"МУК 4.1.3717-21. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств спиротетрамата и его основного метаболита спиротетрамат-енола в ботве и корнеплодах сахарной свеклы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 10.11.2021)

1. Разработаны ФБУН "Федеральный научный центр гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана" Роспотребнадзора" (С.В. Кузьмин, В.Н. Ракитский, Н.Е. Федорова, М.С. Гречина).

2. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 10 ноября 2021 г.

3. Введены впервые.

1.1. Настоящие методические указания (далее - МУК) устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием для определения в ботве и корнеплодах сахарной свеклы массовой концентрации спиротетрамата и его метаболита спиротетрамат-енола в диапазонах 0,01 - 0,1 мг/кг.

1.2. МУК предназначены для органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, осуществляющих контроль качества и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов, а также могут быть использованы организациями, аккредитованными в установленном порядке на проведение исследований продовольственного сырья, пищевых продуктов.

1.3. МУК носят рекомендательный характер.

2.1. Спиротетрамат (BYI 08330). cis-3-(2,5-Диметилфенил)-8-метокси-2-оксо-1-азаспиро[4,5]дес-3-ен-4-ил этил карбамат <1>. Брутто-формула: C₂₁H₂₇NO₅. Молекулярная масса 373,45. Бесцветное кристаллическое вещество. Температура плавления 142 °C. Давление паров (в Па): 5,6·10^-9 (20 °C), 1,5·10^-8 (25 °C), 1,5·10^-6 (50 °C). Плотность 1,22. Растворимость в органических растворителях при 20 °C (в г/дм³): ацетон - 100 - 120; дихлорметан - более 600; этилацетат - 67; этанол - 44; толуол - 60; н-октанол - 140; н-гексан - 0,055. Растворимость в воде при 20 °C (мг/дм³): 33,5 (pH 4), 29,9 (pH 6,9), 19,1 (pH 9). Коэффициент распределения н-октанол - вода - logK_ow 2,51 (pH 4,7); 2,50 (pH 9).

--------------------------------

<1> В соответствии с Международным союзом теоретической и прикладной химии (ИЮПАК, англ. International Union of Pure and Applied Chemistry, IUPAC). Union of Pure and Applied Chemistry, IUPAC).

2.2. Краткая токсикологическая характеристика: острая пероральная токсичность (LD₅₀) для крыс - более 2000 мг/кг; острая дермальная токсичность (LD₅₀) для крыс - более 2000 мг/кг; острая ингаляционная токсичность (LC₅₀) для крыс (4 часа) - 4,18 мг/дм³.

2.3. Спиротетрамат - системный инсектицид класса кетоенолов, рекомендуемый для борьбы с широким спектром сосущих насекомых на различных сельскохозяйственных культурах (фрукты, овощи, виноград, хмель и др.). Основным продуктом метаболитической деградации спиротетрамата в растениях, воде, почве является спиротетрамат-енол (BYI 08330-enol).

2.4. Спиротетрамат-енол (BYI 08330-enol). cis-3-(2,5-Диметилфенил)-4-гидрокси-8-метокси-1-азаспиро[4,5]дес-3-ен-2-он. Брутто-формула: C₁₈H₂₃NO₃. Молекулярная масса 301,39.

3.1. При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в таблице 3.1 для соответствующих диапазонов концентраций.

4.1. Методика основана на определении вещества с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на обращенной фазе с тройным квадрупольным масс-спектрометрическим детектором.

4.2. Экстракцию вещества из анализируемых проб растительной продукции выполняют смесью ацетонитрил - вода (4:1, по объему), подкисленной муравьиной кислотой 0,22 см³/дм³.

4.3. Нижний предел измерения спиротетрамата и спиротетрамат-енола в анализируемом объеме пробы - 1,0 пг.

5.1. При выполнении измерений и подготовке проб применяют средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы, приведенные в таблицах 5.1 - 5.3.

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.

Примечание. Допускается использование вспомогательных средств измерений, устройств и материалов с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

6.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостной хроматограф.

6.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004.

6.3. При работе с газами, находящимися в баллонах под давлением до 15 МПа (150 кгс/см²), необходимо соблюдать нормы и правила <2> промышленной безопасности. Запрещается открывать вентиль баллона, не установив в нем понижающий редуктор.

--------------------------------

<2> Правила промышленной безопасности опасных производственных объектов, на которых используется оборудование, работающее под избыточным давлением, утвержденные Приказом Ростехнадзора от 25.03.2014 N 116.

6.4. Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист, имеющий опыт работы на жидкостном хроматографе с тройным квадрупольным масс-спектрометрическим детектором, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментальное соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений.

7.1. При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (15 - 30) °C и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией на прибор.

8.1. Измерениям предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), приготовление подвижной фазы, смесей растворителей для экстракции проб, градуировочных растворов, растворов внесения, кондиционирование хроматографической колонки, установление градуировочных характеристик, отбор проб.

8.2. Очистка растворителей. Ацетонитрил кипятят с обратным холодильником над пентоксидом фосфора (на 1 дм³ ацетонитрила 20 г пентоксида фосфора) не менее 1 часа, после чего перегоняют, непосредственно перед употреблением ацетонитрил повторно перегоняют над прокаленным карбонатом калия (на 1 дм³ ацетонитрила 10 г карбоната калия). Хранят в емкости из темного стекла.

8.3. Подготовка подвижной фазы для ВЭЖХ.

В мерную колбу вместимостью 1000 см³ помещают 500 см³ ацетонитрила, вносят 0,22 см³ муравьиной кислоты, добавляют 500 см³ деионизованной воды, тщательно перемешивают.

Подвижную фазу хранят в темном месте (в емкости из темного стекла) не более 14 дней.

8.4. Кондиционирование хроматографической колонки для ВЭЖХ.

Промывают колонку подвижной фазой при скорости подачи растворителя 0,4 см³/мин до установления стабильной базовой линии.

8.5. Приготовление смесей растворителей для экстракции.

8.5.1. В мерную колбу вместимостью 1000 см³ помещают 800 см³ ацетонитрила, 200 см³ деионизованной воды, 0,22 см³ муравьиной кислоты, перемешивают.

8.5.2. В мерную колбу вместимостью 1000 см³ помешают 200 см³ ацетонитрила, 800 см³ деионизованной воды, 0,22 см³ муравьиной кислоты, перемешивают.

Растворы хранят в темном месте (в емкости из темного стекла) не более 14 дней.

8.6. Приготовление градуировочных растворов и растворов внесения.

8.6.1. Исходный раствор спиротетрамата для градуировки (концентрация 100 мкг/см³).

В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают (0,0100 +/- 0,0005) г спиротетрамата, добавляют 50 - 70 см³ ацетонитрила, перемешивают, доводят ацетонитрилом до метки, вновь перемешивают. Раствор хранят в холодильнике (2 - 6) °C в течение месяца.

8.6.2. Исходный раствор спиротетрамат-енола для градуировки (концентрация 100 мкг/см³).

В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают (0,0100 +/- 0,0005) г спиротетрамата-енола, добавляют 50 - 70 см³ метанола, перемешивают, доводят метанолом до метки, вновь перемешивают. Раствор хранят в холодильнике (2 - 6) °C в течение месяца.

Массу навески необходимо брать, учитывая чистоту стандартных образцов спиротетрамата и спиротетрамат-енола.

Растворы N 1 - 7 готовят объемным методом путем последовательного разбавления исходных растворов для градуировки.

8.6.3. Раствор N 1 спиротетрамата и спиротетрамат-енола для градуировки и внесения (концентрация 1 мкг/см³).

В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 1 см³ исходного раствора спиротетрамата (п. 8.6.1) и 1 см³ исходного раствора спиротетрамат-енола (п. 8.6.2) с концентрациями 100 мкг/см³, доводят ацетонитрилом до метки, перемешивают. Раствор N 1 хранят в холодильнике (2 - 6) °C в течение 2 недель.

Этот раствор используют для приготовления проб с внесением при оценке полноты извлечения действующего вещества методом "внесено-найдено" и контроля качества результатов измерений методом добавок.

8.6.4. Раствор N 2 спиротетрамата и спиротетрамат-енола для градуировки и внесения (концентрация 0,01 мкг/см³).

В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 1,0 см³ градуировочного раствора N 1 с концентрацией спиротетрамата и спиротетрамат-енола 1,0 мкг/см³ (п. 8.6.3), доводят до метки подвижной фазой, приготовленной по п. 8.3, тщательно перемешивают, получают рабочий раствор N 2 с концентрацией спиротетрамата и спиротетрамат-енола 0,01 мкг/см³. Раствор N 2 хранят в холодильнике (2 - 6) °C в течение 10 дней.

8.6.5. Рабочие растворы N 3 - 7 спиротетрамата и спиротетрамат-енола для градуировки (концентрация 0,1 - 1,0 нг/см³).

В 5 мерных колб вместимостью 100 см³ помещают 1,0; 2,0; 5,0; 8,0 и 10,0 см³ градуировочного раствора N 2 с концентрацией спиротетрамата и спиротетрамат-енола 0,01 мкг/см³, доводят до метки подвижной фазой, приготовленной по п. 8.3, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы N 3 - 7 с концентрациями спиротетрамата и спиротетрамат-енола 0,1; 0,2; 0,5; 0,8 и 1,0 нг/см³ соответственно.

Растворы хранятся в холодильнике (2 - 6) °C в течение недели.

8.7. Установление градуировочных характеристик.

Градуировочные характеристики, выражающие зависимость площади пика (I) от концентрации спиротетрамата и спиротетрамат-енола в растворе (нг/см³), устанавливают методом абсолютной калибровки по 5 растворам для градуировки.

В инжектор хроматографа вводят по 10 мм³ каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования, указанных в п. 10.2. Осуществляют не менее 5 параллельных измерений.

8.8. Контроль стабильности градуировочной характеристики. Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят в начале и по окончании каждой серии анализов.

При контроле стабильности градуировочной характеристики проводят измерения не менее двух образцов концентраций для градуировки, содержание спиротетрамата и спиротетрамат-енола в которых должно охватывать весь диапазон концентраций от 0,1 до 1,0 нг/см³.

Градуировочная характеристика считается стабильной, если для каждого из используемого для контроля градуировочного раствора сохраняется соотношение:

где X - концентрация спиротетрамата и спиротетрамат-енола в пробе при контрольном измерении, нг/см³;

C - известная концентрация градуировочного раствора, взятая для контроля стабильности градуировочной характеристики, нг/см³;

B - норматив контроля стабильности градуировочной характеристики, % (равен 20% при P = 0,95).

9.1. Отбор проб осуществлен в соответствии с методическими документами <3>.

--------------------------------

<3> Унифицированные правила отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов от 21.08.1979 N 2051-79, Методические указания по регистрационным испытаниям пестицидов в части биологической эффективности, ГОСТ 7176 "Картофель продовольственный. Технические условия".

9.2. Растительные пробы хранят при температуре (2 - 6) °C не более недели. Для длительного хранения образцы замораживают и хранят при температуре не выше -18 °C. Перед анализом образцы измельчают.

10.1. Экстракция. Ботва и корнеплоды сахарной свеклы.

Измельченный образец массой 10 г помещают в плоскодонную колбу вместимостью 250 см³, добавляют 40 см³ смеси для экстракции, приготовленной по п. 8.5.1, интенсивно встряхивают в течение 1 мин и помещают на аппарат для встряхивания на 30 минут.

Пробам дают отстояться, затем надосадочную жидкость фильтруют на воронке Бюхнера с помощью разряжения, создаваемого водоструйным насосом, через двойной бумажный фильтр средней плотности. Растительный остаток на фильтре промывают 10 см³ смеси для экстракции, подготовленной по п. 8.5.1.

Этой же смесью при необходимости объем экстракта доводят до 50 см³.

Аликвоту экстракта 1 см³ переносят в градуированную пробирку на 20 см³ и доводят до метки смесью, приготовленной по п. 8.5.2. Тщательно перемешивают и фильтруют через мембранный фильтр (размер пор 0,20 мкм) в виалу вместимостью 2 см³ с фторопластовой прокладкой и навинчивающейся крышкой. Помещают в автосамплер хроматографа для анализа на содержание спиротетрамата и спиротетрамат-енола в условиях хроматографирования по п. 10.2.

10.2. Измерения выполняют на жидкостном хроматографе с тандемным масс-спектрометрическим детектором: тройной квадруполь с источником ионизации, оснащенным соосной подачей горячего азота для эффективной десольвации ионов при следующих режимных параметрах:

- источник ионизации: электростатическое распыление;

- режим работы: регистрация дочерних положительных ионов после разрушения материнских ионов (регистрация "перехода") в режиме мультиреакционного мониторинга.

Параметры масс-спектрометрического детектора:

Спиротетрамат:

- материнский ион (масса/заряд): 374,2;

- дочерние ионы (масса/заряд): 302 (количественный расчет), 216,02 (подтверждающий ион);

- напряжение на фрагментаторе, В: 110;

- энергия разрушения (соударения), В: 30 , 10 .

Спиротетрамат-енол:

- материнский ион (масса/заряд): 302,2;

- дочерние ионы (масса/заряд): 216 (количественный расчет), 270,1 (подтверждающий ион);

- напряжение на фрагментаторе, В: 129;

- энергия разрушения (соударения), В: 30 , 20 ;

- давление на распылителе: 35 psi;

- скорость осушающего газа 1 (азот): 10 дм³/мин;

- температура газа 1: 325 °C;

- скорость газа 2 (азот): 12 дм³/мин;

- температура газа 2: 400 °C;

- температура квадруполей (1 и 3): 100 °C.

Условия хроматографирования:

- хроматографическая колонка стальная, длиной 50 мм, внутренним диаметром 2,1 мм, заполненная обращенно-фазным сорбентом с привитыми монофункциональными полярными группами C18, зернением 1,8 мкм;

- температура колонки: 30 °C;

- скорость потока элюента: 0,4 см³/мин;

- объем вводимой пробы: 10 мм³;

- подвижная фаза: ацетонитрил - вода (1:1, по объему, 0,22 см³/дм³ муравьиной кислоты).

Линейный диапазон детектирования 1 - 10 пг.

Образцы, дающие пики большие, чем градуировочный раствор с концентрацией 1,0 нг/см³, разбавляют подвижной фазой (не более чем в 50 раз).

11.1. Содержание спиротетрамата в пробах ботвы и корнеплодов сахарной свеклы с учетом его основного метаболита спиротетрамат-енола в эквиваленте действующего вещества (X, мг/кг) рассчитывают по формуле:

где A, B - концентрации спиротетрамата и спиротетрамат-енола соответственно, найденные по градуировочным графикам в соответствии с величинами площадей хроматографических пиков, нг/см³;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, см³;

m - масса анализируемого образца, г;

C - коэффициент, учитывающий объем экстракта, взятого для анализа, C = 50;

K - коэффициент пересчета содержания метаболита спиротетрамат-енола на эквивалент спиротетрамата, по соотношению молекулярных масс (равен 1,24).

11.2. Проверка приемлемости результатов параллельных определений.

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:

где X₁, X₂ - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости (таблица 3.1), при этом .

При невыполнении условия выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

12.1. Результат анализа представляют в виде:

где - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

- граница абсолютной погрешности, мг/кг;

где - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, таблица 3.1), %.

Если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде: "содержание спиротетрамата и спиротетрамат-енола в пробах ботвы и корнеплодов сахарной свеклы - менее 0,01 мг/кг" <4>.

--------------------------------

<4> 0,001 мг/кг - нижний предел количественного определения мефентрифлуконазола.

13.1. Контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-(1 - 6). Периодичность и формы контроля определяются Руководством по качеству.

1. ГОСТ Р ИСО 5725 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

2. ГОСТ Р 53228 "Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания".

3. ГОСТ OIML R 111-1 "Государственная система обеспечения единства измерений (ГСИ). Гири классов E(1), E(2), F(1), F(2), M(1), M(1-2), M(2), M(2-3) и M(3). Часть I. Метрологические и технические требования".

4. ГОСТ 1770 "Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия".

5. ГОСТ 29227 "Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть I. Общие требования".

6. ГОСТ 25336 "Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры".

7. ГОСТ 9147 "Посуда и оборудование лабораторные фарфоровые. Технические условия".

8. ГОСТ 9293 (ИСО 2435) "Азот газообразный и жидкий. Технические условия".

9. ГОСТ 5848 "Реактивы. Кислота муравьиная. Технические условия".

10. ГОСТ 6995 "Реактивы. Метанол-яд. Технические условия".

11. ГОСТ 4221 "Калий углекислый. Технические условия".

12. ГОСТ Р 52501 "Вода для лабораторного анализа. Технические условия".

13. ГОСТ ISO 7886-1 "Шприцы инъекционные однократного применения стерильные. Часть 1. Шприцы для ручного использования".

14. ГОСТ 12.1.004 "Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования".

15. ГОСТ 12.1.007 "Система стандартов безопасности труда (ССБТ). Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности".

16. ГОСТ 12.1.019 "Система стандартов безопасности труда (ССБТ). Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты".

17. ГОСТ 12.0.004 "Система стандартов безопасности труда (ССБТ). Организация обучения безопасности труда. Общие положения".

18. ГОСТ 12.4.009 "Система стандартов безопасности труда (ССБТ). Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание".

19. ГОСТ 33884 "Свекла сахарная. Технические условия".

20. Унифицированные правила отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов N 2051-79 от 21.08.79.