"МУК 4.1.3663-20. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Измерение концентраций протиоконазола в атмосферном воздухе населенных мест методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 27.10.2020)

1. Разработаны ФБУН "Федеральный научный центр гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана" Роспотребнадзора (В.Н. Ракитский, Н.Е. Федорова, А.А. Ивченкова, М.С. Гречина).

2. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 27 октября 2020 г.

3. Введены впервые.

1.1. Настоящие методические указания (далее - МУК) устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (далее - ВЭЖХ) для определения в атмосферном воздухе населенных мест массовой концентрации протиоконазола в диапазоне 0,0025 - 0,0250 мг/м³.

1.2. МУК предназначены для органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, а также могут быть использованы организациями, осуществляющих контроль качества и безопасности объектов окружающей среды.

1.3. МУК носят рекомендательный характер.

2.1. Протиоконазол. 2-[(RS)-2-гидрокси-2-(1-хлорциклопропил)-3-(2-хлорфенил) пропил]-2H-1,2,4-триазол-3(4H)-тион <1>:

--------------------------------

<1> В соответствии с Международным союзом теоретической и прикладной химии (ИЮПАК, англ. International Union of Pure and Applied Chemistry, IUPAC).

- брутто-формула C₁₄H₁₅Cl₂N₃OS;

- молекулярная масса 344,3;

- белое или светло-бежевое твердое вещество без запаха;

- температура плавления 139,1 - 144,5 °C;

- давление паров при 25 °C << 4·10^-7 Па;

- коэффициент распределения н-октанол/вода: K_owlogP = 4,16 (pH 4), 3,82 (pH 7) и 2,0 (pH 9);

- растворимость (г/дм³) при 20 °C: ацетон - более 250, этилацетат - более 250, дихлорметан - 88, ацетонитрил - 69; растворимость в воде - 0,005 (pH 4), 0,3 (pH 8) и 2,0 (pH 9).

Вещество стабильно при хранении на воздухе, а также в кислой (DT₅₀ = 120 дней) и щеточной (DT₅₀ > 1 года) средах. В присутствии света в водных фотолитических условиях протиоконазол достаточно быстро деградирует с периодом полураспада 47,7 часа. Основным продуктом фотодеградации является протиоконазол-дестио, его содержание составляет до 56%.

2.2. Острая пероральная токсичность (LD₅₀) для крыс - более 6200 мг/кг; острая дермальная токсичность (LD₅₀) для крыс - более 2000 мг/кг; острая ингаляционная токсичность (LC₅₀) для крыс - более 4990 мг/м³ воздуха.

Протиоконазол не оказывает раздражающего действия на кожу и слизистую оболочку глаз.

2.3. Протиоконазол - фунгицид системного действия из группы ингибиторов синтеза эргостерина. Вещество обладает защитным, искореняющим и лечебным действием. При обработке вегетирующих растений эффективно подавляет развитие возбудителей ржавчины, мучнистой росы, септориоза, фузариоза колоса, ломкости стеблей и пятнистостей листьев на посевах ячменя, пшеницы и других культур, а при протравливании семян защищает последние от заражения твердой и пыльной головней и фузариозной корневой гнилью.

3.1. При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности p = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 3.1 и 3.2, для соответствующих диапазонов концентраций.

3.2. Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для всего диапазона измерений (n = 20) приведены в табл. 3.2.

4.1. Измерения концентраций протиоконазола выполняют методом ВЭЖХ на обращенной фазе с ультрафиолетовым детектором.

4.2. Концентрирование вещества из воздуха осуществляют на бумажный фильтр "синяя лента", экстракцию с фильтров проводят ацетонитрилом.

4.3. Нижний предел измерения в анализируемом объеме пробы - 1,5 нг. Средняя полнота извлечения с фильтров 95,1%.

5.1. При выполнении измерений и подготовке проб применяют средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы, приведенные в табл. 5.1 - 5.3.

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.

Примечание. Допускается применение оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

6.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

6.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004.

6.3. Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист, имеющий опыт работы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений.

7.1. При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на газовом и жидкостном хроматографах проводят в условиях, рекомендованных технической документацией на приборы.

8.1. Выполнению измерений предшествуют следующие операции: очистка ацетонитрила (при необходимости), подготовка подвижной фазы, кондиционирование хроматографической колонки, приготовление растворов для градуировки и внесения, установление градуировочной характеристики, подготовка концентрирующих патронов, отбор проб.

8.2. Очистка ацетонитрила. Ацетонитрил кипятят с обратным холодильником над пентоксидом фосфора (на 1 дм³ ацетонитрила 20 г пентоксида фосфора) не менее 1 часа, после чего перегоняют; непосредственно перед использованием ацетонитрил повторно перегоняют над прокаленным карбонатом калия (на 1 дм³ ацетонитрила 10 г карбоната калия).

8.3. Приготовление 0,02 М раствора орто-фосфорной кислоты.

Для приготовления 0,02 М раствора орто-фосфорной кислоты в мерную колбу вместимостью 1000 см³ помещают 1,36 см³ орто-фосфорной кислоты, доводят водой до метки, тщательно перемешивают. Хранят в темном месте (в емкости из темного стекла) не более 14 дней.

8.4. Подготовка подвижной фазы для ВЭЖХ.

В мерную колбу вместимостью 1000 см³ помещают 400 см³ 0,02 М орто-фосфорной кислоты, добавляют 600 см³ ацетонитрила, перемешивают, фильтруют и дегазируют.

8.5. Кондиционирование хроматографической колонки.

Колонку промывают подвижной фазой (п. 8.4) в течение 30 минут при скорости подачи растворителя 1,0 см³/мин до установления стабильной базовой линии. Хранят в темном месте (в емкости из темного стекла) не более 14 дней.

8.6. Приготовление градуировочных растворов и растворов внесения.

8.6.1. Исходный раствор протиоконазола для градуировки (концентрация 100 мкг/см³). В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают (0,0100 +/- 0,0001) г протиоконазола, растворяют в 50 - 60 см³ ацетонитрила, доводят до метки ацетонитрилом, тщательно перемешивают. Раствор хранят в морозильной камере при температуре не выше -18 °C не более месяца.

Растворы N 1 - 5 готовят объемным методом путем последовательного разбавления исходного раствора для градуировки.

8.6.2. Раствор N 1 протиоконазола для градуировки и внесения (концентрация 10 мкг/см³). В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 10 см³ исходного раствора протиоконазола с концентрацией 100 мкг/см³ (п. 8.6.1), разбавляют ацетонитрилом до метки.

Градуировочный раствор N 1 хранят в морозильной камере при температуре не выше -18 °C не более месяца.

8.6.3. Рабочие растворы N 2 - 5 протиоконазола для градуировки (концентрация 0,05 - 0,5 мкг/см³). В 4 мерные колбы вместимостью 100 см³ помещают по 0,5; 1,0; 2,0 и 5,0 см³ раствора N 1 с концентрацией 10 мкг/см³ (п. 8.6.2), доводят до метки подвижной фазой (подготовленной по п. 8.4), тщательно перемешивают, получают рабочие растворы NN 2 - 5 с концентрациями протиоконазола 0,05; 0,1; 0,2 и 0,5 мкг/см³, соответственно.

Растворы хранятся в холодильнике при температуре 4 - 5 °C не более суток.

8.7. Подготовка концентрирующего патрона.

8.7.1. Приготовление 0,05%-го раствора уксусной кислоты.

В мерную колбу вместимостью 1000 см³ помещают 300 - 400 см³ дистиллированной воды, вносят 0,5 см³ ледяной уксусной кислоты, перемешивают, доводят водой до метки, вновь перемешивают.

8.7.2. Кондиционирование концентрирующего патрона

Концентрирующий патрон промывают с помощью медицинского шприца 2 см³ метанола со скоростью прохождения растворителя через патрон 1 - 2 капли в секунду, затем 5 см³ 0,05%-й уксусной кислоты. Патрон готовят непосредственно перед использованием для концентрирования образца.

8.8. Установление градуировочной характеристики.

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика (ед. абсорбции·с) от концентрации протиоконазола в растворе (мкг/см³), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4 растворам для градуировки NN 2 - 5.

В инжектор хроматографа вводят по 30 мм³ каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 10.2. Осуществляют не менее 3 параллельных измерений. Устанавливают площадь пика протиоконазола.

8.9. Контроль стабильности градуировочной характеристики. Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят в начале и по окончании каждой серии анализов.

При контроле стабильности градуировочной характеристики проводят измерения не менее двух образцов концентраций для градуировки, содержание веществ в которых должно охватывать весь диапазон концентраций от 0,05 до 0,5 мкг/см³ (в соответствии с п. 8.6.3).

Градуировочная характеристика считается стабильной, если для каждого используемого для контроля градуировочного раствора сохраняется соотношение:

X - концентрация веществ в растворе при контрольном измерении, мкг/см³;

C - известная концентрация градуировочного раствора, взятая для контроля стабильности градуировочной характеристики, мкг/см³;

B - норматив контроля погрешности градуировочной характеристики, % (B = 10% при P = 0,95).

8.10. Подготовка фильтров для отбора проб воздуха.

Диаметр бумажного фильтра "синяя лента" должен соответствовать внутреннему диаметру фильтродержателя.

Фильтры последовательно по 3 раза промывают на воронке Бюхнера этанолом, затем ацетонитрилом порциями по 25 - 30 см³, сушат с помощью разряжения, создаваемого водоструйным насосом, затем на воздухе при комнатной температуре. До использования фильтры хранят в герметично закрытой стеклянной таре.

9.1. Отбор проб воздуха осуществляют в соответствии с ГОСТ 17.2.4.02 и ГОСТ 17.23.01.

Воздух с объемным расходом 5 дм³/мин аспирируют через бумажный фильтр "синяя лента", помещенный в фильтродержатель.

Для измерения концентрации протиоконазола на уровне 0,0025 мг/м³ необходимо отобрать 80 дм³ воздуха. Срок хранения отобранных проб, помещенных в полиэтиленовые пакеты, в морозильной камере при температуре не выше минус 18 °C - 7 дней.

10.1. Фильтр с отобранной пробой переносят в химический стакан вместимостью 100 см³, заливают 10 см³ ацетонитрила, помещают на встряхиватель, установленный в затемненном помещении, на 30 минут. Растворитель сливают, отжимая фильтр стеклянной палочкой, в цилиндр с пришлифованной пробкой вместимостью 25 см³. Фильтр обрабатывают новой порцией ацетонитрила объемом 10 см³, выдерживая на встряхивателе 20 минут, экстракты объединяют.

Общий объем экстракта в цилиндре доводят до 20 см³ ацетонитрилом, тщательно перемешивают. Отбирают аликвоту объемом 10 см³, переносят в колбу с пришлифованной пробкой объемом 100 см³, разбавляют дистиллированной водой в соотношении 1:9 (1 часть пробы + 9 частей воды), добавляют 0,02 см³ ледяной уксусной кислоты и перемешивают.

Подготовленную пробу вносят с помощью медицинского шприца на концентрирующий патрон, подготовленный по п. 8.7.2, со скоростью пропускания раствора 1 - 2 капли в секунду. Операцию осуществляют в затемненном помещении. После нанесения пробы патрон промывают 5 см³ смеси ацетонитрил - 0,05%-я уксусная кислота (2:8 по объему), элюат отбрасывают. Вещество элюируют с патрона 2 см³ смеси ацетонитрил - 0,05%-я уксусная кислота (9:1 по объему), собирают элюат в пробирку с пришлифованной пробкой, перемешивают и анализируют на содержание протиоконазола в условиях, указанных в п. 10.2.

Пробу вводят в инжектор хроматографа не менее двух раз. Устанавливают площадь пика, с помощью градуировочного графика определяют концентрацию протиоконазола в хроматографируемом растворе.

Перед анализом опытной пробы проводят хроматографирование холостой (контрольной) пробы - экстракта неэкспонированного фильтра.

10.2. Условия хроматографирования.

Измерения выполняют при следующих режимных параметрах:

- жидкостной хроматограф с ультрафиолетовым детектором;

- колонка стальная длиной 150 мм, внутренним диаметром 4,6 мм, содержащая сорбент C18, зернением 5 мкм;

- температура колонки комнатная;

- подвижная фаза: 0,02 М орто-фосфорная кислота - ацетонитрил (40:60 по объему);

- скорость потока элюента 1,0 см³/мин;

- рабочая длина волны 213 нм;

- объем вводимой пробы 30 мм³;

- ориентировочное время выхода протиоконазола 5,7 - 5,9 мин;

- линейный диапазон детектирования 1,5 - 15 нг.

Образцы, дающие пики большие, чем градуировочный раствор протиоконазола с концентрацией 0,5 мкг/см³, разбавляют подвижной фазой (подготовленной по п. 8.4).

11.1. Концентрацию вещества в пробе воздуха (X), мг/м³, рассчитывают по формуле:

C - концентрация протиоконазола в хроматографируемом растворе, найденная по градуировочному графику в соответствии с величиной площади хроматографического пика, мкг/см³;

W - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, см³;

V_t - объем пробы воздуха, отобранный для анализа, приведенный к нормальным условиям (давление 760 мм рт. ст., температура: 0 °C - атмосферный воздух), дм³.

T - температура воздуха при отборе пробы (на входе в аспиратор), °C;

P - атмосферное давление при отборе пробы, мм рт. ст.;

u - расход воздуха при отборе пробы, дм³/мин;

t - длительность отбора пробы, мин;

R - коэффициент, равный 0,357, для атмосферного воздуха.

Примечание. Идентификация и расчет концентрации вещества в пробах могут быть проведены с помощью компьютерной программы обработки хроматографических данных, включенной в аналитическую систему.

12.1. Результат количественного анализа представляют в виде:

- среднее арифметическое результатов определений, мг/м³;

- граница абсолютной погрешности, мг/м³;

- граница относительной погрешности методики (показатель точности по диапазону концентраций, таблица 3.1), %.

Результат измерений должен иметь тот же десятичный разряд, что и погрешность.

Если содержание вещества менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде: "Содержание протиоконазола в пробе атмосферного воздуха менее 0,0025 мг/м³" <2>.

--------------------------------

<2> 0,0025 мг/м³ - предел обнаружения при отборе 80 дм³ атмосферного воздуха.

13.1. Организация контроля качества результатов определения осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-(1 - 6).

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.

Образцами для контроля являются реальные пробы воздушной среды. Объем отобранных для контроля процедуры выполнения анализа проб воздуха должен соответствовать удвоенному объему, необходимому для проведения анализа по методике. После отбора проб экстракт с фильтра делят на две равные части, первую из которых анализируют в точном соответствии с прописью методики и получают результат анализа исходной рабочей пробы - X. Во вторую часть делают добавку анализируемого компонента (величина добавки C_д должна соответствовать 50 - 150% от содержания компонента в пробе, общая концентрация не должна превышать верхнюю границу диапазона измерения) и анализируют в точном соответствии с прописью методики, получая результат анализа рабочей пробы с добавкой, - X'. Результаты анализа исходной рабочей пробы (X) и рабочей пробы с добавкой (X') получают в условиях повторяемости (один аналитик, использование одного набора мерной посуды, одной партии реактивов и т.д.).

Величина добавки C_д должна удовлетворять условию:

- характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой), мг/м³.

Допустимо характеристику погрешности результатов анализа при внедрении методики в лаборатории устанавливать на основе выражения с последующим уточнением по мере накопления информации, где - граница абсолютной погрешности, мг/м³;

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 3.1), %.

Контроль проводят путем сравнения результата контрольной процедуры К_к с нормативом контроля К.

Результат контрольной процедуры К_к рассчитывают по формуле:

, , C_д - среднее значение массовой концентрации анализируемого компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки, соответственно (мг/м³).

Норматив оперативного контроля точности К рассчитывают по формуле:

Проводят сопоставление результата контрольной процедуры (К_к) с нормативом контроля (К).

Если результат контрольной процедуры удовлетворяет условию:

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (1) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (1) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), не должно превышать предела воспроизводимости (R):

.

, где X₁, X₂ - результаты измерений в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), мг/м³;

R - предел воспроизводимости (табл. 3.1), мг/м³.

Если выполняется условие (2), то воспроизводимость измерений считается удовлетворительной.

1. ГОСТ Р 53228 "Весы неавтоматического действия".

2. ГОСТ OIML R 111-1 "Государственная система обеспечения единства измерений". Гири классов точности E (индекса 1), E (индекса 2), F (индекса 1), F (индекса 2), M (индекса 1), M (индекса 1-2), M (индекса 2), M (индекса 2-3) и M (индекса 3). Часть 1. Метрологические и технические требования".

3. ГОСТ 1770 "Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия".

4. ГОСТ 29227 "Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования".

5. ГОСТ 2603 "Реактивы. Ацетон. Технические условия".

6. ГОСТ Р 52501 "Вода для лабораторного анализа. Технические условия".

7. ГОСТ 4221 "Реактивы. Калий углекислый. Технические условия".

8. ГОСТ 61 "Реактивы. Кислота уксусная. Технические условия".

9. ГОСТ 6995 "Реактивы. Метанол-яд. Технические условия".

10. ГОСТ 9147 "Посуда и оборудование лабораторные фарфоровые. Технические условия".

11. ГОСТ 9737 "Посуда лабораторная стеклянная. Шлифы сферические взаимозаменяемые".

12. ГОСТ 25336 "Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры".

13. ГОСТ 12026 "Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия".

14. ГОСТ 21241 "Пинцеты медицинские. Общие технические требования и методы испытаний".

15. ГОСТ ISO 7886-1 "Шприцы инъекционные однократного применения стерильные. Часть 1. Шприцы для ручного использования".

16. ГОСТ 12.1.007 "Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности".

17. ГОСТ 12.1.019 "Система стандартов безопасности труда (ССБТ). Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты".

18. ГОСТ 12.1.004 "Система стандартов безопасности труда (ССБТ). Пожарная безопасность. Общие требования".

19. ГОСТ 12.4.009 "Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание".

20. ГОСТ 17.2.4.02 "Охрана природы. Атмосфера. Общие требования к методам определения загрязняющих веществ".

21. ГОСТ 12.1.005 "Система стандартов безопасности труда (ССБТ). Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны".

22. Р 2.2.2006-05 "Общие методические требования к организации и проведению контроля содержания вредных веществ в воздухе рабочей зоны".

23. ГОСТ Р ИСО 5725 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".