"МУК 4.1.3788-22. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств метрибузина в зерне и соломе зерновых культур методом капиллярной газожидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 20.10.2022)

1. Разработаны ФГБНУ "Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений" (И.А. Цибульская, П.А. Тарарин, Ф.И. Копытова).

2. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 20 октября 2022 г.

3. Введены впервые.

1.1. Настоящие методические указания (далее - МУК) устанавливают порядок применения метода капиллярной газожидкостной хроматографии (далее - ГЖХ) для определения массовой концентрации метрибузина в зерне в диапазоне концентраций (0,01 - 0,1) мг/кг и в соломе в диапазоне концентраций (0,05 - 0,5) мг/кг.

1.2. МУК предназначены для органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, осуществляющих контроль качества и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов, а также могут быть использованы организациями, аккредитованными на проведение исследований продовольственного сырья, пищевой продукции.

1.3. МУК носят рекомендательный характер.

2.1. Физико-химические свойства метрибузина.

4-Амино-6-трет-бутил-3-метилтио-1,2,4-триазин-5(4H)-он <1>.

--------------------------------

<1> В соответствии с Международным союзом теоретической и прикладной химии (ИЮПАК, англ. International Union of Pure and Applied Chemistry, IUPAC).

Белое кристаллическое вещество. Температура плавления плюс 126,2 °C. Давление пара (плюс 20 °C) менее 10^-5 мбар. Растворимость (плюс 20 °C): в воде - 1,2 г/л, в гексане - 2,0 г/л, в этаноле - 10 г/л, в метаноле - 450 г/л, в ацетонитриле - более 600 г/л, в этилацетате - более 600 г/л, в ацетоне - 820 г/л, в хлороформе - 850 г/л. Устойчив к действию разбавленных кислот и щелочей от pH 2,0 до pH 12,5 (при плюс 20 °C).

2.2. Острая пероральная токсичность (ЛД₅₀) для крыс 322 - 510 мг/кг, для мышей 698 - 711 мг/кг. Малотоксичен для большинства полезных насекомых. Умеренно токсичен для рыб.

Гербицид для борьбы с однолетними двудольными и злаковыми сорными растениями.

3.1. При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 3.1 для соответствующих диапазонов концентраций.

4.1. Метод основан на извлечении остаточных количеств метрибузина из анализируемого объекта органическими растворителями, проведении очистки экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей и на колонке с силикагелем. Идентификацию метрибузина проводят по времени удерживания. Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки с применением ГЖХ с электронозахватным детектором. Избирательность метода обеспечивается сочетанием условий подготовки проб и хроматографирования.

5.1. При выполнении измерений и подготовке проб применяют средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы, приведенные в табл. 5.1 - 5.3.

Примечание: Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание: Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.

Примечание: Допускается использование вспомогательных средств измерений, устройств и материалов с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

6.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать технику безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также технику безопасности, изложенную в технической документации на газовый хроматограф.

6.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004.

6.3. При работе с газами, находящимися в баллонах под давлением до 15 МПа (150 кгс/см²), необходимо соблюдать нормы и правила <2>. Запрещается открывать вентиль баллона, не установив в нем понижающий редуктор.

--------------------------------

<2> Приказ Ростехнадзора от 15.12.2020 N 536 "Об утверждении федеральных норм и правил в области промышленной безопасности "Правила промышленной безопасности при использовании оборудования, работающего под избыточным давлением" (зарегистрирован Минюстом России 31.12.2020, регистрационный N 61998).

6.4. Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист, имеющий опыт работы методом капиллярной ГЖХ, ознакомленный с руководством по эксплуатации хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений.

7.1. При выполнении измерений выполняют следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха плюс (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на газовом хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Отбор проб производится в соответствии с методическими документами <3>.

--------------------------------

<3> Унифицированные правила отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов, утвержденные заместителем Главного государственного санитарного врача СССР 21.08.1979 N 2051-79; ГОСТ Р ИСО 24333 "Национальный стандарт Российской Федерации. Зерно и продукты его переработки. Отбор проб".

Пробы зерна и соломы для определения остатков в урожае хранят в бумажной или тканевой упаковке при комнатной температуре. Перед анализом пробы зерна доводят до стандартной влажности и измельчают.

8.1. Кондиционирование колонки.

Перед началом анализа капиллярную колонку кондиционируют в токе азота при температуре плюс 250 °C до стабилизации нулевой линии.

8.2. Подготовка растворителей и приготовление растворов.

Растворители, используемые для анализа, специальной подготовки не требуют. Рекомендуется проверить чистоту применяемых растворителей. Для этого 100 см³ растворителя испаряют при помощи вакуумного ротационного испарителя до объема 1 см³ и хроматографируют. При обнаружении примесей, которые могут мешать определению, растворители очищают общепринятыми методами.

8.2.1. Приготовление смеси дихлорметан:этиловый эфир (80:20): в мерную колбу на 100 см³ вносят 20 см³ этилового эфира и доводят до метки дихлорметаном.

8.2.2. Приготовление насыщенного водного раствора хлористого натрия: 380 г NaCl растворяют при нагревании в 1000 см³ дистиллированной воды, полученный раствор фильтруют через бумажный фильтр средней плотности и охлаждают до комнатной температуры.

8.2.3. Приготовление 10% водного раствора гидроокиси калия:

10 г гидроокиси калия растворяют в 90 см³ дистиллированной воды, полученный раствор в колбе со шлифом хранят при комнатной температуре не более 1 месяца.

8.3. Приготовление основного и градуировочных растворов.

Основной раствор с концентрацией 0,1 мг/см³: точную навеску метрибузина (10,0 +/- 0,1) мг помещают в мерную колбу на 100 см³, растворяют в ацетоне и доводят объем до метки тем же растворителем.

Градуировочные растворы метрибузина с концентрациями 1,0; 0,5; 0,25; 0,2 и 0,1 мкг/см³ готовят методом последовательного разбавления основного раствора, используя ацетон.

8.3.1. Раствор N 1 с концентрацией метрибузина 1,0 мкг/см³: в мерную колбу на 100 см³ вносят 1,0 см³ основного раствора и доводят объем до метки ацетоном.

8.3.2. Раствор N 2 с концентрацией метрибузина 0,5 мкг/см³: в мерную пробирку на 10 см³ вносят 5,0 см³ раствора N 1 и доводят объем до метки ацетоном.

8.3.3. Раствор N 3 с концентрацией метрибузина 0,25 мкг/см³: в мерную колбу на 10 см³ вносят 2,5 см³ раствора N 1 и доводят объем до метки ацетоном.

8.3.4. Раствор N 4 с концентрацией метрибузина 0,2 мкг/см³: в мерную пробирку вместимостью 10 см³ вносят 2 см³ раствора N 1 и доводят объем до метки ацетоном.

8.3.5. Раствор N 5 с концентрацией метрибузина 0,1 мкг/см³: в мерную пробирку вместимостью 10 см³ помещают 5 см³ раствора N 4 и доводят объем до метки ацетоном.

Основной раствор хранят в холодильнике при температуре плюс (0 - 4) °C в течение 6 месяцев, градуировочные растворы - в течение 2-х недель. Для внесения в образец при определении полноты извлечения используют соответствующие градуировочные растворы метрибузина в ацетоне.

8.4. Построение градуировочного графика.

Для построения градуировочного графика в хроматограф вводят по 1,0 мм³ градуировочных растворов (не менее 3-х параллельных измерений для каждой концентрации и не менее 4-х точек по диапазону измеряемых концентраций). Затем измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации определяемого компонента в градуировочном растворе.

Методом наименьших квадратов рассчитывают градуировочный коэффициент (K) в уравнении линейной регрессии:

где S - площадь пика градуировочного раствора.

Градуировку признают удовлетворительной, если значение коэффициента линейной корреляции оказывается не ниже 0,99.

Градуировочную характеристику необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы, а также при отрицательном результате контроля градуировочного коэффициента.

Градуировочную зависимость признают стабильной при выполнении следующего условия:

где C - аттестованное значение массовой концентрации определяемого компонента в градуировочном растворе;

C_K - результат контрольного измерения массовой концентрации определяемого компонента в градуировочном растворе;

- норматив контроля градуировочного коэффициента, % ( при P = 0,95).

Градуировочную характеристику следует проверять перед началом измерений.

8.5. Подготовка колонки с силикагелем для очистки экстракта.

Силикагель прогревают в сушильном шкафу при плюс 150 °C в течение 4-х часов и охлаждают до комнатной температуры. Стеклянную колонку размером (30 x 1,0) см заполняют суспензией 3,0 г активированного силикагеля в 15 см³ дихлорметана. После стекания растворителя до верхнего края сорбента над слоем силикагеля помещают слой безводного сульфата натрия высотой (1,0 - 1,5) см и перед использованием промывают содержимое колонки 15 см³ смесью дихлорметан:этиловый эфир (80:20).

9.1. Экстракция метрибузина.

Аналитическую пробу зерна массой (10,0 +/- 0,1) г или соломы массой (2,0 +/- 0,1) г помещают в плоскодонную колбу на 250 см³, добавляют 100 см³ смеси ацетон:вода (95:5), слегка встряхивают и подвергают обработке в ультразвуковой ванне в течение 10 минут. После этого содержимое колбы фильтруют через бумажный фильтр низкой плотности в делительную воронку емкостью 500 см³. Внутренние стенки колбы с пробой ополаскивают 20 см³ ацетона и экстрагент также фильтруют в делительную воронку.

К объединенному водно-ацетоновому экстракту, находящемуся в делительной воронке, добавляют 150 см³ бидистиллированной воды, 10 см³ насыщенного водного раствора хлористого натрия и 1,0 см³ 10% водного раствора гидроокиси калия. После перемешивания в делительную воронку добавляют 50 см³ дихлорметана и энергично встряхивают содержимое воронки в течение 2-х минут. После 5-минутного отстаивания нижний дихлорметановый слой фильтруют через слой безводного сульфата натрия (толщина слоя ~ (1,0 - 1,5) см), помещенный на бумажный фильтр средней плотности в колбу-концентратор емкостью 250 см³. Экстрагирование и фильтрование повторяют еще два раза с использованием последовательно 30 и 20 см³ дихлорметана. После этого верхний водный слой отбрасывают.

Колбу-концентратор с объединенным дихлорметановым экстрактом подсоединяют к ротационному вакуумному испарителю и упаривают растворители при температуре плюс 40 °C до объема (5 - 10) см³. Экстракт переносят в коническую мерную пробирку емкостью 15 см³ и упаривают растворитель досуха в токе азота.

Сухой остаток растворяют в 1,0 см³ ацетона и проводят количественное определение метрибузина по п. 9.3.

В случае обнаружения в хроматографируемой пробе коэкстрактивных веществ, мешающих определению, проводят очистку экстракта на хроматографической колонке с силикагелем по п. 9.2.

9.2. Очистка экстрактов на колонке с силикагелем.

Хроматографируемый экстракт пробы, находящийся в конической пробирке, упаривают досуха в токе азота. Сухой остаток растворяют в 3,0 см³ дихлорметана и переносят его для очистки в подготовленную хроматографическую колонку с силикагелем. Метрибузин элюируют двумя объемами по 5,0 см³ смеси дихлорметан:этиловый эфир (80:20), собирая элюат в коническую пробирку емкостью 15 см³. Растворитель упаривают досуха в токе азота.

Сухой остаток растворяют в 1,0 см³ ацетона и анализируют на содержание метрибузина по п. 9.3.

9.3. Условия хроматографирования.

Газовый хроматограф с электронозахватным детектором и кварцевой капиллярной колонкой длиной 30 м, внутренним диаметром 0,25 мм с толщиной слоя неподвижной фазы (35% дифенилсилоксана + 65% диметилсилоксана) - 0,25 мкм.

Температуру колонки программируют от плюс 80 °C (1 мин) до плюс 280 °C со скоростью 20 °C/мин. Температура испарителя и детектора плюс 250 и плюс 300 °C соответственно. Расход газа-носителя (азот) 28 см³/мин, деление потока 1:20. Анализируемый объем экстракта 1,0 см³, хроматографируемый объем 1,0 мм³.

10.1. Количественное определение метрибузина проводят методом абсолютной калибровки, содержание в пробе X (мг/кг) вычисляют по формуле:

где S_x - площадь пика метрибузина на хроматограмме испытуемого образца;

K - градуировочный коэффициент, найденный на стадии построения соответствующей градуировочной зависимости;

V - объем пробы, подготовленной для хроматографического анализа, см³;

P - навеска анализируемого образца, г;

f - полнота извлечения метрибузина, приведенная в табл. 3.2, (%).

Содержание остаточных количеств метрибузина в анализируемом образце вычисляют как среднее из двух параллельных определений.

Образцы, дающие пики, большие, чем градуировочный раствор метрибузина с концентрацией 1,0 мкг/см³, разбавляют ацетоном.

11.1. За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:

где X₁, X₂ - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости (приведен в табл. 3.1).

При невыполнении этого условия выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

12.1. Результат анализа представляют в виде:

где X - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

- граница абсолютной погрешности, мг/кг;

где - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, приведена в табл. 3.1).

В случае, если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

содержание вещества в пробе "менее нижней границы определения", например: менее 0,01 мг/кг*, где * - 0,01 мг/кг - предел определения метрибузина в зерне.

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1 - 6.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

Величина добавки C_д должна удовлетворять условию:

где - характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно), мг/кг; при этом:

где - граница абсолютной погрешности, мг/кг:

где - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, приведена в табл. 3.1), %.

Результат контроля процедуры К_к рассчитывают по формуле:

где - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11.1) содержания компонента в образце с добавкой, мг/кг;

X_ср - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11.1) содержания компонента в испытуемом образце, мг/кг;

C_д - величина добавки, мг/кг.

Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (К_к) с нормативом контроля (К).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию:

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении этого условия процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости:

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

где X₁, X₂ - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;

R - предел воспроизводимости (приведен в табл. 3.1), %.

1. Федеральный закон от 30.03.1999 N 52-ФЗ "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения".

2. Приказ Ростехнадзора от 15.12.2020 N 536 "Об утверждении федеральных норм и правил в области промышленной безопасности "Правила промышленной безопасности при использовании оборудования, работающего под избыточным давлением".

3. Унифицированные правила отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов, утвержденные заместителем Главного государственного санитарного врача СССР 21.08.1979 N 2051-79.

4. ГОСТ Р ИСО 5725-1 - 6 "Государственный стандарт Российской Федерации. Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Части 1 - 6".

5. ГОСТ 12.1.007 "Межгосударственный стандарт. Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности".

6. ГОСТ 12.1.019 "Межгосударственный стандарт. Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты".

7. ГОСТ 12.1.004 "Межгосударственный стандарт. Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования".

8. ГОСТ 12.4.009 "Межгосударственный стандарт. Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание".

9. ГОСТ 12.0.004 "Межгосударственный стандарт. Система стандартов безопасности труда. Организация обучения безопасности труда. Общие положения".

10. ГОСТ Р 53228 "Национальный стандарт Российской Федерации. Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания".

11. ГОСТ Р 52501 "Национальный стандарт Российской Федерации. Вода для лабораторного анализа. Технические условия".

12. ГОСТ 29227 (ИСО 835-1) "Межгосударственный стандарт. Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования".

13. ГОСТ 9293 (ИСО 2435) "Межгосударственный стандарт. Азот газообразный и жидкий. Технические условия".

14. ГОСТ 23932 "Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Общие технические условия".

15. ГОСТ 25336 "Межгосударственный стандарт. Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры".

16. ГОСТ 24363 "Межгосударственный стандарт. Реактивы. Калия гидроокись. Технические условия".

17. ГОСТ 4166 "Государственный стандарт Союза ССР. Реактивы. Натрий сернокислый. Технические условия".

18. ГОСТ 4233 "Межгосударственный стандарт. Реактивы. Натрий хлористый. Технические условия".

19. ГОСТ 9737 "Межгосударственный стандарт. Посуда лабораторная стеклянная. Шлифы сферические взаимозаменяемые".

20. ГОСТ Р ИСО 24333 "Национальный стандарт Российской Федерации. Зерно и продукты его переработки. Отбор проб".