"МУК 4.1.3611-20. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств ацетамиприда в винограде методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 30.07.2020)

1. Разработаны ФБУН "Федеральный научный центр гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана" Роспотребнадзора (В.Н. Ракитский, Н.Е. Федорова, В.В. Баюшева, Ж.А. Чистова).

2. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 30 июля 2020 г.

3. Введены впервые.

1.1. Настоящие методические указания (далее - МУК) устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения в винограде массовой концентрации ацетамиприда в диапазоне 0,005 - 0,1 мг/кг.

1.2. МУК предназначены для органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, а также могут быть использованы организациями, осуществляющими исследования в области безопасности и качества пищевой продукции и продовольственного сырья.

1.3. МУК носят рекомендательный характер.

2.1. Ацетамиприд. (E)-N¹-[(6-хлор-3-пиридил)метил]-N²-циано-N¹-метилацетамиприд <1>. Брутто формула - C₁₀H₁₁ClN₄. Молекулярная масса 222,7.

--------------------------------

<1> В соответствии с Международным союзом теоретической и прикладной химии (ИЮПАК, англ. International Union of Pure and Applied Chemistry, IUPAC).

Бесцветное кристаллическое вещество. Температура плавления 98,9 °C. Давление паров < 1,0·10^-3 мПа (при 25 °C). Коэффициент распределения н-октанол-вода K_ow logP = 0,80 (25 °C). Хорошо растворим в ацетоне, метаноле, этаноле, дихлорметане, хлороформе, ацетонитриле и тетрагидрофуране, растворимость в н-гексане - 6,5 мг/дм³. Растворимость в воде при 25 °C - 4,25 г/дм³. Ацетамиприд стабилен в буферных растворах при pH 4, 5, 7, медленно разлагается при pH 9. Устойчив к воздействию солнечного света. Является слабым основанием, pKa - 0,7.

2.2. Острая пероральная токсичность (LD₅₀) для крыс - 217 мг/кг (самцы), 146 мг/кг (самки); острая дермальная токсичность (LD₅₀) для крыс > 2000 мг/кг; острая ингаляционная токсичность (LD₅₀) для крыс > 290 мг/дм³ (4 часа).

2.3. Инсектицид системного, контактного и кишечного действия из группы неоникотиноидов, эффективно подавляет развитие тли, белокрылки, клопов, трипсов и жесткокрылых в посевах многих культур, особенно овощных и плодовых.

3.1. При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 3.1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для всего диапазона измерений (n = 20) приведены в табл. 3.2.

4.1. Методика основана на определении вещества с помощью обращено-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии с тройным квадрупольным масс-спектрометрическим детектором.

4.2. Экстракцию ацетамиприда из анализируемых проб выполняют ацетонитрилом, содержащим 1% уксусной кислоты, с использованием смеси солей для экстракции (смесь сульфата магния и хлорида натрия). Очистку экстрактов проводят методом дисперсионной твердофазной экстракции с применением смеси сорбентов на основе амина, октадецилсилана и графитизированной сажи.

4.3. Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.

4.4. Нижний предел измерения ацетамиприда в анализируемом объеме пробы - 10 пг.

5.1. При выполнении измерений и подготовке проб применяют средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы, приведенные в табл. 5.1 - 5.3.

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.

Примечание. Допускается использование вспомогательных средств измерений, устройств и материалов с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

6.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ Р 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

6.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004.

6.3. При работе с газами, находящимися в баллонах под давлением до 15 МПа (150 кгс/см²), необходимо соблюдать нормы и правила <2>. Запрещается открывать вентиль баллона, не установив в нем понижающий редуктор.

--------------------------------

<2> Правила промышленной безопасности опасных производственных объектов, на которых используется оборудование, работающее под избыточным давлением, утвержденные приказом Ростехнадзора от 25.03.2014 N 116.

6.4. Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист, имеющий опыт работы на жидкостном хроматографе, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений.

7.1. При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

8.1. Очистка растворителей.

8.1.1. Ацетонитрил. Ацетонитрил кипятят с обратным холодильником над пентоксидом фосфора (на 1 дм³ ацетонитрила 20 г пентоксида фосфора) не менее 1 часа, после чего перегоняют. Непосредственно перед употреблением ацетонитрил повторно перегоняют над прокаленным карбонатом калия (на 1 дм³ ацетонитрила 10 г карбоната калия).

8.2. Подготовка подвижной фазы для ВЭЖХ.

Элюент А: раствор 0,05% (вес/объем) формиата аммония + 0,01% (по объему) муравьиной кислоты в воде.

В мерную колбу вместимостью 1000 см³ помещают 0,5 г формиата аммония, растворяют в 300 - 400 см³ бидистиллированной воды, вносят 0,1 см³ муравьиной кислоты, доводят до метки водой, перемешивают.

Элюент Б: раствор 0,01% (по объему) муравьиной кислоты в метаноле.

В мерную колбу вместимостью 1000 см³ помещают 500 см³ метанола, вносят 0,1 см³ муравьиной кислоты, доводят до метки деионизированной водой, перемешивают.

Растворы компонентов подвижной фазы хранят в темном месте (в емкости из темного стекла) не более 14 дней.

8.3. Кондиционирование хроматографической колонки для ВЭЖХ.

Промывают колонку подвижной фазой (смесь компонентов А и Б, приготовленных по п. 8.2, в соотношении 1 : 1) при скорости подачи растворителя 0,4 см³/мин до установления стабильной базовой линии.

8.4. Приготовление раствора уксусной кислоты в ацетонитриле с объемной долей 1% (1%-й раствор).

В мерную колбу вместимостью 1000 см³ помещают 300 - 400 см³ ацетонитрила, вносят 10 см³ ледяной уксусной кислоты, перемешивают, доводят ацетонитрилом до метки, вновь перемешивают. Раствор хранят в темном месте (в емкости из темного стекла) не более 14 дней.

8.5. Приготовление градуировочных растворов и растворов внесения.

8.5.1. Исходный раствор ацетамиприда для градуировки (концентрация 100 мкг/см³). В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают (0,0100 +/- 0,0001) г ацетамиприда, добавляют 50 - 70 см³ ацетонитрила, перемешивают, доводят ацетонитрилом до метки, вновь перемешивают. Раствор хранится в морозильной камере при температуре -18 °C не более 3 месяцев.

Растворы N 1 - 6 готовят объемным методом путем последовательного разбавления исходного раствора для градуировки.

8.5.2. Раствор N 1 ацетамиприда для градуировки и внесения (концентрация 1 мкг/см³).

В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 1,0 см³ градуировочного раствора N 1 с концентрацией ацетамиприда 100,0 мкг/см³ (п. 8.5.1), доводят до метки ацетонитрилом, тщательно перемешивают, получают рабочий раствор N 2 с концентрацией ацетамиприда 1 мкг/см³. Раствор N 1 хранится в морозильной камере при температуре -18 °C не более месяца.

8.5.3. Рабочие растворы N 2 - 6 ацетамиприда для градуировки (концентрация 0,005 - 0,1 мкг/см³).

В 5 мерных колб вместимостью 100 см³ помещают по 10,0, 5,0, 2,0, 1,0 и 0,5 см³ градуировочного раствора N 1 с концентрацией ацетамиприда 1 мкг/см³ (п. 8.5.2), доводят до метки раствором, приготовленным по п. 8.4, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы N 2 - 6 с концентрацией ацетамиприда 0,1, 0,05, 0,02, 0,01 и 0,005 мкг/см³, соответственно.

Растворы хранятся в холодильнике (4 +/- 2) °C не более одной недели.

8.6. Приготовление смеси солей для экстракции.

Для приготовления одного набора смеси солей для экстракции смешивают (4,00 +/- 0,01) г магния сернокислого и (1,00 +/- 0,01) г натрия хлористого, до использования хранят в герметичной упаковке (не более 6 месяцев).

Примечание. Возможно использование коммерческих наборов солей для экстракции проб фруктов и овощей массой 10 г.

8.7. Приготовление смеси сорбентов для очистки экстрактов.

Для приготовления одного набора смеси сорбентов для очистки экстрактов в центрифужную полипропиленовую пробирку вместимостью 2 см³ помещают (50 +/- 4) мг сорбента для твердофазной экстракции на основе первичного-вторичного амина, (50 +/- 4) мг графитизированной сажи, (150 +/- 4) мг магния сернокислого и (50 +/- 4) мг твердофазного сорбента на основе октадецилсилана, закрывают герметично крышкой, встряхивают для перемешивания, хранят не более 6 месяцев.

Примечание. Возможно использование коммерческих дисперсионных наборов для фруктов и овощей с маслом и пигментами, помещенных в полипропиленовые пробирки вместимостью 2 см³.

8.8. Установление градуировочных характеристик.

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика от концентрации ацетамиприда в растворе, устанавливают методом абсолютной калибровки по 5 растворам для градуировки.

В инжектор хроматографа вводят по 2 мм³ каждого градуировочного раствора, приготовленного по п. 8.5.3, и анализируют в условиях хроматографирования по п. 10.3. Осуществляют не менее 5 параллельных измерений. Устанавливают площади пиков вещества, на основании которых строят градуировочную зависимость.

Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят в начале и по окончании каждой серии анализов.

При контроле стабильности градуировочной характеристики проводят измерения не менее двух образцов концентраций для градуировки, содержание ацетамиприда в которых должно охватывать весь диапазон концентраций от 0,005 до 0,1 мкг/см³.

Градуировочная характеристика считается стабильной, если для каждого используемого для контроля градуировочного раствора сохраняется соотношение:

X - концентрация ацетамиприда в пробе при контрольном измерении, мкг/см³;

C - известная концентрация градуировочного раствора ацетамиприда, взятая для контроля стабильности градуировочной характеристики, мкг/см³;

B - норматив контроля погрешности градуировочной характеристики, % (равен 10% при P = 0,95).

9.1. Отбор проб осуществляется в соответствии с методическими документами <3>.

--------------------------------

<3> ГОСТ 25896 "Виноград свежий столовый. Технические условия", "Унифицированные правила отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов", Методические указания по регистрационным испытаниям пестицидов в части биологической эффективности, Москва 2018. 64 с.

9.2. Отобранные пробы хранят при температуре (4 +/- 2) °C не более недели. Для длительного хранения образцы замораживают и хранят при температуре не выше минус 18 °C.

9.3. Перед анализом образцы измельчают.

10.1. Экстракция.

Образец измельченных проб винограда массой 10 г помещают в центрифужную полипропиленовую пробирку вместимостью 50 см³, вносят 10 см³ 1%-го раствора уксусной кислоты в ацетонитриле, помещают в пробирку керамический гомогенизатор, закрывают крышку и интенсивно встряхивают вручную 30 сек, вносят в пробирку смесь солей для экстракции (приготовленную по п. 8.6), закрывают крышкой и интенсивно встряхивают (вручную) в течение 1 мин. Затем пробу центрифугируют в течение 5 мин при скорости вращения 4000 оборотов/мин и подвергают очистке с применением дисперсионной твердофазной экстракции по п. 10.2.

10.2. Очистка экстракта.

Часть экстракта (верхний слой в пробирке после центрифугирования) объемом 1,5 - 1,8 см³ с помощью пипетки переносят в пропиленовую центрифужную пробирку, содержащую смесь сорбентов, приготовленную по п. 8.7. Закрывают крышку и интенсивно встряхивают вручную в течение 30 сек. Центрифугируют 15 мин при скорости вращения 4 000 оборотов/мин. Отбирают с помощью медицинского шприца раствор, фильтруют через мембранный фильтр (размер пор 0,22 мкм) в виалу вместимостью 2 см³ с фторопластовой прокладкой и навинчивающейся крышкой. Помещают в автосамплер хроматографа для анализа.

10.3. Условия хроматографирования.

Измерения выполняют при следующих режимных параметрах:

- жидкостный хроматограф с тандемным масс-спектрометрическим детектором: тройной квадруполь с источником ионизации, оснащенным соосной подачей горячего азота для эффективной десольвации ионов;

- источник ионизации: электроспрей или ионизация распылением в электрическом поле (ESI);

- режим работы: режим мониторинга заданных реакций (MRM);

- характеристические ионы: материнский ион (масса/заряд) 223,1; дочерние ионы (масса/заряд) 126,0 <4>, 56,0;

--------------------------------

<4> Ион, используемый для количественного расчета.

- напряжение на фрагментаторе, В: 100;

- энергия разрушения (соударения), В: ;

- скорость сканирования 200 мс;

- давление на распылителе 35 psi;

- скорость осушающего газа 1 (азот) 10 дм³/мин; температура газа 1 250 °C;

- скорость газа 2 (азот) 11 дм³/мин; температура газа 2 340 °C;

- температура квадруполей (1 и 3) 100 °C;

- хроматографическая колонка стальная длиной 150 мм, внутренним диаметром 2,1 мм, заполненная обращенно-фазным сорбентом с привитыми монофункциональными полярными группами C18, зернением 1,8 мкм; температура колонки 45 °C;

- скорость потока элюента 0,4 см³/мин;

- объем вводимой пробы 2 мм³;

- режим элюирования - градиентный (табл. 10.1);

- время анализа 8,5 мин;

- промывка колонки после анализа 1,5 мин.

Линейный диапазон детектирования 10 - 200 пг.

Образцы, дающие пики большие, чем градуировочный раствор с концентрацией вещества 0,1 мкг/см³, разбавляют подвижной фазой (не более чем в 50 раз).

Содержание ацетамиприда в винограде (X, мг/кг) рассчитывают по формуле:

A - концентрация ацетамиприда, найденная по градуировочному графику в соответствии с величинами площадей хроматографических пиков, мкг/см³;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, см³;

m - масса анализируемого образца, г;

K - коэффициент, учитывающий объем экстракта, взятого для анализа, K = 1;

f - полнота извлечения вещества (табл. 3.2), %;

100 - коэффициент перевода полноты извлечения вещества в относительные единицы.

13.1. Результат анализа представляют в виде:

- среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг

- граница абсолютной погрешности, мг/кг;

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 3.1), %.

Если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде: "Содержание ацетамиприда в винограде - менее 0,005 мг/кг" <5>.

--------------------------------

<5> 0,005 мг/кг - предел обнаружения ацетамиприда в винограде.

13.1. Организация контроля качества результатов определения осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.

Величина добавки C_д должна удовлетворять условию:

- характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно) мг/кг, при этом:

- граница абсолютной погрешности, мг/кг;

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 3.1), %.

Результат контроля процедуры К_к рассчитывают по формуле:

, , C_д - среднее арифметическое результатов параллельных определений, признанных приемлемыми, содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки соответственно, мг/кг;

Норматив контроля К рассчитывают по формуле

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (К_к) с нормативом контроля (К).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов параллельных определений.

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:

X₁, X₂ - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости (табл. 3.1), при этом .

При невыполнении условия выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

1. ГОСТ Р ИСО 5725-(1 - 6) "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

2. ГОСТ Р 53228-2008 "Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания".

3. ГОСТ OIML R 111-1 "Государственная система обеспечения единства измерений (ГСИ). Гири классов E(1), E(2), F(1), F(2), M(1), M(1-2), M(2), M(2-3) и M(3). Часть 1. Метрологические и технические требования".

4. ГОСТ 28498 "Термометры жидкостные стеклянные. Общие технические требования. Методы испытаний".

5. ГОСТ 1770 (ИСО 1042, ИСО 4788) "Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия".

6. ГОСТ 29227 "Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования".

7. ГОСТ 9293 "Азот газообразный и жидкий. Технические условия".

8. ГОСТ 4233 "Реактивы. Натрий хлористый. Технические условия".

9. ГОСТ Р 52501 "Вода для лабораторного анализа. Технические условия".

10. ГОСТ 4221 "Реактивы. Калий углекислый. Технические условия".

11. ГОСТ 6995 "Реактивы. Метанол-яд. Технические условия".

12. ГОСТ 5848 "Реактивы. Кислота муравьиная. Технические условия".

13. ГОСТ 61 "Реактивы. Кислота уксусная. Технические условия".

14. ГОСТ ISO 7886-1 "Шприцы инъекционные однократного применения стерильные. Часть 1. Шприцы для ручного использования".

15. ГОСТ 25336 "Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры".

16. ГОСТ 12.1.004 "Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования".

17. ГОСТ 12.1.007 "Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности".

18. ГОСТ 12.1.019 "Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты".

19. ГОСТ 12.4.009 "Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание".

20. ГОСТ 12.0.004 "Система стандартов безопасности труда (ССБТ). Организация обучения безопасности труда. Общие положения".

21. ГОСТ 25896 "Виноград свежий столовый. Технические условия".

22. Унифицированные правила отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов.

23. Методические указания по регистрационным испытаниям пестицидов в части биологической эффективности. Москва, 2018. 64 с.