"МУК 4.1.3787-22. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств амикарбазона и его метаболитов в воде, почве, зеленой массе, зерне и масле кукурузы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 20.10.2022)

1. Разработаны ФГБНУ "Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений" (Т.Д. Черменская, М.О. Петрова, И.А. Цибульская); ООО "Инновационный центр защиты растений" (Алексеев Е.Ю.).

2. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 20 октября 2022 г.

3. Введены впервые.

1.1. Настоящие методические указания (далее - МУК) устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (далее - ВЭЖХ) для определения массовой концентрации амикарбазона и его метаболитов в воде в диапазоне концентраций (0,002 - 0,02) мг/дм³, почве, зеленой массе, зерне и масле кукурузы в диапазоне концентраций (0,05 - 0,5) мг/кг.

1.2. МУК предназначены для органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, осуществляющих контроль качества и безопасности объектов окружающей среды, продовольственного сырья и пищевых продуктов, а также могут быть использованы организациями, аккредитованными на проведение исследований продовольственного сырья, пищевой продукции.

1.3. МУК носят рекомендательный характер.

2.1. Амикарбазон. 4-амино-N-трет-бутил-4,5-дигидро-3-изопропил-5-оксо-1,2,4-1H-триазол-1-карбоксамид <1>. Молекулярная масса: 241,3. Брутто формула: C₁₀H₁₉N₅O₂.

--------------------------------

<1> В соответствии с Международным союзом теоретической и прикладной химии (далее - ИЮПАК, англ. International Union of Pure and Applied Chemistry, IUPAC).

Бесцветные кристаллы. Температура плавления плюс 137,5 °C. Давление пара (плюс 20 °C) 1,3 x 10^-6 Па. Растворимость в воде: (плюс 20 °C, pH 4 - 9) 4,6 г/дм³.

Коэффициент распределения в системе н-октанол/вода K_ow log P = 1,18 - 1,23 (плюс 20 °C, pH 4 - 9). Подвержен гидролизу в щелочных условиях - ДТ₅₀ 64 дня (при плюс 20 °C, pH 9), стабилен при pH 5 - 7. В почве ДТ₅₀ 50 дней (в аэробных условиях). Фотолиз в почве ДТ₅₀ 54 дня.

Основные метаболиты: дезаминоамикарбазон и изопропил-2-гидрокси-дезаминоамикарбазон.

Краткая токсикологическая характеристика. Острая пероральная токсичность (ЛД₅₀) для крыс - 1015 мг/кг; острая кожная токсичность (ЛД₅₀) для крыс более 2000 мг/кг; острая ингаляционная токсичность (ЛК₅₀) (4 ч) для крыс - 2,42 мг/л воздуха. Раздражающее действие: кожа - не раздражает; глаза - не раздражает. Нет мутагенной, тератогенной, онкогенной активности.

Гербицид для борьбы с однолетними двудольными сорняками в кукурузе при внесении в почву с нормой расхода <= 500 г/га, а также для борьбы с однолетними двудольными и травянистыми сорняками в сахарном тростнике с нормой расхода <= 1000 г/га. Ингибитор фотосинтеза.

2.2. Дезаминоамикарбазон. N-трет-бутил-4,5-дигидро-3-изопропил-5-оксо-1,2,4-1H-триазол-1-карбоксамид <2>. Молекулярная масса: 226,3. Брутто формула: C₁₀H₁₈N₄O₂.

--------------------------------

<2> В соответствии с ИЮПАК.

Бесцветные кристаллы. Температура плавления плюс (203 - 205) °C. Растворимость: слабо растворим в хлороформе, диметилсульфоксиде, метаноле.

2.3. Изопропил-2-гидрокси-дезаминоамикарбазон. N-трет-бутил-4,5-дигидро-3-(2-гидроксипропан-2-ил)-5-оксо-1,2,4-1H-триазол-1-карбоксамид <3>. Молекулярная масса: 242,3. Брутто формула: C₁₀H₁₈N₄O₃.

--------------------------------

<3> В соответствии с ИЮПАК.

Вещество белого цвета. Температура плавления: (191 - 193) °C. Растворимость: слабо растворим в диметилсульфоксиде и метаноле.

3.1. При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 3.1 - 3.6, для соответствующих диапазонов концентраций.

4.1. Метод основан на определении амикарбазона и его метаболитов методом ВЭЖХ с использованием ультрафиолетового (далее - УФ) детектора после извлечения из образцов ацетонитрилом и очистке ацетонитрильных экстрактов на сорбенте и патронах для твердофазной экстракции. Для извлечения веществ из образцов воды используют патроны для твердофазной экстракции. Идентификация амикарбазона и его метаболитов проводится по времени удерживания, количественное определение - методом абсолютной калибровки. Избирательность метода обеспечивается сочетанием условий подготовки проб и хроматографирования.

5.1. При выполнении измерений и подготовке проб применяют средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы, приведенные в табл. 5.1 - 5.3.

Примечание: Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание: Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.

Примечание: Допускается использование вспомогательных средств измерений, устройств и материалов с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

6.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать технику безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также технику безопасности, изложенную в технической документации на жидкостный хроматограф.

6.2. Помещение должно соответствовать пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004.

6.3. При работе с газами, находящимися в баллонах под давлением до 15 МПа (150 кгс/см²), необходимо соблюдать нормы и правила <4>. Запрещается открывать вентиль баллона, не установив в нем понижающий редуктор.

--------------------------------

<4> Приказ Ростехнадзора от 15.12.2020 N 536 "Об утверждении федеральных норм и правил в области промышленной безопасности "Правила промышленной безопасности при использовании оборудования, работающего под избыточным давлением" (зарегистрирован Минюстом России 31.12.2020, регистрационный N 61998).

6.4. Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист, имеющий опыт работы на жидкостном хроматографе, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментальное соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений.

7.1. При выполнении измерений выполняют следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха плюс (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Отбор проб производится в соответствии с методическими документами <5>.

--------------------------------

<5> Унифицированные правила отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов, утвержденные заместителем Главного государственного санитарного врача СССР 21.08.1979 N 2051-79; ГОСТ 31861 "Межгосударственный стандарт. Вода. Общие требования к отбору проб"; ГОСТ Р 58595 "Национальный стандарт Российской Федерации. Почвы. Отбор проб"; ГОСТ 10852 "Межгосударственный стандарт. Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб"; ГОСТ 13634 "Межгосударственный стандарт. Кукуруза свежая в початках.

Для длительного хранения зерно кукурузы подсушивают при комнатной температуре в отсутствие прямого солнечного света. Сухие образцы могут храниться в течение года. Перед анализом пробы доводят до стандартной влажности и измельчают. Зеленую массу хранят в полиэтиленовой таре в морозильнике при температуре минус 18 °C до анализа. Пробы масла хранят в холодильнике при плюс (0 - 4) °C в герметично закрытой стеклянной таре не более 2-х месяцев.

8.1. Очистка органических растворителей.

Растворители, используемые для анализа, специальной подготовки не требуют. Рекомендуется проверить чистоту применяемых растворителей. При обнаружении примесей, которые могут мешать определению, растворители очищают общепринятыми методами.

8.2. Кондиционирование колонки.

Перед началом анализа аналитическую колонку кондиционируют в потоке подвижной фазы (0,5 - 1,0) см³/мин до стабилизации нулевой линии.

8.3. Кондиционирование патронов для твердофазной экстракции.

8.3.1. Патрон N 1.

Патрон промывают 2,5 см³ ацетонитрила, затем 3 см³ воды.

8.3.2. Патрон N 2.

Патрон промывают 2 см³ метанола, 2,5 см³ этилацетата, 3 см³ элюента N 3.

8.4. Приготовление растворов.

8.4.1. 0,005М раствор ортофосфорной кислоты: (0,5 +/- 0,01) г 98% ортофосфорной кислоты помещают в мерную колбу объемом 1 дм³, растворяют в деионизованной воде и доводят объем до метки.

8.4.2. Для приготовления подвижной фазы для ВЭЖХ в мерную колбу вместимостью 1000 см³ помещают 400 см³ ацетонитрила и доводят до метки 0,005М раствором ортофосфорной кислоты.

8.4.3. Приготовление элюента N 1. Воду и ацетонитрил смешивают в соотношении 9:1 по объему, используя мерные цилиндры.

8.4.4. Приготовление элюента N 2. Воду и ацетонитрил смешивают в соотношении 1:2 по объему, используя мерные цилиндры.

8.4.5. Приготовление элюента N 3. Гексан и этилацетат смешивают в соотношении 1:1 по объему, используя мерные цилиндры.

8.4.6. Приготовление элюента N 4. Этилацетат и метанол смешивают в соотношении 1:1 по объему, используя мерные цилиндры.

Растворы хранят в темном месте (в емкости из темного стекла) не более 14 дней.

8.5. Приготовление основного и градуировочных растворов.

8.5.1. Основной раствор амикарбазона и его метаболитов с концентрацией 0,5 мг/см³. Точную навеску амикарбазона, дезаминоамикарбазона и изопропил-2-гидрокси-дезаминоамикарбазона по (50 +/- 0,5) мг помещают в мерную колбу вместимостью 100 см³, растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом.

8.5.2. Приготовление градуировочных растворов.

Градуировочные растворы с концентрациями амикарбазона и его метаболитов 0,05, 0,1, 0,2, 0,5 и 1,0 мкг/см³ соответственно готовят методом последовательного разбавления по объему, используя подвижную фазу.

8.5.2.1. Раствор N 1 с концентрацией 1,0 мкг/см³ в мерную колбу вместимостью 100 см³ вносят 0,2 см³ основного раствора амикарбазона и его метаболитов и доводят до метки подвижной фазой.

8.5.2.2. Раствор N 2 с концентрацией 0,5 мкг/см³ в мерную колбу вместимостью 10 см³ вносят 5,0 см³ раствора N 1 и доводят до метки подвижной фазой.

8.5.2.3. Раствор N 3 с концентрацией 0,2 мкг/см³ в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 2,0 см³ раствора N 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

8.5.2.4. Раствор N 4 с концентрацией 0,1 мкг/см³ в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 1,0 см³ раствора N 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

8.5.2.5. Раствор N 4 с концентрацией 0,05 мкг/см³ в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 1,0 см³ раствора N 2 и доводят объем до метки подвижной фазой.

Основной раствор амикарбазона и его метаболитов можно хранить в холодильнике при температуре плюс 0 - 4 °C в течение 6 месяцев, градуировочные растворы - в течение недели.

При изучении полноты определения амикарбазона и его метаболитов используют ацетонитрильные растворы веществ, приготовленные из основного раствора методом последовательного разбавления по объему ацетонитрилом.

8.6. Построение градуировочного графика.

Для установления градуировочной характеристики (площадь пика - концентрация амикарбазона и его метаболитов в растворе) в хроматограф вводят по 20 мм³ градуировочных растворов (не менее 3-х параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4-х точек по диапазону измеряемых концентраций). Затем измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации амикарбазона и его метаболитов в градуировочном растворе.

Методом наименьших квадратов рассчитывают градуировочный коэффициент (K) в уравнении линейной регрессии:

где S - площадь пика градуировочного раствора.

Градуировку признают удовлетворительной, если значение коэффициента линейной корреляции оказывается не ниже 0,99.

Градуировочную характеристику следует проверять перед началом измерений.

Градуировочную характеристику необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы, а также при отрицательном результате контроля градуировочного коэффициента.

Градуировочную зависимость признают стабильной при выполнении следующего условия:

где C - аттестованное значение массовой концентрации амикарбазона и его метаболитов в градуировочном растворе;

C_K - результат контрольного измерения массовой концентрации амикарбазона и его метаболитов в градуировочном растворе;

- норматив контроля градуировочного коэффициента, % ( при P = 0,95).

9.1. Определение амикарбазона и его метаболитов в воде.

Пробу воды (50 см³) вносят на подготовленный патрон N 1 (п. 8.3.1). Промывают патрон 5 см³ элюента N 1. Амикарбазон и метаболиты элюируют 6 см³ элюента N 2, элюат собирают в круглодонную колбу емкостью 25 см³ и упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C. Сухой остаток растворяют в 1 см³ подвижной фазы и анализируют по п. 9.5.

9.2. Определение амикарбазона и его метаболитов в почве.

Навеску измельченной матрицы 10 г помещают в полипропиленовую центрифужную пробирку вместимостью 50 см³ и добавляют 20 см³ ацетона. Пробирку плотно закрывают, помещают в перемешивающее устройство на 10 мин, затем центрифугируют. Из объединенного экстракта отбирают аликвоту, соответствующую 2 г, переносят в круглодонную колбу и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше плюс 40 °C. Сухой остаток растворяют в 1 см³ подвижной фазы и анализируют по п. 9.5.

9.3. Определение амикарбазона и его метаболитов в зеленой массе, зерне и масле кукурузы.

Навеску измельченной матрицы (или масла) (10 г) помещают в полипропиленовую центрифужную пробирку вместимостью 50 см³, последовательно добавляют 10 см³ ацетонитрила, 4 г безводного сульфата магния, 1 г хлористого натрия, 1 г лимоннокислого натрия трехзамещенного 2-водного и 0,5 г лимоннокислого натрия двузамещенного 1,5-водного. Для проб зерна добавляют 7 см³ воды, для проб масла - 3 см³. Пробирку плотно закрывают и помещают в перемешивающее устройство на 10 мин, затем центрифугируют в течение 10 мин при 4000 об/мин. От верхнего ацетонитрильного слоя отбирают 5 см³, переносят в центрифужную пробирку вместимостью 15 см³, содержащую 125 мг графитизированной сажи. 250 мг сорбента C18EC и 750 мг безводного сульфата магния. Пробирку плотно закрывают и помещают в перемешивающее устройство на 10 мин, затем центрифугируют в течение 10 мин при 4000 об/мин. От верхнего ацетонитрильного слоя отбирают 2 см³ и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше плюс 40 °C. Сухой остаток растворяют в 1 см³ подвижной фазы и анализируют по п. 9.5. Пробы зеленой массы дополнительно очищают на патронах для твердофазной экстракции N 2 по п. 9.4.

9.4. Очистка на патроне для твердофазной экстракции N 2.

Сухой остаток, полученный по п. 9.3, растворяют в 1 см³ элюента N 3, наносят на предварительно кондиционированный патрон (п. 8.3.2), колбу ополаскивают еще 1 см³ элюента N 3 и также наносят на патрон. Патрон промывают 5 см³ элюента N 3, элюат отбрасывают. Амикарбазон и метаболиты элюируют 5 см³ этилацетата и 6 см³ элюата N 4, элюат собирают, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не более плюс 40 °C. Сухой остаток растворяют в 1 см³ подвижной фазы и анализируют по п. 9.5.

9.5. Условия хроматографирования.

Жидкостный хроматограф с УФ детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки. Аналитическая колонка, заполненная сорбентом с привитыми монофункциональными полярными группами C18 (250 x 4,6) мм, 5 мкм. Температура колонки плюс (25 +/- 1) °C. Подвижная фаза: смесь ацетонитрила и 0,005М ортофосфорной кислоты в соотношении 40:60. Скорость потока элюента 1 см³/мин. Рабочая длина волны УФ-детектора 220 нм. Объем вводимой пробы 20 мм³.

10.1. Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки. Содержание амикарбазона и его метаболитов в пробе X (мг/кг, мг/дм³) вычисляют по формуле:

где A - концентрация вещества, найденная по градуировочному графику в соответствии с величинами площадей хроматографических пиков, мкг/см³;

f - полнота извлечения амикарбазона и его метаболитов, приведенная в табл. 3.4 - 3.6, %;

V - объем пробы, подготовленной для хроматографического анализа, см³ (1 см³);

P - навеска анализируемого образца, г, см³ (аликвота, равная 2 г, вода 50 см³).

Содержание остаточных количеств амикарбазона и его метаболитов в образце вычисляют как среднее из двух параллельных определений.

Образцы, дающие пики, большие, чем стандартный раствор амикарбазона и его метаболитов с концентрацией 1,0 мкг/см³, разбавляют подвижной фазой.

11.1. За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:

где X₁, X₂ - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости (приведен в табл. 1).

При невыполнении условия выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

12.1. Результат анализа представляют в виде:

где X - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

- граница абсолютной погрешности, мг/кг;

где - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, приведена в табл. 3.1 - 3.3), %.

В случае если содержание компонента меньше нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

содержание вещества в пробе "менее нижней границы определения",

например: менее 0,05 мг/кг*, где * - предел определения амикарбазона и его метаболитов в масле кукурузы.

13.1. Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6.

Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

Величина добавки C_д должна удовлетворять условию:

где - характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно), мг/кг (мг/дм³); при этом:

где - граница абсолютной погрешности, мг/кг (мг/дм³):

где - граница относительной погрешности методики (показатель точности, приведен в табл. 3.1 - 3.3), %.

Результат контроля процедуры K_к рассчитывают по формуле:

где - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11.1) содержания компонента в образце с добавкой, мг/кг;

X_ср - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11.1) содержания компонента в испытуемом образце, мг/кг;

C_д - величина добавки, мг/кг.

Норматив контроля K рассчитывают по формуле:

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (K_к) с нормативом контроля (K).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию:

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении этого условия процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

где X₁, X₂ - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;

R - предел воспроизводимости (приведен в табл. 3.1 - 3.3), %.

1. Федеральный закон от 30.03.1999 N 52-ФЗ "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения".

2. Приказ Ростехнадзора от 15.12.2020 N 536 "Об утверждении федеральных норм и правил в области промышленной безопасности "Правила промышленной безопасности при использовании оборудования, работающего под избыточным давлением".

3. Унифицированные правила отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов утвержденные заместителем Главного государственного санитарного врача СССР 21.08.1979 N 2051-79 от 21.08.1979.

4. ГОСТ Р ИСО 5725-1-6 "Государственный стандарт Российской Федерации. Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Части 1 - 6".

5. ГОСТ 12.1.007 "Межгосударственный стандарт. Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности".

6. ГОСТ 12.1.019 "Межгосударственный стандарт. Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты".

7. ГОСТ 12.1.004 "Межгосударственный стандарт. Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования".

8. ГОСТ 12.4.009 "Межгосударственный стандарт. Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание".

9. ГОСТ 12.0.004 "Межгосударственный стандарт. Система стандартов безопасности труда. Организация обучения безопасности труда. Общие положения".

10. ГОСТ Р 53228 "Национальный стандарт Российской Федерации. Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания".

11. ГОСТ Р 52501 "Национальный стандарт Российской Федерации. Вода для лабораторного анализа. Технические условия".

12. ГОСТ 6552 "Межгосударственный стандарт. Реактивы. Кислота ортофосфорная. Технические условия".

13. ГОСТ 4233 "Межгосударственный стандарт. Реактивы. Натрий хлористый. Технические условия".

14. ГОСТ 6995 "Государственный стандарт союза ССР. Реактивы. Метанол-яд. Технические условия".

15. ГОСТ 22300 "Межгосударственный стандарт. Реактивы. Эфиры этиловый и бутиловый уксусной кислоты. Технические условия".

16. ГОСТ 25336 "Межгосударственный стандарт. Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры".

17. ГОСТ 1770 "Межгосударственный стандарт. Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия".

18. ГОСТ 31861 "Межгосударственный стандарт. Вода. Общие требования к отбору проб".

19. ГОСТ Р 58595 "Национальный стандарт Российской Федерации. Почвы. Отбор проб".

20. ГОСТ 10852 "Межгосударственный стандарт. Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб".

21. ГОСТ 13634 "Межгосударственный стандарт. Кукуруза свежая в початках. Технические условия".

22. ГОСТ 8808 "Межгосударственный стандарт. Масло кукурузное. Технические условия".