"МУК 4.2.3940-23. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Метод микробиологического измерения концентрации биопрепарата ТуринБаш,Ж в атмосферном воздухе городских и сельских поселений. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 04.07.2023)

1. Разработаны ФГАОУ ВО "Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова" Минздрава России (д.б.н. Н.И. Шеина); ФБУН "Федеральный научный центр гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана" Роспотребнадзора (к.м.н. А.Л. Мишина).

2. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой "4" июля 2023 г.

3. Введены впервые.

1.1. Настоящие методические указания (далее - МУК) устанавливают порядок применения метода микробиологического количественного анализа концентрации биопрепарата ТуринБаш,Ж в атмосферном воздухе городских и сельских поселений в диапазоне концентраций от 50 до 50000 клеток в 1 м³ воздуха.

1.2. МУК носят рекомендательный характер.

2.1. Препарат ТуринБаш <1> эффективен против гусениц и личинок младших возрастов насекомых отряда чешуекрылых, жесткокрылых. Применяется для борьбы с вредителями овощных культур: картофель (колорадский жук), капуста, рапс (капустная моль); плодовых деревьев (плодовая и яблонная моли); лиственных пород деревьев (непарный шелкопряд); хвойных пород деревьев (сосновый шелкопряд, шелкопряд монашенка).

--------------------------------

<1> ТУ 20.20.11-127-20672718.

2.2. Препарат представляет собой водную суспензию, содержащую Bacillus thuringiensis subsp. aizawai, штамм 12К (титр не менее 10⁹ КОЕ/мл), Bacillus thuringiensis subsp. thuringiensis, штамм ВНИИВЭА-177 (титр не менее 10⁹ КОЕ/мл) в равных соотношениях.

Bacillus thuringiensis subsp. aizawai, штамм 12К ВКПМ В-13619 хорошо растет при температуре плюс 29 +/- 1 °C, образуя белые округлые плотные колонии диаметром до 15 мм с матовой поверхностью и мелковолнистым краем.

Штамм представлен грамположительными подвижными палочками размером 0,7 - 1,2 x 2,5 - 4,0 мкм с перитрихиями. Через 96 ч роста на агаризованной среде "А" образуются овальные споры размером 0,6 - 0,8 x 1,2 - 2,0 мкм. Одновременно со спорами образуются параспоральные тельца бипирамидальной формы разных размеров.

На агаризованной среде А Bacillus thuringiensis subsp. thuringiensis, штамм ВНИИВЭА-177 образует колонии серовато-белого цвета диаметром до 10 мм, округлой формы с неровным краем, матовые. Микроскопически колония представлена палочками с закругленными концами, расположенными одиночно, парами, цепочками

2.3. Штамм Bacillus thuringiensis subsp. aizawai, штамм 12К ВКПМ В-13619 получен путем селекции от соответствующего родственного предшественника. Микроорганизм Bacillus thuringiensis subsp. thuringiensis, штамм ВНИИВЭА-177 выделен из личинки овода, идентифицирован под номером ВКПМ В-5689 <2>. Оптимальной твердой средой для выращивания и размножения штаммов, входящих в препарат, является среда "А" (г/дм³): пептон сухой ферментативный - 7.0, хлорид натрия - 5.0, рыбный гидролизат - 4, агар-агар - 1.2, дистиллированная вода - 1000 см³.

--------------------------------

<2> Штаммы депонированы во ФГУП ГосНИИГенетика.

2.4. Штаммы, входящие в биопрепарат, относятся к микроорганизмам, непатогенным для человека <3>. Работа со штаммами не требует специальных мер предосторожности.

--------------------------------

<3> Согласно классификации микроорганизмов, приведенных в СанПиН 3.3686-21 "Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней", утвержденных постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 28.01.2021 N 4 (зарегистрировано Минюстом России 15.02.2021 N 62500) (далее - СанПиН 3.3686-21).

3.1. Методика обеспечивает выполнения измерений количества клеток микроорганизмов в атмосферном воздухе городских и сельских поселений в диапазоне концентраций от 50 до 50000 клеток в 1 м³ воздуха при доверительной вероятности 0,95.

4.1. Метод основан на аспирации из воздуха клеток микроорганизмов и подсчета общего количества выросших колоний по типичным культурально-морфологическим признакам на агаризованной среде А. При наличии в воздухе высоких концентраций штамма возможно использование седиментационного метода Коха.

5.1. При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы, приведенные в таблицах 1 - 3.

6.1. При выполнении измерений концентрации клеток микроорганизма в атмосферном воздухе городских и сельских поселений соблюдаются санитарно-эпидемиологические требования <4>, а также стандарты безопасности труда <5>.

--------------------------------

<4> СанПиН 3.3686-21.

<5> ГОСТ 12.1.005 "Система стандартов безопасности труда (ССБТ). Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны", утвержденный и введенный в действие постановлением Госстандарта СССР от 29.09.1988 N 3388.

6.2. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования по электробезопасности при работе с электроустановками <6> и инструкции по эксплуатации прибора.

--------------------------------

<6> ГОСТ 12.1.019 "Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты", введенный приказом Росстандарта от 07.11.2018 N 941-ст.

6.3. Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованным бактерицидными лампами.

6.4. К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области микробиологических исследований.

7.1. Приготовление сред, подготовку к анализу проводят в следующих условиях:

8.1. Для приготовления агаризованной среды А на 1.0 дм³ дистиллированной воды добавляют: пептон сухой ферментативный - 7,0 г, хлорид натрия - 5,0 г, рыбный гидролизат - 4,0 г.

8.2. Плотную среду готовят, добавляя агар 1,2 г/дм³ и, помешивая, нагревают до полного растворения агара. В готовой среде pH 4,2.

8.3. Приготовленную среду разливают в стерильные колбы по 250 - 500 см³ и автоклавируют при плюс 120 °C в течение 15 - 20 мин.

8.4. Готовую среду хранят в защищенных от света условиях при температуре не выше плюс 8 °C в течение 10 дней не более.

9.1. Отбор проб воздуха. Отбор проб воздуха проводят в соответствии с методическими документами <7>.

--------------------------------

<7> МУК 4.2.1054-01 "Измерение концентраций микроорганизмов-продуцентов, бактериальных препаратов и их компонентов в атмосферном воздухе населенных мест", утвержденные Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации 06.06.2001; ГОСТ Р 8.563 "Государственная система обеспечения единства измерений. Методики (методы) измерений", введенный приказом Ростехрегулирования от 15.12.2009 N 1253-ст.

Для этого воздух аспирируют при помощи пробоотборника на поверхность плотной питательной среды в соответствии с технической документацией (инструкцией) на прибор. Время аспирации и объем отбираемого воздуха зависит от предполагаемой концентрации микроорганизма (таблица 4).

Аппарат перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают 96° этиловым спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора; наружную и внутреннюю стенку крышки. На подвижной диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо (количество питательной среды в чашки вносят в соответствии с Инструкцией к прибору). После отбора пробы воздуха и остановки диска прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.

9.2. Выполнение анализа.

9.2.1. При выполнении анализа воздуха стерильную агаризованную среду расплавляют, остужают до плюс 50 - 60 °C и разливают в чашки Петри.

9.2.2. Контроль чистоты розлива проводят в соответствии с методами контроля <8>. Для этого чашки с застывшей средой помещают в термостат при температуре плюс 37 °C не менее чем на 18 часов. Проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха. Разлитую в чашки питательную среду хранят при температуре плюс (2 - 8) °C не более 10 дней.

--------------------------------

<8> Пункт 7.1.1 МУК 4.2.2316-08 "Методы контроля бактериологических питательных сред", утвержденных руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 18.01.2008 (далее - МУК 4.2.2316-08).

9.2.3. После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в термостат с температурой плюс 29 +/- 2 °C. Через 1 - 3 суток производят подсчет выросших колоний по культурально-морфологическим признакам.

9.2.4. Ростовые свойства используемой питательной среды должны быть проверены до проведения анализа воздуха в соответствии ростовыми свойствами питательных сред <9>. Для этого музейные штаммы, входящие в состав препарата, высеваются на 2 - 3 чашки используемой среды.

--------------------------------

<9> МУК 4.2.2316-08.

9.2.5. Лиофилизованную культуру музейных штаммов необходимо использовать 2 - 3 пассажа во избежание потери им заданных ростовых свойств.

9.2.6. Идентификацию штаммов до вида можно проводить с помощью анализа 16S РНК с помощью ПЦР-реакции.

10.1. Расчет концентрации клеток производят по формуле:

где: К - концентрация штамма в воздухе, кл/м³;

П - количество типичных колоний, выросших на чашке Петри;

1000 - коэффициент пересчета дм³ на м³ воздуха;

С - скорость аспирации воздуха, дм³/мин;

T - время аспирации, мин.

11.1. Результаты измерений оформляют протоколом, приведенным в приложении к настоящим МУК.

1. Дата проведения анализа _______________________________________

2. Место отбора пробы (название и адрес организации, производство, технологическая стадия, точка отбора пробы) ________________________________________________

3. Вид пробоотборника __________________________________________

4. Дата последней метрологической поверки оборудования для отбора проб _____________________________________

5. Питательная среда, время инкубации ____________________________

6. Результаты испытания ростовых свойств питательной среды ________

7. Количественная и качественная характеристика выросших колоний (количество типичных колоний) ________________________________________________

8. Результаты идентификации микроорганизмов препарата (морфологические признаки) _______________________

9. Результаты расчета концентрации штамма _______________________

10. Соотношение полученных результатов с уровнем ПДК_а.в. __________

11. Отбор пробы произведен (ФИО, должность, дата, подпись) ________

12. Идентификация штамма и расчет концентрации произведены (ФИО, должность, дата, подпись) ________________________________________________