"МУК 4.1.3928-23. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств фенпропидина в семенах и масле сои методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 03.07.2023)

1. Разработаны ФБУН "Федеральный центр гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана" Роспотребнадзора (С.В. Кузьмин, Н.Е. Федорова, Л.Г. Бондарева).

2. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 3 июля 2023 г.

3. Введены впервые.

1.1. Настоящие методические указания (далее - МУК) устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (далее - ВЭЖХ) для определения массовой концентрации фенпропидина в сое (семена и масло) в диапазонах 0,01 - 0,2 мг/кг без учета разбавления и при разбавлении в 50 раз - 0,01 - 10 мг/кг.

1.2. МУК носят рекомендательный характер.

2.1. Фенпропидин. RS-1-[4-третбутилфенил)-2-метилпропил]пиперидин <1>.

--------------------------------

<1> В соответствии с Международным союзом теоретической и прикладной химии (ИЮПАК, англ. International Union of Pure and Applied Chemistry, IUPAC).

Брутто-формула - C₁₉H₃₁N. Молекулярная масса 273,5.

2.2. Физические и химические свойства:

- бледно-желтая слегка вязкая жидкость без запаха;

- давление паров: 17 Па, при плюс 25 °C;

- растворимость в воде (при плюс 25 °C, мг/дм³): 530 (pH 7), 6,2 (pH 9);

- растворимость в органических растворителях: легко смешивается с ацетоном, этанолом, толуолом, н-октаном и гексаном (при плюс 25 °C).

Константа диссоциации pKa 10,1 (сильное основание). Стабилен при хранении в закрытом контейнере при комнатной температуре, по крайней мере в течение 3 месяцев. Водные растворы устойчивы к воздействию УФ-света и гидролизу при температуре 80 °C (pH 4,7 и 10).

2.3. Фенпропидин является фунгицидом химического класса пиперидинов системного и профилактического действия. Механизм его действия заключается в ингибировании биосинтеза стиролов. Он особенно эффективен против таких болезнетворных микроорганизмов, как Erysiphe graminis, Rhynchosporium secalis и Puccinia.

3.1. При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 3.1 для соответствующих диапазонов концентраций.

4.1. Методика основана на определении вещества с помощью ВЭЖХ с ультрафиолетовым детектором.

4.2. Содержание фенпропидина в пробах семян и масла сои определяют после извлечения вещества из анализируемых образцов семян сои и масла сои (после растворения масла в гексане) смесью ацетонитрила с водой (80:20 по объему), очистки и концентрирования на картридже, заполненном сорбционным материалом на основе сополимера N-винилпирролидона и дивинилбензола. Элюирование фенпропидином проводят метанолом.

4.3. Нижний предел измерения фенпропидина в анализируемом объеме пробы - 1 нг.

Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.

5.1. При выполнении измерений и подготовке проб применяют средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы, приведенные в табл. 5.1 - 5.3.

Примечание: допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание: допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующей дополнительной очистки растворителей.

Примечание: допускается применение оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

6.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

6.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004.

6.3. Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист, имеющий опыт работы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений.

7.1. При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха плюс (15 - 30) °C и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

8.1. Очистка растворителей.

8.1.1. Ацетонитрил. Ацетонитрил кипятят с обратным холодильником над пентоксидом фосфора (на 1 дм³ ацетонитрила 20 г пентоксида фосфора) не менее 1 часа, после чего перегоняют; непосредственно перед использованием ацетонитрил повторно перегоняют над прокаленным карбонатом калия (на 1 дм³ ацетонитрила 10 г карбоната калия). Хранят в емкости из темного стекла.

8.1.2. н-Гексан

Растворитель последовательно промывают порциями концентрированной серной кислоты до тех пор, пока она не перестанет окрашиваться в желтый цвет, затем водой до нейтральной реакции промывных вод, перегоняют над прокаленным карбонатом калия.

8.2. Подготовка подвижной фазы для ВЭЖХ.

8.2.1. Приготовление раствора ортофосфорной кислоты с массовой долей 0,2% (0,2%-й раствор). В мерную колбу вместимостью 1000 см³ помещают 500 см³ бидистиллированной или деионизованной воды, 2,0 см³ ортофосфорной кислоты, перемешивают, доводят до метки бидистиллированной или деионизованной водой и еще раз тщательно перемешивают.

8.2.2. Приготовление подвижной фазы. В мерную колбу вместимостью 1000 см³ помещают 600 см³ ацетонитрила и 400 см³ 0,2%-го раствора ортофосфорной кислоты, перемешивают, фильтруют и дегазируют.

Подвижную фазу хранят в темном месте (в емкости из темного стекла) не более 14-ти дней.

8.3. Кондиционирование хроматографической колонки для ВЭЖХ. Промывают колонку подвижной фазой (приготовленной по п. 8.2.2) при скорости подачи растворителя 0,5 см³/мин до установления стабильной базовой линии.

8.4. Приготовление градуировочных растворов и растворов внесения.

8.4.1. Исходный раствор фенпропидина для градуировки (концентрация 100 мкг/см³). В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают (0,0100 +/- 0,0005) г фенпропидина, растворяют в 50 - 60 см³ ацетонитрила, доводят ацетонитрилом до метки, тщательно перемешивают.

Раствор хранят в холодильнике при температуре плюс (2 - 6) °C не более месяца.

8.4.2. Рабочий раствор N 1 фенпропидина для градуировки и внесения (концентрация 10,0 мкг/см³). В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 10,0 см³ исходного градуировочного раствора с концентрацией 100,0 мкг/см³ (п. 8.4.1), доводят до метки ацетонитрилом, тщательно перемешивают, получают рабочий раствор N 1 с концентрацией фенпропидина 10,0 мкг/см³.

Раствор хранят в холодильнике при температуре плюс (2 - 6) °C не более месяца.

Этот раствор используют для приготовления проб с внесением при оценке полноты извлечения действующего вещества методом "внесено-найдено", а также контроле качества результатов методом "добавок". Для внесения в образцы масла раствор внесения готовят на основе изопропанола.

8.4.3. Рабочие растворы N 2 - 6 фенпропидина для градуировки (концентрация 0,05 - 1,0 мкг/см³). В 5 мерных колб вместимостью 100 см³ помещают 0,5; 1,0; 2,5; 5,0; 10 см³ рабочего раствора N 1 с концентрацией 10,0 мкг/см³ (п. 8.4.2), доводят до метки подвижной фазой, приготовленной по п. 8.2.2, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы N 2 - 6 с концентрациями фенпропидина 0,05; 0,1; 0,25; 0,5; 1,0 мкг/см³.

Растворы хранят в холодильнике при температуре плюс 4 - 6 °C не более суток.

8.5. Установление градуировочной характеристики. Градуировочную характеристику, выражающую линейную (с угловым коэффициентом) зависимость площади пика от концентрации фенпропидина в растворе, устанавливают методом абсолютной калибровки по 5-ти растворам для градуировки.

В инжектор хроматографа вводят по 20 мм³ каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования, указанных ниже. Осуществляют не менее 3-х параллельных измерений. Устанавливают площади пиков фенпропидина, на основании которых строят градуировочную зависимость.

Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят в начале и по окончании каждой серии анализов.

При контроле стабильности градуировочной характеристики проводят не менее двух образцов растворов для градуировки, содержание фенпропидина в которых должно охватывать весь диапазон концентраций от 0,05 до 1,00 мкг/см³. Градуировочная характеристика считается стабильной, если для каждого используемого для контроля градуировочного раствора сохраняется соотношение:

где A - величина расхождения, %;

X - концентрация фенпропидина в пробе при контрольном измерении, мкг/см³;

C - известная концентрация градуировочного раствора фенпропидина, взятая для контроля стабильности градуировочной характеристики, мкг/см³;

B - норматив контроля погрешности градуировочной характеристики, % (B = 10% при P = 0,95).

8.6. Приготовление смесей органических растворителей для экстракции.

8.6.1. Смесь ацетонитрил - вода = 8:2. В мерную колбу на 500 см³ вносят 400 см³ ацетонитрила и 100 см³ бидистиллированной воды. Тщательно перемешивают.

8.6.2. Смесь ацетонитрил - вода = 2:8. В мерную колбу на 500 см³ вносят 100 см³ ацетонитрила и 400 см³ бидистиллированной воды. Тщательно перемешивают.

8.7. Подготовка картриджа для очистки и концентрирования. Картридж устанавливают на аллонж с прямым отводом для вакуума. Промывают картридж последовательно 1 см³ метанолом, 1 см³ ацетонитрилом, затем три раза по 1 см³ смесью ацетонитрил - вода, в соотношении 2:8 по объему, приготовленной по 8.6.2. Процедуру проводят с использованием вакуума. Скорость элюирования - 15 - 20 капель в минуту. Не допускать высыхания верхнего слоя сорбента в картридже.

9.1. Отбор проб осуществляется в соответствии с методическими документами <2>.

--------------------------------

<2> Унифицированные правила отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов, утвержденные заместителем Главного государственного санитарного врача СССР 21.08.1979 N 2051-79, ГОСТ 31760 "Межгосударственный стандарт. Масло соевое. Технические условия" и ГОСТ 17109 "Межгосударственный стандарт. Соя. Требования при заготовках и поставках".

Пробы семян сои подсушивают и хранят при комнатной температуре не более 2-х недель. Для длительного хранения образцы замораживают и хранят при температуре не выше минус 18 °C.

Образцы масла готовятся из семян способом горячей экстракции гексаном. Масло анализируется в день его изготовления.

10.1. Семена сои. Образец измельченных семян сои (10 г) помещают в плоскодонную колбу вместимостью 250 - 300 см³, затем добавляют 100 см³ смеси ацетонитрил - вода, приготовленной в соответствии с п. 8.6.1, перемешивают. Оставляют в покое на 15 минут. Затем смесь фильтруют на воронке Бюхнера с помощью разряжения, создаваемого водоструйным насосом, через двойной бумажный фильтр низкой плотности. Образец повторно экстрагируют 50 см³ смеси ацетонитрил - вода, приготовленной в соответствии с п. 8.6.1, на ультразвуковой ванне в течение 15 минут, раствор фильтруют на воронке Бюхнера. Фильтраты объединяются и переносятся в круглодонную колбу объемом 250 см³. Упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 30 °C до водного остатка (15 - 20 см³). Водный остаток пропускают через подготовленный в соответствии с п. 8.7 картридж со скоростью 15 - 20 капель в минуту, используя разрежение, создаваемое водоструйным насосом. После пропускания пробы картридж четыре раза по 1 см³ промывают смесью ацетонитрил - вода в соотношении 2:8, приготовленной в соответствии с п. 8.6.2.

Фенпропидин элюируют с картриджа метанолом 2 раза по 1 см³. Элюат собирают в круглодонную колбу объемом 50 см³. Упаривают на ротационном испарителе при температуре не выше плюс 30 °C до влажного остатка. Остаток в круглодонной колбе растворяют в 2 см³ подвижной фазы, приготовленной в соответствии с п. 8.2.2. Перед хроматографированием пробу дополнительно фильтруют через мембранный фильтр.

10.2. Масло сои. Навеску масла массой 10 г помещают в плоскодонную колбу вместимостью 250 - 300 см³, затем добавляют 100 см³ гексана, интенсивно встряхивают в течение 1 мин, затем помещают на ультразвуковую ванну на 15 минут. Смесь переносят в делительную воронку объемом 250 см³, добавляют 50 см³ ацетонитрила и интенсивно встряхивают в течение 1 минуты. Отделяют ацетонитрил от смеси. После чего проводят повторную экстракцию ацетонитрилом (30 см³). Объединенный органический экстракт в круглодонной колбе упаривают при температуре не выше плюс 35 °C на роторном вакуумном испарителе досуха. Сухой остаток растворяют в воде (20 см³), поместив колбу в ультразвуковую ванну на 15 минут.

Полученный раствор пропускают через подготовленный в соответствии с п. 8.7 картридж со скоростью 15 - 20 капель в минуту. После пропускания пробы картридж четыре раза по 1 см³ промывают смесью ацетонитрил - вода в соотношении 2:8, приготовленной в соответствии с п. 8.6.2. Фенпропидин элюируют с картриджа метанолом, 2 раза по 1 см³. Элюат собирают в круглодонную колбу объемом 50 см³. Упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 30 °C до влажного остатка. Остаток в круглодонной колбе растворяют в 2 см³ смеси ацетонитрил - вода, в соотношении 8:2, приготовленной в соответствии с п. 8.6.1.

10.3. Условия хроматографирования. Измерения выполняют при следующих режимных параметрах:

- жидкостный хроматограф с быстросканирующим ультрафиолетовым детектором, снабженный дегазатором и термостатом колонки;

- хроматографическая колонка стальная, длиной 250 мм, внутренним диаметром 4,6 мм, заполненная обращенно-фазным сорбентом с привитыми алкильными группами (C-18 или C-8) для удерживания гидрофильных соединений, зернением 5 мкм;

- рабочая длина волны: 220 нм;

- температура колонки: плюс 30 °C;

- подвижная фаза: ацетонитрил - ортофосфорная кислота (0,2%) (60:40 по объему);

- скорость потока элюента: 0,5 см³/мин;

- объем вводимой пробы: 20 мм³;

- линейный диапазон детектирования: 1 - 20 нг.

Образцы, дающие пики, большие, чем градуировочный раствор фенпропидина с концентрацией 1,0 мкг/см³, разбавляют смесью ацетонитрил - ортофосфорная кислота (0,2%), приготовленной в соответствии с п. 8.2.2, не более чем в 50 раз.

11.1. Содержание фенпропидина в пробах (X, мг/кг) рассчитывают по формуле:

где V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, см³;

m - масса анализируемого образца, г;

C - концентрация фенпропидина, найденная по градуировочному графику в соответствии с площадью хроматографического пика, мкг/см³;

К_р - кратность разбавления (если экстракт подвергался разбавлению).

Примечание. Идентификация и расчет концентрации вещества в пробах могут быть проведены с помощью компьютерной программы обработки хроматографических данных, включенной в аналитическую систему.

11.2. Проверка приемлемости результатов параллельных определений.

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (3):

где X₁, X₂ - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости (табл. 3.1), при этом .

При невыполнении условия (3) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

12.1. Результат анализа представляют в виде:

где - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

- граница абсолютной погрешности, мг/кг.

где - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 3.1), %.

Если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде: "Содержание фенпропидина в пробе сои (семена, масло) - менее 0,01 мг/кг" <3>.

--------------------------------

<3> 0,01 мг/кг - предел обнаружения фенпропидина в семенах и масле сои.

13.1. Контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-(1 - 6). Периодичность и формы контроля определяются руководством по качеству.

1. Федеральный закон от 30 марта 1999 г. N 52-ФЗ "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения".

2. ГОСТ Р ИСО 5725-(1 - 6) "Государственный стандарт Российской Федерации. Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

3. ГОСТ Р 53228 "Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания".

4. ГОСТ OIML R 111-1 "Государственная система обеспечения единства измерений".

5. ГОСТ 29227 "Межгосударственный стандарт. Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования".

6. ГОСТ Р 52501 "Вода для лабораторного анализа. Технические условия".

7. ГОСТ 6995 "Государственный стандарт союза ССР. Метанол-яд. Технические условия".

8. ГОСТ 6552 "Межгосударственный стандарт. Кислота ортофосфорная. Технические условия".

9. ГОСТ 25336 "Межгосударственный стандарт. Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры".

10. ГОСТ 9737 "Межгосударственный стандарт. Посуда лабораторная стеклянная. Шлифы сферические взаимозаменяемые".

11. ГОСТ 21241 "Государственный стандарт союза ССР. Пинцеты медицинские. Общие технические требования и методы испытаний".

12. ГОСТ 12.1.004 "Межгосударственный стандарт. Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования".

13. ГОСТ 12.1.007 "Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности".

14. ГОСТ 12.1.018 "Межгосударственный стандарт. Система стандартов безопасности труда. Пожаровзрывобезопасность статического электричества. Общие требования".

15. ГОСТ 12.1.019 "Межгосударственный стандарт. Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты".

16. ГОСТ 12.4.009 "Межгосударственный стандарт. Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание".

17. ГОСТ 1770 (ИСО 1042-83, ИСО 478-80) "Межгосударственный стандарт. Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия".

18. Унифицированные правила отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов, утвержденные заместителем Главного государственного санитарного врача СССР 21.08.1979 N 2051-79.

19. ГОСТ 31760 "Межгосударственный стандарт. Масло соевое. Технические условия".

20. ГОСТ 17109 "Межгосударственный стандарт. Соя. Требования при заготовках и поставках".

21. ГОСТ 2184 "Межгосударственный стандарт. Кислота серная техническая. Технические условия".

22. ГОСТ 9805 "Межгосударственный стандарт. Спирт изопропиловый. Технические условия".