"МУК 4.1.3653-20. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение стеринов в молоке и молочной продукции методом газовой хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 26.10.2020)

1. Разработаны ФБУЗ "Федеральный центр гигиены и эпидемиологии" Роспотребнадзора (В.Ю. Ананьев, А.А. Гарбузова, М.В. Зароченцев, О.В. Андросова, А.А. Константинов, М.И. Емельянов, А.О. Белушенко, М.М. Дударев).

2. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 26 октября 2020 г.

3. Введены впервые.

1.1. Настоящие методические указания (далее - МУК) распространяются на молоко и молочную продукцию и устанавливают количественный метод определения холестерина и качественный метод определения фитостеринов (брассикастерин, кампестерин, стигмастерин, бета-ситостерин) методом газовой хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием.

1.2. МУК предназначены для органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, осуществляющих контроль качества и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов, а также могут быть использованы организациями, аккредитованными в установленном порядке на проведение исследований продовольственного сырья, пищевых продуктов.

1.3. МУК носят рекомендательный характер.

2.1. Метод основан на предварительном гидролизе в жировой фазе молока и молочных продуктов стероидов в стерины и хроматографическом разделении методом газовой хроматографии и сравнении полученных масс-спектров стеринов со спектрами и временем удерживания стандартных веществ.

2.1. При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций (в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1 - 6).

Полнота извлечения, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для всего диапазона измерений (n = 20) приведены в таблице 2.

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание. Допускается использование реактивов с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание. Допускается применение оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

5.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования пожарной безопасности - по ГОСТ 12.1.004 и ГОСТ 12.1.018.

Требования электробезопасности при работе с приборами - по ГОСТ 12.1.019 и в соответствии с инструкцией по эксплуатации прибора.

5.2. Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист, имеющий опыт эксплуатации данного оборудования, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений.

6.1. При выполнении анализа в лаборатории следует соблюдать следующие условия:

- температура окружающего воздуха от 15 °C до 30 °C;

- относительная влажность воздуха от 20% до 80%.

7.1. Подготовка хромато-масс-спектрометра.

7.1.1. Хромато-масс-спектрометр для анализа в режиме ионизации пробы электронным ударом готовят в соответствии с инструкцией по эксплуатации и устанавливают требуемый режим для проведения анализа.

7.1.2. Хроматографические условия проведения анализа:

- инжектируемый объем анализируемой пробы - 1 мм³;

- температура испарителя - 300 °C;

- время задержки включения детектора - 5 мин;

- тип колонки - HP-5MS;

- газ-носитель - гелий;

- скорость потока гелия через колонку - 1 см³/мин;

- режим работы - без деления потока;

- температурная программа: начальная температура колонки - 150 °C, время анализа при этой температуре - 1 мин, скорость нагрева колонки 20 °C/мин до 290 °C, время анализа при этой температуре 12 мин, далее 20 °C/мин до 315 °C, время анализа при этой температуре 15 минут;

- энергия ионизации - 70 эВ;

- температура ионного источника - 200 °C;

- температура интерфейса - 270 °C;

- диапазон сканирования масс-ионов в режиме мониторинга отдельных ионов (англ. Single Ion Monitoring) (далее - SIM) (табл. 3).

При соблюдении всех вышеуказанных условий продолжительность анализа составляет 36 мин.

Примечание. Допустимо использование других хроматографических условий, обеспечивающих разделение компонентов в пробе, необходимую чувствительность и воспроизводимость.

7.2. Приготовление стандартных растворов стеринов.

7.2.1. Приготовление градуировочных растворов холестерина с массовой концентрацией 1,0 мг/см³.

Взвешивают 10,0 мг холестерина, переносят в мерную колбу вместимостью 10 см³ и растворяют в гексане. Растворы хранят в холодильнике при температуре минус 18 °C в течение 6 месяцев.

7.2.2. Приготовление градуировочных растворов холестерина.

Для определения холестерина из раствора с концентрацией 1,0 мг/см³ готовят градуировочные растворы массовой концентрации 100 мкг/см³ (раствор 1), 50 мкг/см³ (раствор 2), 25 мкг/см³ (раствор 3), 5 мкг/см³ (раствор 4), 1 мкг/см³ (раствор 5).

Для приготовления раствора 1 градуированной пипеткой в мерную колбу вместимостью 50 см³ переносят 5 см³ индивидуального раствора холестерина, доводят до метки гексаном и тщательно перемешивают.

Для приготовления градуировочного раствора 2 в хроматографическую виалу переносят 0,5 см³ градуировочного раствора 1 и 0,5 см³ гексана.

Для приготовления градуировочного раствора 3 в хроматографическую виалу переносят 0,5 см³ градуировочного раствора 2 и 0,5 см³ гексана.

Для приготовления градуировочного раствора 4 в хроматографическую виалу переносят 0,2 см³ градуировочного раствора 3 и 0,8 см³ гексана.

Для приготовления градуировочного раствора 5 в хроматографическую виалу переносят 0,2 см³ градуировочного раствора 4 и 0,8 см³ гексана.

Растворы хранят в холодильнике при температуре 4 °C в течение 1 месяца.

Допускается изменять массу навесок стеринов при приготовлении растворов стеринов массовой концентрации 1,0 мг/см³.

7.2.3. Приготовление раствора для качественного определения фитостеринов.

Взвешивают по 5,0 мг индивидуального стерина (брассикастерина, кампестерина, стигмастерина, ), переносят в мерную колбу вместимостью 10 см³ и растворяют в гексане. Раствор хранят в холодильнике при температуре минус 18 °C в течение 6 месяцев.

Готовят раствор фитостеринов с концентрацией 5 мкг/см³, который затем используют для определения времени удерживания анализируемых фитостеринов в условиях, приведенных в п. 7.1.

7.3. Раствор гидроксида калия в этаноле молярной концентрации 2 моль/дм³.

В мерной колбе вместимостью 1000 см³ взвешивают 112,1 +/- 0,1 г предварительно измельченного гидроксида калия и доводят объем раствора до метки этанолом, интенсивно перемешивают до полного растворения гидроксида калия и остужают до комнатной температуры.

Срок хранения раствора в плотно закрытой склянке при температуре 4 °C - не более 6 месяцев.

7.4. Построение градуировочной кривой.

При построении градуировочной зависимости для количественного определения холестерина анализируют рабочие стандартные градуировочные растворы п. 7.2.2 различных уровней концентраций в указанных условиях п. 7.1. Затем строят графики зависимости массы холестерина во вводимой пробе от площади хроматографического пика для фрагментарного иона, используемого для количественного определения. Построение графиков можно проводить при помощи программы для работы с электронными таблицами.

Масс-спектрометрический анализ проводят в режиме SIM по характеристическим ионам стеринов. Значения масс характеристических ионов приведены в табл. 3. При наличии неразделенных хроматографических пиков стеринов корректируют условия хроматографирования.

Градуировочная зависимость считается приемлемой, если рассчитанное значение квадрата коэффициента корреляции для градуировочной кривой составляет не менее 0,98.

Для построения градуировочной кривой каждый раствор (1 - 5) п. 7.2.2 анализируется не менее 5 раз.

8.1. Отбор проб к анализу производится в соответствии с ГОСТ 13928, ГОСТ 26809.1, ГОСТ 26809.2.

Перед началом проведения анализа отобранные пробы молока и молочных продуктов, за исключением молочных консервов и молочных продуктов в запаянных или закатанных банках, хранятся при температуре 4 °C, пробы мороженого - при температуре не превышающей 2 °C.

9.1. В коническую колбу вместимостью 250 см³, вносят 5 г анализируемой пробы продукта <1> (в зависимости от содержания жира масса навески может варьироваться), добавляют 20 см³ 2 М раствора гидроокиси калия, тщательно перемешивают и проводят гидролиз: кипячением на водяной бане с обратным холодильником не менее 60 мин, периодически тщательно перемешивая. Содержимое колбы охлаждают до температуры 40 °C и добавляют 10 см³ дистиллированной воды, затем помещают в делительную воронку вместимостью 250 см³. Добавляют 15 см³ гексана и экстрагируют неомыляемые вещества, осторожно встряхивая на протяжении одной минуты. Чтобы добиться лучшего разделения слоев добавляют 2 - 4 см³ этилового спирта. После расслоения фаз верхний гексановый слой сливают в коническую колбу, а нижний слой повторно экстрагируют новыми порциями гексана по 15 см³ каждая дважды. Экстракцию проводят вдали от прямого солнечного света, чтобы предохранить пробу от попадания на нее ультрафиолетовых лучей. Объединенный гексановый слой промывают в делительной воронке несколькими порциями по 20 см³ дистиллированной воды до нейтральной реакции промывных вод по универсальной индикаторной бумаге. Отмытую гексановую фракцию пропускают через бумажный фильтр, переносят в колбу для упаривания, упаривают раствор на роторном испарителе <2> при температуре не выше 30 °C, далее перерастворяют в 8 см³ гексана.

--------------------------------

<1> В случае густой или твердой пробы - следует растворить в подогретой дистиллированной воде. В случае необходимости предварительного выделения жира возможно применение метода Фолча, согласно которому экстракцию жирной фазы проводят смесью хлороформ-метанол (2:1).

<2> Допускается упаривание в токе азота.

9.2. Для дополнительной очистки проводят ТФЭ: картридж для ТФЭ заполняют 0,5 г сорбента оксидом алюминия <3>. Картридж промывают 5 см³ смеси хлористый метилен:метанол в соотношении 9:1, затем промывают 5 см³ гексана, после нанесения исследуемого раствора элюируют 10 см³ смесью хлористый метилен:метанол в соотношении 9:1, при этом собирают элюат. Полученный раствор анализируют с помощью газовой хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием.

--------------------------------

<3> Допускается использование других сорбентов, например, силикагеля.

10.1. Для оценки фона (чистоты аналитической системы) перед началом работы инжектируют в прибор 1 мм³ чистого растворителя (гексан) и записывают хроматограмму, на которой не должно присутствовать посторонних пиков.

10.2. В испаритель газового хроматографа вводят 1 мм³ анализируемой пробы продукта, подготовленной в соответствии с п. 9.1, далее выполняют хроматографическое разделение в условиях, приведенных в п. 7.1.2. Анализ проводят в режиме SIM характеристических ионов стеринов в соответствии с табл. 3 по п. 7.1.3. Записывают хроматограммы и идентифицируют индивидуальные стерины по масс-спектрам и совпадению времен удерживания. Подготовленную пробу продукта анализируют не менее двух раз.

11.1. В соответствии с данными, полученными при анализе градуировочных растворов, создают таблицу пиков с использованием программного обеспечения. Расчеты площади пика и массовой доли холестерина выполняются системой обработки данных в автоматическом режиме.

11.2. Массовую долю холестерина X, мг/100 г, вычисляют по формуле:

где C_ст - массовая концентрация холестерина в градуировочном растворе, мкг/см³;

S_х - площадь пика холестерина в анализируемой пробе, усл. ед.;

V_р - объем раствора для растворения стеринов после пробоподготовки, см³;

S_ст - площадь пика холестерина в градуировочном растворе, усл. ед.;

m - масса анализируемой пробы, г.

За окончательный результат принимают среднеарифметическое значение результатов двух параллельных измерений, округленное до второго знака.

11.3. Не учитывают пики стеринов с интенсивностью отклика сигнала менее 2% от высоты пика холестерина и с соотношением сигнал/шум менее 10.

11.1. За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

где X₁, X₂ - результаты параллельных определений, мг/100 г;

r - значение предела повторяемости (табл. 1), при этом .

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

13.1. Результат анализа представляют в виде:

где - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/100 г;

- граница абсолютной погрешности, мг/100 г;

где - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

14.1. Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1 - 6.

1. ГОСТ 12.1.004 "Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования".

2. ГОСТ 12.1.007 "Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности".

3. ГОСТ 12.1.010 "Система стандартов безопасности труда. Взрывобезопасность. Общие требования".

4. ГОСТ 12.1.018 "Система стандартов безопасности труда. Пожаровзрывобезопасность статического электричества. Общие требования".

5. ГОСТ 12.1.019 "Система стандартов безопасности труда (ССБТ). Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты".

6. ГОСТ OIML R 76-1 "Государственная система обеспечения единства измерений. Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания".

7. ГОСТ 1770 (ИСО 1042, ИСО 4788) "Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия".

8. ГОСТ ИСО 5725-1 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 1. Основные положения и определения".

9. ГОСТ Р ИСО 5725-6 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике".

10. ГОСТ 5962 "Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия".

11. ГОСТ Р 52501 "Вода для лабораторного анализа. Технические условия".

12. ГОСТ 13928 "Молоко и сливки заготовляемые. Правила приемки, методы отбора проб и подготовка их к анализу".

13. ГОСТ 24363 "Реактивы. Калия гидроокись. Технические условия".

14. ГОСТ 25336 "Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры".

15. ГОСТ 26809.1 "Молоко и молочная продукция. Правила приемки, методы отбора и подготовка проб к анализу. Часть 1. Молоко, молочные, молочные составные и молокосодержащие продукты".

16. ГОСТ 26809.2 "Молоко и молочная продукция. Правила приемки, методы отбора и подготовка проб к анализу. Часть 2. Масло из коровьего молока, спреды, сыры и сырные продукты, плавленые сыры и плавленые сырные продукты".