентрацией по 1,0; 0,5; 0,2, 0,1 мкг/см³ для внесения в контрольные образцы и установления метрологических характеристик

В контрольные образцы вносят 1 см³ растворов N 3 - 6 (п. 9.2.2.3. - 9.2.2.6.).

9.3. Приготовление элюентов для ВЭЖХ.

9.3.1. Приготовление 0,1% раствора уксусной кислоты в воде (Элюент А).

В мерную объемом 1 дм³ помещают 500 мл деионизированной воды, добавляют 1 см³ уксусной кислоты, перемешивают и доводят до метки деионизированной водой.

9.3.2. Приготовление 0,1% раствора уксусной кислоты в ацетонитриле (Элюент Б).

В мерную объемом 1 дм³ помещают 500 мл ацетонитрила (ВЭЖХ), добавляют 1 см³ уксусной кислоты, перемешивают и доводят ацетонитрилом до метки.

9.4. Установление градуировочной характеристики.

Градуировочную характеристику, выражающую отношение поглощения при длине волны 260 нм от концентрации флорасулама в растворе (мкг/см³), устанавливают путем определения соотношения площади пиков, отвечающих идентифицируемому компоненту, и концентрации аналитического стандарта по 4-м растворам для установления градуировочной характеристики.

Градуировочную зависимость для определения флорасулама в корнеплодах и ботве свеклы устанавливают по 4-м растворам для градуировки с концентрацией 0,1, 0,2, 0,5 и 1,0 мкг/см³, приготовленным согласно п.п. 9.2.2.3. - 9.2.2.6.

В инжектор хроматографа вводят по 20 мм³ каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 10.5. Осуществляют не менее 5-ти параллельных измерений.

9.5 Подготовка концентрирующих картриджей <3> для очистки экстрактов и проверка хроматографического поведения флорасулама на них.

--------------------------------

<3> На примере концентрирующих картриджей Диапак С.

9.5.1 Подготовка концентрирующих картриджей для очистки экстракта

Все процедуры происходят с использованием вакуума, скорость потока растворов через картридж не должна превышать 1 капля/сек.

Картридж устанавливают в манифолд.

Кондиционирование: концентрирующий картридж промывают 2,5 см³ смеси гексана и ацетона 1:1 (п. 9.2.1.2), затем 2,5 см³ гексана и ацетона 9:1 (п. 9.2.1.3). Элюаты отбрасывают.

Нельзя допускать высыхания поверхности картриджа.

9.5.2 Проверка хроматографического поведения флорасулама на концентрирующих картриджах.

В концентратор объемом 50 см³ вносят 1 см³ стандартного раствора флорасулама в ацетонитриле с концентрацией 1,0 мкг/см³ и упаривают его досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C.

В концентратор помещают 1 см³ ацетона, обрабатывают концентратор 30 сек в ультразвуковой ванне, затем с приливают 5 см³ гексана, обмывают стенки концентратора и вносят раствор на подготовленный картридж. Элюат собирают порциями по 2 см³ в отдельные концентраторы объемом 50 см³ и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C. Картридж нельзя обсушивать!

На картридж наносят 5 см³ смеси гексана и ацетон 9:1 (п. 9.2.1.3) и собирают элюат порциями по 1 см³ в отдельные концентраторы объемом 50 см³ и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C.

Далее вносят на картридж 5 см³ смеси гексана и ацетона 5:1 (п. 9.2.1.4) и собирают элюат порциями по 1 см³ в отдельные концентраторы объемом 50 см³ и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C.

Флорасулам смывают 3 см³ смеси гексана и ацетона 1:1 (п. 9.2.1.2) и собирают элюат порциями по 1 см³ в отдельные концентраторы объемом 50 см³ и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C.

Сухой остаток каждой фракции растворяют в 1 см³ ацетонитрила для ВЭЖХ, обрабатывая колбы в ультразвуковой ванне в течение 30 секунд, и хроматографируют.

Определяют фракции, содержащие флорасулам, полноту смывания с картриджа и необходимый объем элюента.

Изучение поведения флорасулама на концентрирующих картриджах проводят каждый раз при отработке методики или поступлении новой партии картриджей.

9.6 Подготовка и кондиционирование колонки для жидкостной хроматографии.

Хроматографическую колонку с предколонкой устанавливают в термостате хроматографа и стабилизируют при температуре плюс 25 °C 3 - 4 часа.

9.7 Контроль стабильности градуировочной характеристики.

Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

Контроль стабильности градуировочной характеристики для флорасулама проводят при смене основных градуировочных растворов N 1 и 2 каждые 14 суток.

При контроле стабильности градуировочной характеристики проводят измерения не менее трех образцов концентраций для градуировки, содержание флорасулама в которых должно охватывать весь диапазон концентраций градуировочных характеристик.

Градуировочная характеристика считается стабильной, если для каждого из используемого для контроля градуировочного раствора сохраняется соотношение (1):

где X - концентрация флорасулама контрольного измерения, мкг/см³;

C - известная концентрация градуировочного раствора флорасулама в ацетонитриле, взятая для контроля стабильности градуировочной характеристики, мкг/см³;

10 - погрешность градуировочной характеристики, %.

Если величина расхождения (A) превышает указанные значения, делают вывод о невозможности применения градуировочной характеристики для дальнейших измерений. В этом случае выясняют и устраняют причины нестабильности градуировочной характеристики и повторяют контроль ее стабильности с использованием других градуировочных растворов флорасулама, предусмотренных методиками измерений. При повторном обнаружении нестабильности градуировочной характеристики определяют ее заново согласно п. 9.4.

10.1. Экстракция.

Образец корнеплодов свеклы или ботвы свеклы массой 10 г помещают в коническую плоскодонную колбу на 250 см³, добавляют 60 см³ ацетонитрила (х.ч.) и помещают на 15 минут в ультразвуковую ванну, после чего фильтруют при помощи воронки Бюхнера через фильтр красная лента. Экстракцию повторяют еще раз, переливают экстракт вместе с пробой (не отстаивая) в воронку Бюхнера, и фильтруют, объединяя экстракты. Фильтр в воронке дополнительно промывают 15 см³ ацетонитрила, также объединяя фильтрат с остальным экстрактом.

10.2 Подготовка экстракта для определения флорасулама.

Полученный экстракт (п. 10.1) упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре водяной бани плюс 40 °C досуха.

10.3 Очистка полученного экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей

К экстракту (п. 10.2) приливают 50 см³ 0,01 М соляной кислоты (п. 9.2.1.1), обрабатывают в ультразвуковой ванне в течение 30 сек, после чего переносят в делительную воронку объемом 250 см³. Далее приливают 30 см³ хлористого метилена и экстрагируют интенсивным встряхиванием в течение 2 минут. Жидкости в воронке дают расслоиться и отбирают нижний слой в колбу концентратор объемом 100 см³. Экстракцию повторяют еще дважды 30 см³ хлористого метилена, экстракты объединяют и упаривают на ротационном вакуумном испарителе досуха при температуре водяной бани плюс 40 °C. В случае плохого разделения фаз в водный экстракт можно добавить хлорид натрия.

10.4. Очистка полученного экстракта при помощи твердофазной экстракции

К экстракту в концентраторе (п. 10.3) добавляют 1 см³ ацетона, обрабатывают концентратор 30 секунд в ультразвуковой ванне, затем с приливают в концентратор 5 см³ гексана, обмывают стенки концентратора и вносят раствор на подготовленный картридж (п. 9.5.2). Элюат отбрасывают, картридж не обсушивают.

Далее на картридж наносят последовательно 5 см³ смеси гексана и ацетона 9:1 (п. 9.2.1.3) и 5 см³ смеси гексана и ацетона 5:1 (п. 9.2.1.4), элюаты отбрасывают.

Флорасулам смывают 3 см³ смеси гексана и ацетона 1:1 (п. 9.2.1.2), собирают элюат в концентратор объемом 50 см³ и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C.

Сухой остаток растворяют в 1 см³ ацетонитрила для ВЭЖХ, обрабатывают концентратор в ультразвуковой ванне в течение 30 секунд и переносят экстракт в хроматографическую виалу объемом 2 см³ для последующего хроматографирования.

10.4. Условия хроматографирования указаны в таблице 10.4.

11.1. Для обработки результатов хроматографического анализа используется компьютерное программное обеспечение химического анализа, которое входит в хроматографическую систему:

где X - содержание флорасулама в пробе, мг/кг;

C - концентрация флорасулама в экстракте, мкг/см³ (рассчитана при помощи программного обеспечения хроматографической системы);

m - масса анализируемого образца, г.

Результат округляют до четвертого знака после запятой.

11.2. Альтернативная обработка результатов.

Содержание флорасулама в пробах рассчитывают по формуле:

где X - содержание флорасулама в пробе, мг/кг;

S_ст - высота (площадь) пика стандарта, е.о.п. x сек;

S_пр - высота (площадь) пика образца, е.о.п. x сек;

A - концентрация стандартного раствора, мкг/см³;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, см³;

m - масса анализируемого образца, г (см³).

Результат округляют до четвертого знака после запятой.

12.1. За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (4):

где X₁, X₂ - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости (таблица 3.1), при этом .

12.2. При невыполнении условия (4) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

13.1. Результат анализа представляют в виде:

где - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

- граница абсолютной погрешности, мг/кг;

где - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, таблица 3.1), %.

В случае если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

14.1. Контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-(1 - 6). Периодичность и формы контроля определяется руководством по качеству.

1. Федеральный закон от 30.03.1999 N 52-ФЗ "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения".

2. СанПиН 1.2.3685-21 "Гигиенические нормативы и требования к обеспечению безопасности и (или) безвредности для человека факторов среды обитания".

3. Унифицированные правила отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов, утвержденные заместителем Главного государственного санитарного врача СССР 21.08.1979 N 2051-79.

4. ГОСТ Р 53228 "Национальный стандарт Российской Федерации. Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания".

5. ГОСТ 1770 "Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия".

6. ГОСТ 29227 "Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования".

7. ГОСТ 1770 "Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия".

8. ГОСТ 25336 "Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры".

9. ГОСТ 12026 "Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия".

10. ГОСТ 8682 "Посуда лабораторная стеклянная. Шлифы конические взаимозаменяемые".

11. ГОСТ 9147 "Посуда и оборудование лабораторные фарфоровые. Технические условия".

12. ГОСТ 34037 "Упаковка стеклянная для химических реактивов и особо чистых химических веществ. Общие технические условия".

13. ГОСТ Р 58144 "Вода дистиллированная. Технические условия".

14. ГОСТ Р 52501 "Вода для лабораторного анализа. Технические условия".

15. ГОСТ 61 "Реактивы. Кислота уксусная. Технические условия".

16. ГОСТ 4233 "Реактивы. Натрий хлористый. Технические условия".

17. ГОСТ 3118 "Реактивы. Кислота соляная. Технические условия".

18. ГОСТ 12.1.007 "Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности".

19. ГОСТ Р 12.1.019 "Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты".

20. ГОСТ 12.1.004 "Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования".

21. ГОСТ 12.0.004 "Система стандартов безопасности труда. Организация обучения безопасности труда. Общие положения".

22. ГОСТ 33884 "Свекла сахарная. Технические условия".