"МУК 4.1.3556-19. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств диклосулама в воде, почве, зерне и масле сои методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 09.10.2019)

1. Разработаны ФГБНУ "Всероссийский научно-исследовательский институт фитопатологии" (Р.А. Стрелецкий, В.В. Демин, О.Д. Микитюк).

2. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 9 октября 2019 г.

3. Введены впервые.

1.1. Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии с УФ-детектированием для определения массовых концентраций диклосулама в воде в диапазоне 0,001 - 0,010 мг/дм³ и в почве в диапазоне 0,01 - 0,1 мг/кг, а также уровня их остаточных количеств в зерне и масле сои в диапазоне 0,01 - 0,1 мг/кг.

1.2. Методические указания предназначены для органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, осуществляющих контроль качества и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов, а также могут быть использованы организациями, аккредитованными в установленном порядке на проведение исследований продовольственного сырья, пищевых продуктов.

1.3. Методические указания носят рекомендательный характер.

2.1. Диклосулам.

2,6-дихлор-5-этокси-7-фтор[1,2,4,]триазол[1,5-с]пиримидин-2-сульфоанилид

Эмпирическая формула: C₁₃H₁₀Cl₂FN₅O₃S.

Молекулярная масса: 406,22.

Агрегатное состояние: порошок.

Цвет, запах: белого цвета.

Давление паров: 6,67 x 10^-10 мПа (25 °C).

Коэффициент распределения октанол/вода (при pH 7, 20 °C): logP = 0,85.

Температура плавления: 220 °C.

Растворимость в воде (мг/дм³, 20 °C): 6,32.

Растворимость в органических растворителях (мг/дм³, при 20 °C): ацетон - 7970; ацетонитрил - 4590; метилен хлористый - 2170; этилацетат - 1450; метанол - 813; октанол - 44,2; толуол - 58,8.

Стабильность в водных растворах - нет данных.

ДТ₅₀ в почве: 49 суток.

Краткая токсикологическая характеристика: диклосулам относится к малоопасным веществам по острой пероральной (ЛД₅₀ для крыс более 5000 мг/кг) и по дермальной токсичности (ЛД₅₀ для кроликов более 2000 мг/кг массы тела) и к умеренно опасным веществам по ингаляционной токсичности (ЛК₅₀ для крыс (4 часа) более 5,04 мг/м³).

Препарат обладает системным действием, проникая через корни и листья, ингибирует активность ацетолактатсинтазы (ALS) и подавляет синтез разветвленных аминокислот - лейцина, валина, изолейцина.

Метод основан на определении диклосулама с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием ультрафиолетового детектора (ВЭЖХ-УФ).

Определение диклосулама в воде проводится после его экстракции хлористым метиленом из подкисленного образца воды.

Определение диклосулама в почве проводится после его экстракции смесью ацетона с водой, очистки и концентрирования в системе несмешивающихся растворителей, очистки на концентрирующих патронах C18 и дополнительного концентрирования.

Определение диклосулама в зерне сои проводится после его экстракции подкисленным ацетонитрилом, очистки и концентрирования в системе несмешивающихся растворителей, очистки на концентрирующих патронах C18 и дополнительного концентрирования.

Определение диклосулама в масле сои проводится после его экстракции ацетонитрилом, очистки и концентрирования в системе несмешивающихся растворителей, очистки на концентрирующих патронах C18 и дополнительного концентрирования.

Идентификация диклосулама проводится по времени удерживания. Концентрацию диклосулама определяют по площадям соответствующих хроматографических пиков на хроматограммах по методу абсолютной калибровки.

В предлагаемых условиях анализа метод специфичен. Специфичность обеспечивается подбором колонки и условий программирования.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1, для соответствующих диапазонов концентраций.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительные интервалы среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в табл. 2.

Примечание. Допускается использование средств измерений с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание. Допускается использование реактивов иных производителей с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание. Допускается применение оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

5.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ Р 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на прибор.

5.2. Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать гигиенических нормативов <1>.

--------------------------------

<1> ГН 2.2.5.3532-18 "Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны"; ГН 2.2.5.2308-07 "Ориентировочные безопасные уровни воздействия (ОБУВ) вредных веществ в воздухе рабочей зоны".

6.1. К выполнению измерений и обработке их результатов допускаются специалисты, имеющие опыт работы в химической лаборатории, прошедшие обучение и владеющие техникой проведения анализа, освоившие метод анализа в процессе тренировки и уложившиеся в нормативы контроля при проведении процедуры контроля погрешности анализа.

7.1. При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C, относительной влажности не более 80% и нормальном атмосферном давлении;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе с УФ-детектором проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Выполнению измерений предшествуют следующие операции: очистка растворителей (при необходимости), приготовление растворов, кондиционирование хроматографической колонки, установление градуировочных характеристик.

Ацетонитрил, содержащий воду, предварительно осушают, добавляя в него гранулированный безводный хлористый кальций из расчета не менее 100 г/дм³. Выдерживают его над осушителем в течение 5 - 6 часов. Затем ацетонитрил сливают с осушителя в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 см³ аппарата для перегонки растворителей. Перегоняют и собирают фракции, отогнанные при температуре 81,5 °C.

Дистиллированную воду помещают в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 см³ от аппарата для перегонки растворителей, добавляют к ней марганцовокислый калий из расчета 1 г/дм³ и кипятят в течение 6 часов.

Собирают фракции, отогнанные при температуре 100,0 °C.

Хлористый метилен промывают равным объемом 5% раствора натрия углекислого (безводного), осушают, добавляя в него гранулированный безводный хлористый кальций из расчета не менее 100 г/дм³. Хлористый метилен выдерживают над осушителем в течение 12 - 24 часов. Затем хлористый метилен сливают с осушителя в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 см³ аппарата для перегонки растворителей. Перегоняют и собирают фракции, отогнанные при температуре 40,0 °C.

8.2.1.1. Приготовление 0,05% водного раствора уксусной кислоты.

В мерную колбу объемом 1 дм³ помещают 500 см³ бидистиллированной воды, прибавляют 0,5 см³ уксусной кислоты, перемешивают, объем доводят до метки бидистиллированной водой.

8.2.1.2. Приготовление 0,05% раствора уксусной кислоты в ацетонитриле.

В мерную колбу объемом 1 дм³ помещают 500 см³ ацетонитрила, прибавляют 0,5 см³ уксусной кислоты, перемешивают, объем доводят до метки ацетонитрилом.

8.2.2.1. Приготовление 5% раствора натрия углекислого.

В мерную колбу на 1000 см³ переносят 50 г гидрокарбоната натрия, добавляют 200 - 300 см³ дистиллированной воды, перемешивают до полного растворения и доводят водой объем в колбе до метки.

8.2.2.2. Приготовление подкисленного ацетонитрила для экстракции.

В мерную колбу объемом 1 дм³ помещают 500 см³ ацетонитрила, прибавляют 50,0 см³ уксусной кислоты, перемешивают, объем доводят до метки ацетонитрилом.

8.2.2.3. Приготовление 6 М раствора соляной кислоты.

Мерным цилиндром отбирают 246 см³ концентрированной соляной кислоты и осторожно переносят в мерную колбу на 500 см³, куда предварительно наливают около 100 см³ дистиллированной воды. Затем раствор перемешивают и после охлаждения доводят водой объем в колбе до метки (при приготовлении раствора соблюдать осторожность и работать под тягой).

8.2.2.4. Приготовление 80% раствора ацетона в воде.

В мерную колбу объемом 1 дм³ помещают 800 см³ ацетона, прибавляют 200 см³ дистиллированной воды, перемешивают, объем доводят до метки ацетоном.

8.2.2.5. Приготовление 0,2 М водного раствора муравьиной кислоты.

В мерную колбу объемом 1 дм³ помещают 500 см³ дистиллированной воды, прибавляют 7,5 см³ муравьиной кислоты, перемешивают, объем доводят до метки дистиллированной водой.

8.2.2.6. Приготовление 10%-го раствора ацетонитрила в 0,2 М муравьиной кислоте.

В мерную колбу объемом 250 см³ помещают 100 см³ 0,2 М муравьиной кислоты, прибавляют 25 см³ ацетонитрила, перемешивают, объем доводят до метки 0,2 М муравьиной кислотой.

8.2.2.7. Приготовление 50%-го раствора ацетонитрила в воде.

В мерную колбу объемом 1 дм³ помещают 500 см³ ацетонитрила, доводят объем до метки дистиллированной водой и перемешивают.

8.2.2.8. Приготовление 5%-го раствора этилацетата в гексане.

В мерную колбу объемом 500 см³ помещают 250 см³ гексана, прибавляют 25 см³ этилацетата, перемешивают и доводят объем до метки гексаном.

8.2.2.9. Приготовление насыщенного раствора хлорида натрия.

В стеклянную бутыль с завинчивающейся крышкой объемом 1 дм³ помещают 250 граммов хлорида натрия, прибавляют 500 см³ дистиллированной воды, перемешивают и дают настояться в течение суток.

8.2.2.10. Приготовление ацетонитрила, насыщенного гексаном.

В делительную воронку объемом 1 дм³ помещают 500 см³ ацетонитрила и 100 см³ гексана. Интенсивно встряхивают в течение 2 минут, дают расслоиться и отбирают нижний ацетонитрильный слой.

8.2.2.11. Приготовление 0,05 М водного раствора гидрофосфата натрия.

В мерную колбу на 1000 см³ переносят 17,91 г гидрофосфата натрия, добавляют 200 - 300 см³ дистиллированной воды, перемешивают до полного растворения и доводят водой объем в колбе до метки.

8.2.2.12. Приготовление 0,05 М водного раствора дигидрофосфата натрия.

В мерную колбу на 1000 см³ переносят 7,8 г дигидрофосфата натрия, добавляют 200 - 300 см³ дистиллированной воды, перемешивают до полного растворения и доводят водой объем в колбе до метки.

8.2.2.13. Приготовление 0,05 М фосфатного буфера.

В мерную колбу объемом 1 дм³ помещают 500 см³ дистиллированной воды, прибавляют 30,5 см³ 0,05 М раствора гидрофосфата натрия (п. 8.2.2.11) и 19,5 см³ 0,5 М раствора дигидрофосфата натрия (п. 8.2.2.12), перемешивают и доводят до метки водой.

8.2.2.14. Приготовление 6 М раствора соляной кислоты.

Мерным цилиндром отбирают 246 см³ концентрированной соляной кислоты и осторожно переносят в мерную колбу на 500 см³, куда предварительно наливают около 100 см³ дистиллированной воды. Затем раствор перемешивают и после охлаждения доводят водой объем в колбе до метки (при приготовлении раствора соблюдать осторожность и работать под тягой).

8.2.3.1. Стандартный раствор N 1 с концентрацией диклосулама 1,0 мг/см³.

Взвешивают 10 мг диклосулама в мерной колбе объемом 10 см³. Навеску растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом. Полученный стандартный раствор N 1 используется для приготовления стандартных растворов для хроматографического исследования и установления градуировочной характеристики. Стандартный раствор N 1 хранится в холодильнике при температуре (+4 +/- 2) °C в течение 6 месяцев.

8.2.3.2. Стандартный раствор N 2 с концентрацией диклосулама 10,0 мкг/см³.

Из стандартного раствора N 1 отбирают пипеткой 1 см³ и помещают в мерную колбу объемом 100 см³. Доводят объем до метки ацетонитрилом при перемешивании. Стандартный раствор N 2 используется для для хроматографического исследования и установления градуировочной характеристики. Стандартный раствор N 2 хранят в холодильнике при температуре (+4 +/- 2) °C не более 2 месяцев.

8.2.3.3. Стандартный раствор N 3 с концентрацией диклосулама 2,5 мкг/см³.

Из стандартного раствора N 2 отбирают пипеткой 2,5 см³, помещают в мерную колбу объемом 10 см³ и доводят объем до метки ацетонитрилом. Стандартный раствор N 3 используется для установления градуировочной характеристики и хранится в холодильнике при температуре (+4 +/- 2) °C не более 30 суток.

8.2.3.4. Стандартный раствор N 4 с концентрацией диклосулама 1,0 мкг/см³.

Из стандартного раствора N 2 отбирают пипеткой 1 см³, помещают в мерную колбу объемом 10 см³ и доводят объем до метки ацетонитрилом. Стандартный раствор N 4 используется для установления градуировочной характеристики и хранится в холодильнике при температуре (+4 +/- 2) °C не более 30 суток.

8.2.3.5. Стандартный раствор N 5 с концентрацией диклосулама 0,5 мкг/см³.

Из стандартного раствора N 4 отбирают пипеткой 5 см³, помещают в мерную колбу объемом 10 см³ и доводят объем до метки ацетонитрилом. Стандартный раствор N 5 используется для установления градуировочной характеристики и хранится в холодильнике при температуре (+4 +/- 2) °C при температуре (+4 +/- 2) °C не более 30 суток.

8.2.3.6. Стандартный раствор N 6 с концентрацией диклосулама 0,2 мкг/см³.

Из стандартного раствора N 4 отбирают пипеткой 2 см³, помещают в мерную колбу объемом 10 см³ и доводят объем до метки ацетонитрилом. Стандартный раствор N 6 используется для установления градуировочной характеристики и хранится в холодильнике не более 30 суток.

8.2.3.7. Стандартные растворы диклосулама с концентрацией по 0,5; 0,2; 0,1; 0,05 мкг/см³ для внесения в контрольные образцы.

Методом последовательного разведения ацетонитрилом стандартного раствора N 2 готовят растворы, содержащие по 0,5; 0,2; 0,1; 0,05 мкг/см³ и используют эти растворы для внесения в контрольные образцы.

Градуировочную характеристику, выражающую отношение поглощения при длине волны 270 нм от концентрации диклосулама в растворе (мкг/см³), устанавливают путем определения соотношения площади пиков, отвечающих идентифицируемому компоненту, и концентрации аналитического стандарта по 4 растворам для установления градуировочной характеристики.

Градуировочную зависимость для определения диклосулама в воде, почве, зерне и масле сои устанавливают по 4 растворам для градуировки с концентрацией 0,2, 0,5, 1,0 и 2,5 мкг/см³, приготовленным согласно пп. 7.2.3.3 - 7.2.3.6.

В инжектор хроматографа вводят по 20 мм³ каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.4. Осуществляют не менее 5 параллельных измерений.

8.4.1. Подготовка концентрирующих патронов для очистки экстракта.

Все процедуры происходят с использованием вакуума, скорость потока растворов через патрон не должна превышать 1 капли/с.

Патрон C18 устанавливают в манифолд. Кондиционирование: концентрирующий патрон промывают 5 см³ ацетонитрила, затем 5 см³ 0,2 М водного раствора муравьиной кислоты (п. 8.2.2.5).

Не допускать высыхания поверхности патрона.

8.4.2. Проверка хроматографического поведения диклосулама на концентрирующих патронах C18.

В концентратор объемом 100 см³ вносят 1 см³ стандартного раствора диклосулама в ацетонитриле с концентрацией 1,0 мкг/см³ и упаривают его досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 60 °C.

Сухой остаток растворяют в 10 см³ 10% раствора ацетонитрила в 0,2 М муравьиной кислоте (п. 8.2.2.6), помещают концентратор на 2 минуты в ультразвуковую ванну, обмывают стенки концентратора и вносят раствор на подготовленный патрон. Элюат собирают в отдельный концентратор объемом 100 см³, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 60 °C.

На патрон вносят 5 см³ 10% раствора ацетонитрила в 0,2 М муравьиной кислоте и собирают элюат в отдельный концентратор объемом 100 см³, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 60 °C.

После этого на патрон вносят 6 см³ 50% раствора ацетонитрила в воде (п. 8.2.2.7), собирают элюат в отдельный концентратор объемом 100 см³, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 60 °C.

Сухой остаток каждой фракции растворяют в 1 см³ ацетонитрила, обрабатывая колбы в ультразвуковой ванне в течение 2 минут, и хроматографируют.

Определяют фракции, содержащие диклосулам, полноту смывания с патрона и необходимый объем элюента.

Изучение поведения диклосулама на концентрирующих патронах типа C18 проводят каждый раз при отработке методики или поступлении новой партии патронов.

Хроматографическую колонку с предколонкой устанавливают в термостате хроматографа и стабилизируют при температуре 25 °C 3 - 4 часа.

9.1. Отбор проб производится в соответствии с утвержденными требованиями <2>.

--------------------------------

<2> "Унифицированные правила отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" N 2051-79 от 21.08.1979, ГОСТ 31861-2012; ГОСТ 17.4.3.01-83; ГОСТ 28168-89; ГОСТ 17109-88; ГОСТ 10852-86; ГОСТ 31760-2012; 32190-2013.

Пробы воды хранят в стеклянной герметично закрытой таре в холодильнике при температуре (+4 +/- 2) °C не более 10 суток.

Для длительного хранения проб почвы почву подсушивают при комнатной температуре в отсутствие прямого солнечного света. Сухие почвенные образцы могут храниться в темной таре в течение года. Перед анализом сухую почву просеивают через сито с отверстиями диаметром 1 мм.

Зерна сои хранят в холодильнике в полиэтиленовых пакетах при температуре (+4 +/- 2) °C в течение суток. Для длительного хранения пробы подсушиваются, замораживают и хранят в морозильной камере при температуре -18 °C до 6 месяцев.

Масло сои хранят при температуре (+4 +/- 2) °C в стеклянных или пластиковых бутылях не более 30 суток.

10.1.1. Экстракция.

Пробу воды объемом 250 см³ помещают в делительную воронку объемом 500 см³. Добавляют 40 г хлорида натрия и растворяют его путем встряхивания. Подкисляют водную фазу 6 М соляной кислотой (п. 8.2.2.14) до значения pH 2.

Диклосулам экстрагируют тремя порциями хлористого метилена объемом по 40 см³ каждая, встряхивая делительную воронку каждый раз по 2 минуты. После полного разделения фаз в делительной воронке нижний слой (хлористый метилен) собирают в концентратор объемом 250 см³. Полученный экстракт упаривают до объема 20 см³ на ротационном вакуумном испарителе при температуре водяной бани 30 °C.

10.1.2. Подготовка экстракта для определения диклосулама.

Экстракт из концентратора (п. 10.1.1) переносят в остродонную колбу объемом 50 см³, затем обмывают концентратор 10 см³ хлористого метилена и присоединяют к экстракту в остродонной колбе, далее упаривают экстракт досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре водяной бани 30 °C. Сухой остаток растворяют в 1 см³ ацетонитрила, обрабатывая в ультразвуковой ванне в течение 2 минут, после чего пробу переносят в виалу объемом 2 см³ для автоматического дозатора проб и 20 мм³ вводят в хроматограф.

10.2.1. Экстракция.

При экстракции в каждую банку с пробой и растворителем помещается по 5 шариков для экстракции, которые перед центрифугированием удаляются.

Образец почвы массой 25 г помещают в полипропиленовую банку для экстракции и центрифугирования объемом 200 см³, добавляют 50 см³ 80% раствора ацетона в воде (п. 8.2.2.4) и помещают на 30 минут на аппарат для встряхивания проб. Затем пробу центрифугируют в течение 10 минут при скорости 4000 оборотов в минуту. Супернатант фильтруют через фильтр 0,45 микрон при помощи медицинского шприца объемом 50 см³ в концентратор объемом 250 см³. Экстракцию повторяют еще дважды, экстракты объединяют.

10.2.2. Подготовка экстракта для определения диклосулама.

Полученный экстракт (п. 10.2.1) упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре водяной бани 50 °C до полного улетучивания ацетона.

10.2.3. Очистка полученного экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей.

К водному остатку (п. 10.2.2) добавляют 15 см³ 0,05 М фосфатного буфера (п. 8.2.2.13), обрабатывают концентратор в ультразвуковой ванне в течение 2 минут и переносят экстракт в делительную воронку объемом 100 см³. В концентратор приливают еще 15 см³ 0,05 М фосфатного буфера, повторяют обработку в ультразвуковой ванне и присоединяют к экстракту в воронке. В воронку добавляется 10 см³ насыщенного хлорида натрия (п. 8.2.2.9). Экстракцию производят 20 см³ хлористого метилена при помощи интенсивного встряхивания в течение 2 минут. Жидкости в воронке дают расслоиться и отбирают нижний слой в колбу-концентратор объемом 100 см³. Экстракцию повторяют еще дважды, экстракты объединяют. Экстракт отгоняют на ротационном вакуумном испарителе досуха при температуре водяной бани 30 °C.

10.2.4. Очистка полученного экстракта при помощи твердофазной экстракции.

Экстракт (п. 10.2.3) растворяют в 10 см³ 10% раствора ацетонитрила в 0,2 М муравьиной кислоте (п. 8.2.1.6), обрабатывая в ультразвуковой ванне в течение 2 минут, и наносят на подготовленный концентрирующий патрон. Далее патрон промывают 5 см³ 10% раствора ацетонитрила в 0,2 М муравьиной кислоте. Диклосулам смывают 6 см³ 50% раствора ацетонитрила в воде (п. 8.2.1.7) в остродонную колбу объемом 50 см³. Для регенерации патрона с целью повторного использования его промывают 10 см³ ацетонитрила.

10.2.5. Дополнительное концентрирование и очистка экстракта.

Экстракт (п. 10.2.4) отгоняют на ротационном вакуумном испарителе при 60 °C до улетучивания ацетонитрила. К водному остатку приливают 10 см³ 0,2 М муравьиной кислоты (п. 8.2.2.5), обрабатывают в ультразвуковой ванне в течение 2 мин и помещают в делительную воронку объемом 50 см³. В отгонную колбу приливают еще 10 см³ 0,2 М муравьиной кислоты, повторяют обработку в ультразвуковой ванне и присоединяют к экстракту в воронке. Затем в воронку приливают 10 см³ этилацетата и производят экстракцию интенсивным встряхиванием в течение 2 мин. После расслоения фраз отбирают верхний органический слой в остродонную колбу объемом 50 см³. Экстракцию повторяют еще дважды, экстракты объединяют. Экстракт отгоняют на ротационном вакуумном испарителе досуха при температуре водяной бани 60 °C. Затем в колбу добавляют 1 см³ ацетонитрила и обрабатывают в ультразвуковой ванне в течение 2 мин. После этого экстракт переносится в хроматографическую виалу объемом 2 см³ для автоматического дозатора проб и 20 мм³ вводят в хроматограф.

10.3.1. Экстракция.

Образец измельченных зерен сои массой 25 г помещают в плоскодонную колбу объемом 250 см³, добавляют 100 см³ подкисленного ацетонитрила (п. 8.2.2.2) и помещают на 15 минут на аппарат для встряхивания проб с нагретой до 60 °C платформой. Экстракт отстаивают в течение 3 минут и фильтруют надосадочную жидкость через фильтр 0,45 микрон при помощи медицинского шприца объемом 50 см³ в колбу для концентрирования объемом 500 см³. Экстракцию повторяют еще дважды, экстракты объединяют. Остатки экстрагента извлекают из пробы при помощи центрифугирования в течение 10 мин при 4000 об/мин, надосадочную жидкость присоединяют к экстракту в колбе, также предварительно профильтровав.

10.3.2. Подготовка экстракта для определения диклосулама.

Полученный экстракт (п. 10.3.1) упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре водяной бани 60 °C.

10.3.3. Очистка полученного экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей.

К экстракту в концентраторе (п. 10.3.2) добавляют 20 см³ ацетонитрила, насыщенного гексаном (п. 8.2.2.10), обрабатывают в ультразвуковой ванне в течение 2 мин и переносят в делительную воронку объемом 100 см³. Затем концентратор дополнительно обрабатывают при помощи ультразвуковой ванны еще 10 см³ ацетонитрила, насыщенного гексаном, и объединяют с экстрактом в делительной воронке. В воронку приливают 30 см³ 5% раствора этилацетата в гексане (п. 8.2.2.8). Производят экстракцию интенсивным встряхиванием в течение 2 минут. Затем дают жидкости в колбе расслоиться и отбрасывают верхний гексановый слой. Экстракцию повторяют еще раз. После этого ацетонитрильный слой переносят в колбу-концентратор объемом 50 см³ и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре водяной бани 60 °C. В колбу-концентратор добавляют 15 см³ 0,05 М фосфатного буфера (п. 8.2.2.13) и переносят в делительную воронку объемом 100 см³, предварительно обработав концентратор в ультразвуковой ванне в течение 2 минут. Обработку повторяют новой порцией буфера объемом 15 см³, которая также переносится в воронку. Затем в воронку добавляется 10 см³ насыщенного хлорида натрия (п. 8.2.2.9). Экстракцию производят 20 см³ хлористого метилена при помощи интенсивного встряхивания в течение 2 минут. Жидкости в воронке дают расслоиться и отбирают нижний слой в колбу-концентратор объемом 100 см³. Экстракцию повторяют еще дважды, экстракты объединяют. Экстракт отгоняют на ротационном вакуумном испарителе досуха при температуре водяной бани 30 °C.

10.3.4. Очистка полученного экстракта при помощи твердофазной экстракции.

Экстракт (п. 10.3.3) подготавливается согласно п. 10.2.4.

9.3.5. Дополнительное концентрирование и очистка экстракта.

Экстракт (п. 10.3.4) подготавливается согласно п. 10.2.5.

10.4.1. Экстракция.

Образец масла массой 25 г помещают в химический стакан объемом 100 см³, растворяют масло в 50 см³ гексана и переносят в делительную воронку объемом 250 см³. Стакан обмывают еще 25 см³ гексана и переносят в ту же воронку. Экстракцию проводят 60 см³ ацетонитрила при помощи интенсивного встряхивания в течение 2 минут. После расслоения нижний ацетонитрильный слой собирают в колбу-концентратор объемом 250 см³. Повторяют экстракцию еще дважды, 60 и 30 см³ ацетонитрила, экстракты объединяют.

10.4.2. Подготовка экстракта для определения диклосулама.

Полученный экстракт (п. 10.4.1) упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре водяной бани 60 °C.

10.4.3. Очистка полученного экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей.

Экстракт (п. 10.4.2) подготавливается согласно п. 10.3.3.

10.4.4. Очистка полученного экстракта при помощи твердофазной экстракции.

Экстракт (п. 10.4.3) подготавливается согласно п. 10.2.4.

10.4.5. Дополнительное концентрирование и очистка экстракта.

Экстракт (п. 10.4.4) подготавливается согласно п. 10.2.5.

Режим хроматографа:

- колонка хроматографическая стальная, длиной 250 мм, с внутренним диаметром 4,6 мм, зернением 4 мкм, заполненная сорбентом с привитыми октадецильными и полярными группами;

- предколонка хроматографическая стальная, длиной 12,5 мм, внутренним диаметром 2,1 мм, зернением 4 мкм, заполненная сорбентом с привитыми октадецильными группами;

- температура колонки: 25 °C.

Подвижная фаза: 0,05% водный раствор уксусной кислоты - 0,05% раствор уксусной кислоты в ацетонитриле (% по объему) в градиентном режиме при постоянной скорости потока 1 см³/мин. Градиент потока элюента: 0 - 10 мин - 68:32; к 12,5 мин - 50:50; к 23 мин - 30:70; к 23,5 минутам - 0:100; 23,5 - 25,5 мин - 0:100.

Время стабилизации хроматографической системы после анализа пробы - 7 мин (общее время анализа 32,5 мин).

Объем вводимой пробы: 20 мм³.

Длина волны детектирования: 270 нм.

Линейный диапазон детектирования сохраняется в пределах 4 - 50 нг.

12.1. Для обработки результатов хроматографического анализа используется компьютерное программное обеспечение химического анализа, которое входит в хроматографическую систему.

Альтернативная обработка результатов.

Содержание диклосулама в пробах рассчитывают по формуле, без учета полноты извлечения вещества из проб:

где X - содержание диклосулама в пробе, мг/кг;

S_ст - высота (площадь) пика стандарта, мм (е.о.п. x с);

S_пр - высота (площадь) пика образца, мм (е.о.п. x с);

A - концентрация стандартного раствора, мкг/см³;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, см³;

m - масса анализируемого образца, г (см³);

P - содержание диклосулама в аналитических стандартах, %.

13.1. За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:

где X₁, X₂ - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости (табл. 1), при этом .

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

14.1. Результат анализа представляют в виде:

где - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

- граница абсолютной погрешности, мг/кг;

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

В случае если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

- при определении остаточного количества диклосулама в воде - содержание вещества в пробе менее 0,001 мг/л;

Примечание: 0,001 мг/кг - предел обнаружения определяемой концентрации диклосулама в воде.

- при определении остаточного количества диклосулама в почве, зерне и масле сои - содержание вещества в пробе менее 0,01 мг/кг.

Примечание: 0,01 мг/кг - предел обнаружения определяемой концентрации диклосулама в почве, зерне и масле сои.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений, а также контроль стабильности градуировочной характеристики осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1 - 6.

Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

Контроль стабильности градуировочной характеристики для диклосулама проводят при смене основного градуировочного раствора N 1 каждые 6 месяцев; при смене основного градуировочного раствора N 2 каждые 2 месяца; при смене градуировочных растворов N 3, 4, 5 и 6 каждые 30 суток, а также в начале и окончании каждой серии анализов.

При контроле стабильности градуировочной характеристики проводят измерения не менее трех образцов концентраций для градуировки, содержание диклосулама в которых должно охватывать весь диапазон концентраций градуировочных характеристик.

Градуировочная характеристика считается стабильной, если для каждого из используемых для контроля градуировочных растворов сохраняется соотношение.

15.1.1. Градуировочная характеристика для определения диклосулама в воде, почве, зерне и масле сои:

где X - концентрация диклосулама контрольного измерения, мкг/см³;

C - известная концентрация градуировочного раствора диклосулама в ацетонитриле, взятая для контроля стабильности градуировочной характеристики, мкг/см³;

5 - погрешность градуировочной характеристики, %.

Если величина расхождения (A) превышает указанные значения, градуировочная характеристика не может быть применена для дальнейших измерений. В этом случае выясняют и устраняют причины нестабильности градуировочной характеристики и повторяют контроль ее стабильности с использованием других градуировочных растворов диклосулама, предусмотренных методикой выполнения измерений. При повторном обнаружении нестабильности градуировочной характеристики определяют ее заново согласно п. 7.3.

Величина добавки C_д должна удовлетворять условию:

где - характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно), мг/кг, при этом:

где - граница абсолютной погрешности, мг/кг;

где - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

Результат контроля процедуры К_к рассчитывают по формуле:

где , , C_д - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце и концентрация добавки, соответственно, мг/кг.

Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (К_к) с нормативом контроля (К).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию:

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

где X₁, X₂ - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.