"МУК 4.1.3942-23. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств клоквинтосет-кислоты в воде, почве, зерне и соломе зерновых колосовых культур методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 04.07.2023)

1. Разработаны ФГБОУ ВО "Российский государственный аграрный университет - МСХА имени К.А. Тимирязева, Учебно-научный консультационный центр "Агроэкология пестицидов и агрохимикатов" Минсельхоза России (А.В. Довгилевич, Е.В. Довгилевич, А.С. Поликарпов, Е.Н. Тестова).

2. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 4 июля 2023 г.

3. Введены впервые.

1.1. Настоящие методические указания (далее - МУК) устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (далее - ВЭЖХ) для определения массовых концентраций клоквинтосет-кислоты в воде в диапазоне 0,005 - 0,050 мг/дм³ и в почве в диапазоне 0,01 - 0,10 мг/кг, а также уровня его остаточных количеств в зерне зерновых колосовых культур в диапазоне 0,01 - 0,10 мг/кг и в соломе зерновых колосовых культур в диапазоне 0,05 - 0,50 мг/кг.

1.2. МУК носят рекомендательный характер.

2.1. Физико-химические свойства клоквинтосет-кислоты.

Название действующего вещества по ИЮПАК: [(5-хлорхинолин-8-ил)окси] уксусная кислота.

Эмпирическая формула: C₁₁H₈ClNO₃.

Молекулярная масса: 237,6.

Агрегатное состояние: кристаллическое твердое вещество.

Цвет, запах: желтовато-коричневый, со слабым запахом.

Давление насыщенного пара при плюс 25 °C: 1,2 x 10^-7 Па.

Давление насыщенного пара при плюс 20 °C: 5,5 x 10^-8 Па.

Температура вспышки: не была зарегистрирована ниже плюс 400 °C.

Коэффициент распределения в системе октанол/вода зависит от значения pH (при плюс 20 °C): K_owlogP = 0,70 +/- 0,04 при pH 5, K_owlogP = 0,095 +/- 0,004 при pH 7, K_owlogP = 0,077 +/- 0,002 при pH 9.

Клоквинтосет-кислота - слабая кислота, константа диссоциации (pKa, при плюс 25 °C) - 4,8 (1,7 x 10^-5).

Растворимость в воде зависит от значения pH (при 20 °C): 451 мг/дм³ при pH 7, 3,12 г/дм³ при pH 5 и более 50 г/дм³ при pH 7 - 9.

Клоквинтосет-кислота имеет высокую температуру воспламенения и не подвержена окислению.

2.2. Клоквинтосет-кислота относится к малоопасным веществам по острой пероральной (ЛД₅₀ для крыс более 2000 мг/кг), дермальной токсичности (ЛД₅₀ для крыс более 5000 мг/кг) и по ингаляционной токсичности (ЛК₅₀ для крыс (4 часа) более 6110 мг/м³). Не раздражает кожу кроликов, слегка раздражает глаза кроликов.

2.3. Клоквинтосет-кислота способствует ускорению процесса детоксикации некоторых препаратов в злаках, повышению устойчивости к ним урожая. Используется в комбинации с гербицидами в качестве антидота. Применяется на посевах зерновых колосовых культур.

3.1. Метод основан на определении клоквинтосет-кислоты методом ВЭЖХ с использованием диодно-матричного детектора.

Определение клоквинтосет-кислоты в воде проводится после очистки образца воды на концентрирующем патроне N 1 с полимерным сорбентом.

Определение клоквинтосет-кислоты в почве проводится после ее экстракции из образцов смесью метилового спирта с цитратным буфером и дальнейшей очистки экстракта на концентрирующем патроне N 1 с полимерным сорбентом.

Определение клоквинтосет-кислоты в зерне зерновых колосовых культур проводится после ее экстракции из образцов смесью ацетонитрила с соляной кислотой и дальнейшей очистки экстракта на концентрирующем патроне N 1 с полимерным сорбентом.

Определение клоквинтосет-кислоты в соломе зерновых колосовых культур проводится после ее экстракции из образцов ацетонитрилом, дальнейшей очистки экстракта перераспределением между двумя несмешивающимися фазами и очистки экстракта на концентрирующем патроне N 1 с полимерным сорбентом.

Идентификация вещества проводится по времени удерживания, а количественное определение - методом абсолютной калибровки.

В предлагаемых условиях анализа метод специфичен. Специфичность обеспечивается подбором состава подвижной фазы и выбором колонок различной полярности.

4.1. При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительные интервалы среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в табл. 2.

5.1. Средства измерений:

- весы аналитические класса точности по ГОСТ Р 53228 - специальный (I) с наибольшим пределом взвешивания до 110 г и дискретностью 0,0001 г;

- весы лабораторные общего назначения класса точности по ГОСТ Р 53228 - средний (III) с наибольшим пределом взвешивания до 400 г и пределом допустимой погрешности +/- 0,5 г;

- колбы мерные на 10, 100, 250, 500 и 1000 см³, ГОСТ 1770;

- пипетки мерные на 1,0; 2,0 и 5,0 см³, ГОСТ 29227;

- цилиндры мерные на 10, 25, 50, 100, 250, 500 и 1000 см³, ГОСТ 1770;

- хроматографическая система, включающая:

- хроматограф жидкостный с диодно-матричным детектором, снабженный термостатом для колонок с диапазоном температур от плюс 15 до плюс 80 °C, и с возможностью использования стандартного автосамплера с дозирующим объемом от 0,1 до 100 мм³ для автоматического ввода пробы в хроматографическую систему;

- компьютерное программное обеспечение, контролирующее работу всего прибора, обеспечивающее сбор и хранение всех хроматограмм в процессе проведения хроматографического анализа, обеспечивающее обработку результатов измерений, вывод и расчет хроматограмм и количественный анализ.

5.2. Реактивы:

- клоквинтосет-кислота, аналитический стандарт с содержанием действующего вещества не менее 99,7%;

- ацетонитрил, особой чистоты, УФ-200 нм;

- вода дистиллированная по ГОСТ 6709 и (или) бидистиллированная (вода дистиллированная, перегнанная повторно в стеклянной емкости);

- гелий, очищенный;

- n-гексан, химически чистый;

- кальций хлористый, чистый;

- кислота лимонная, чистая для анализа, ГОСТ 3652;

- кислота муравьиная, чистая для анализа, ГОСТ 5848;

- кислота соляная, химически чистая для анализа, ГОСТ 3118;

- концентрирующие патроны для твердофазной экстракции с полимерным сорбентом (П) (объем - 1 см³, масса сорбента - 0,6 г) (патрон N 1);

- метилен хлористый, химически чистый;

- натрия гидроокись, химически чистая, ГОСТ 4328;

- натрий сернокислый, безводный, химически чистый, ГОСТ 4166;

- натрий углекислый, кислый, химически чистый, ГОСТ 4201;

- спирт метиловый (метанол), химически чистый, ГОСТ 6995.

5.3. Вспомогательные устройства, материалы:

- аллонж прямой с отводом для вакуума для работы с концентрирующими патронами, ГОСТ 25336;

- аппарат для встряхивания проб с возвратно-поступательным направлением колебаний, с максимальной загрузкой 10 кг, с амплитудой колебаний 30 мм и скоростью от 10 до 300 колебаний в минуту;

- банки полипропиленовые с крышками для экстракции вместимостью 250 см³;

- ванна ультразвуковая с потребляемой мощностью 140 Вт, рабочей частотой 50 Гц, рабочим объемом 4,5 дм³;

- вата медицинская гигроскопическая хлопковая нестерильная, ГОСТ 5556;

- виалы объемом 2 см³, закрываемые завинчивающейся или запрессовывающейся крышкой с тефлонированной резиновой прокладкой, прокалываемой микрошприцем для автоматического дозатора проб;

- воронки делительные на 250 и 500 см³, ГОСТ 25336;

- воронки лабораторные стеклянные, ГОСТ 25336;

- испаритель ротационный вакуумный с ручным подъемником, с диагональным конденсором и объемом испарительной колбы от 50 до 3000 см³, с изменяемой скоростью вращения штока испарителя от 5 до 240 об/мин, с водяной баней с антикоррозионным покрытием объемом 5 дм³ и с диапазоном температур от плюс 20 до плюс 100 °C;

- колбы конические плоскодонные на 100, 250 и 1000 см³, ГОСТ 25336;

- колбы круглодонные со шлифом на 100, 250 см³ и 4000 см³ ТС;

- колонка хроматографическая стальная длиной 250 мм, с внутренним диаметром 4,6 мм, зернением 5 мкм, заполненная сорбентом с привитыми полярными группами C8;

- насос диафрагменный, химически стойкий на 100%, с мощностью электропривода 245 Вт, предельным вакуумом 100 мбар/абс, с избыточным давлением 1 бар и скоростью откачки 34 дм³/мин;

- стаканы стеклянные, термостойкие объемом 100 - 1000 см³, ГОСТ 25336;

- установка для перегонки растворителей с круглодонной колбой объемом 4000 см³ и приемной конической колбой объемом 1000 см³;

- центрифуга лабораторная настольная с максимальным рабочим числом оборотов 4000 об/мин, с рабочим объемом ротора 200 см³ x 4 ячейки, выбираемый временной диапазон работы от 0 до 100 минут и с набором полипропиленовых банок емкостью 200 см³;

- фильтры обеззоленные нейтральные, быстро фильтрующие, диаметром 11 см, зольность одного фильтра 0,00072 г;

- фильтры мембранные для очистки растворителей, диаметром 47 мм с отверстиями пор 0,45 мкм;

- шприц инъекционный многократного применения объемом 10 см³, ГОСТ 22967.

Примечание. Допускается применение других средств измерений, вспомогательного оборудования, а также посуды, реактивов и материалов, не уступающих вышеуказанным по метрологическим и техническим характеристикам.

6.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на газовый хроматограф.

6.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004.

7.1. Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист, имеющий опыт работы на газовом хроматографе, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений.

8.1. Отбор проб производится в соответствии с правилами <1>.

--------------------------------

<1> Унифицированные правила отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов, утвержденные заместителем Главного государственного санитарного врача СССР 21.08.1979 N 2051-79.

Пробы воды хранят в стеклянной герметично закрытой таре в холодильнике при температуре плюс (4 +/- 2) °C не более 10 суток.

Для длительного хранения проб почву подсушивают при комнатной температуре в отсутствие прямого солнечного света.

Сухие почвенные образцы могут храниться в темной таре в течение года. Перед анализом сухую почву просеивают через сито с отверстиями диаметром 1 мм.

Отобранные пробы зерна и соломы подсушивают до стандартной влажности и хранят в бумажных или тканевых мешочках в сухом, хорошо проветриваемом шкафу, недоступном для грызунов.

9.1. При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха плюс (20 +/- 5) °C, относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

10.1. Выполнению измерений предшествуют следующие операции: очистка растворителей (при необходимости), приготовление растворов, кондиционирование.

Подготовка органических растворителей.

10.1.1. Очистка ацетонитрила.

Ацетонитрил, содержащий воду, предварительно осушают, добавляя в него гранулированный безводный хлористый кальций из расчета не менее 100 г/дм³. Выдерживают его над осушителем в течение 5 - 6 часов. Затем ацетонитрил сливают с осушителя в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 см³ аппарата для перегонки растворителей.

Ацетонитрил перегоняют при температуре плюс 81,5 °C, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше плюс 81,5 °C, отбрасывают.

10.1.2. Очистка хлористого метилена.

Хлористый метилен промывают равным объемом 5%-го раствора натрия углекислого кислого (безводного), осушают, добавляя в него гранулированный безводный хлористый кальций из расчета не менее 100 г/дм³. Выдерживают его над осушителем в течение 12 - 24 часов. Затем хлористый метилен сливают с осушителя в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 см³ аппарата для перегонки растворителей. Хлористый метилен перегоняют при температуре плюс 40,0 °C, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше плюс 40,0 °C, отбрасывают.

10.1.3. Очистка гексана.

Гексан, содержащий воду, предварительно осушают, добавляя в него гранулированный безводный хлористый кальций из расчета не менее 100 г/дм³. Выдерживают его над осушителем в течение 5 - 6 часов. Затем гексан сливают с осушителя в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 см³ аппарата для перегонки растворителей.

Гексан перегоняют при температуре плюс 68,7 °C, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше плюс 68,7 °C, отбрасывают.

10.1.4. Приготовление бидистиллированной воды.

Дистиллированную воду помещают в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 см³ аппарата для перегонки растворителей, добавляют к ней марганцовокислый калий из расчета 1 г/дм³ и кипятят в течение 6 часов.

Собирают фракции, отогнанные при температуре плюс 100,0 °C, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше плюс 100,0 °C, отбрасывают.

10.2. Приготовление растворов для проведения анализа.

10.2.1. Приготовление подвижной фазы для ВЭЖХ.

Для приготовления подвижной фазы используют свежеперегнанный ацетонитрил, бидистиллированную воду, муравьиную кислоту и метиловый спирт. Ацетонитрил и бидистиллированную воду предварительно фильтруют через мембранные фильтры для очистки растворителей.

В плоскодонную колбу объемом 1000 см³ помещают 600 см³ 0,1%-го водного раствора муравьиной кислоты, 300 см³ ацетонитрила и 100 см³ метилового спирта. Смесь тщательно перемешивают.

В случае отсутствия в хроматографической системе автоматического дегазатора через раствор подвижной фазы пропускают газообразный гелий со скоростью 20 см³/мин в течение 5 минут, после чего его помещают в ультразвуковую ванну для удаления растворенных газов на 1 минуту.

10.2.2. Приготовление рабочих растворов.

10.2.2.1. Приготовление 0,1%-го водного раствора муравьиной кислоты.

В мерную колбу объемом 1000 см³ помещают 500 см³ бидистиллированной воды, прибавляют 1,0 см³ муравьиной кислоты, доводят объем профильтрованной через мембранный фильтр бидистиллированной водой до метки и перемешивают.

10.2.2.2. Приготовление 0,1%-го раствора муравьиной кислоты в ацетонитриле.

В мерную колбу объемом 100 см³ помещают 50 см³ ацетонитрила, прибавляют 0,1 см³ муравьиной кислоты, перемешивают и доводят ацетонитрилом объем в колбе до метки.

10.2.2.3. Приготовление 0,1%-го раствора муравьиной кислоты в метиловом спирте.

В мерную колбу объемом 100 см³ помещают 50 см³ метилового спирта, прибавляют 1,0 см³ муравьиной кислоты, перемешивают и доводят метиловым спиртом объем в колбе до метки.

10.2.2.4. Приготовление цитратного буфера.

В мерную колбу объемом 500 см³ помещают 300 см³ дистиллированной воды, прибавляют 13,4 г лимонной кислоты, перемешивают до полного растворения и постепенно добавляют 7,7 г гидроокиси натрия. Раствор перемешивают и после полного растворения и охлаждения раствора доводят объем до метки дистиллированной водой и перемешивают (примечание: при приготовлении раствора соблюдать осторожность и работать под тягой).

10.2.2.5. Приготовление 0,5%-го раствора соляной кислоты в ацетонитриле.

В мерную колбу объемом 1000 см³ помещают 600 см³ ацетонитрила, прибавляют 5 см³ соляной кислоты, перемешивают и доводят ацетонитрилом объем в колбе до метки.

10.2.2.6. Приготовление 5%-го раствора натрия углекислого кислого.

50 г натрия углекислого кислого переносят в мерную колбу на 1000 см³, добавляют 200 - 300 см³ дистиллированной воды, перемешивают содержимое до полного растворения и доводят водой объем в колбе до метки.

10.2.3. Приготовление градуировочных растворов.

10.2.3.1. Стандартный раствор N 1 с концентрацией клоквинтосет-кислоты 100,0 мкг/см³.

Взвешивают 10 мг клоквинтосет-кислоты в мерной колбе объемом 100 см³. Навеску растворяют в метиловом спирте и доводят объем до метки метиловым спиртом. Полученный стандартный раствор N 1 используется для приготовления стандартных растворов для хроматографического исследования и установления градуировочной характеристики. Стандартный раствор N 1 хранится в холодильнике при температуре не выше плюс (4 +/- 2) °C не более 96 дней.

10.2.3.2. Стандартный раствор N 2 с концентрацией клоквинтосет-кислоты 10,0 мкг/см³.

Из стандартного раствора N 1 отбирают пипеткой 1 см³, помещают в мерную колбу объемом 10 см³ и доводят объем до метки ацетонитрилом. Полученный стандартный раствор N 2 используется для приготовления стандартных растворов для хроматографического исследования и установления градуировочной характеристики. Стандартный раствор N 2 хранится в холодильнике при температуре не выше плюс (4 +/- 2) °C не более 96 дней.

10.2.3.3. Стандартный раствор N 3 с концентрацией клоквинтосет-кислоты 1,0 мкг/см³.

Из стандартного раствора N 2 отбирают пипеткой 1 см³, помещают в мерную колбу объемом 10 см³ и доводят объем до метки смесью ацетонитрила с водой в соотношении 2:8. Стандартный раствор N 3 используется для установления градуировочной характеристики и хранится при температуре не выше плюс (4 +/- 2) °C не более 96 дней.

10.2.3.4. Стандартный раствор N 4 с концентрацией клоквинтосет-кислоты 0,5 мкг/см³.

Из стандартного раствора N 3 отбирают пипеткой 5 см³, помещают в мерную колбу объемом 10 см³ и доводят объем до метки смесью ацетонитрила с водой в соотношении 2:8. Стандартный раствор N 4 используется для установления градуировочной характеристики и хранится при температуре не выше плюс (4 +/- 2) °C не более 96 дней.

10.2.3.5. Стандартный раствор N 5 с концентрацией клоквинтосет-кислоты 0,2 мкг/см³.

Из стандартного раствора N 3 отбирают пипеткой 2 см³, помещают в мерную колбу объемом 10 см³ и доводят объем до метки смесью ацетонитрила с водой в соотношении 2:8. Стандартный раствор N 5 используется для установления градуировочной характеристики и хранится при температуре не выше плюс (4 +/- 2) °C не более 96 дней.

10.2.3.6. Стандартный раствор N 6 с концентрацией клоквинтосет-кислоты 0,1 мкг/см³.

Из стандартного раствора N 3 отбирают пипеткой 1 см³, помещают в мерную колбу объемом 10 см³ и доводят объем до метки смесью ацетонитрила с водой в соотношении 2:8. Стандартный раствор N 6 используется для установления градуировочной характеристики и хранится при температуре не выше плюс (4 +/- 2) °C не более 96 дней.

10.2.3.7. Стандартный раствор N 7 с концентрацией клоквинтосет-кислоты 0,05 мкг/см³.

Из стандартного раствора N 6 отбирают пипеткой 5 см³, помещают в мерную колбу объемом 10 см³ и доводят объем до метки смесью ацетонитрила с водой в соотношении 2:8. Стандартный раствор N 7 используется для установления градуировочной характеристики и хранится при температуре не выше плюс (4 +/- 2) °C не более 96 дней.

10.2.3.8. Стандартные растворы клоквинтосет-кислоты с концентрацией 5,0; 2,5; 2,0; 1,0; 0,5; 0,4; 0,25 и 0,2 мкг/см³ для внесения в контрольные образцы воды, почвы, зерна и соломы.

Методом последовательного разведения ацетонитрилом из стандартного раствора N 2 готовят растворы, содержащие по 5,0; 2,5; 2,0; 1,0; 0,5; 0,4; 0,25 и 0,2 мкг/см³, и используют эти растворы для внесения в контрольные образцы воды, почвы, зерна и соломы зерновых колосовых культур. Стандартные растворы для внесения хранятся при температуре не выше плюс (4 +/- 2) °C не более 96 дней.

10.3. Установление градуировочной характеристики.

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади (высоты) пика от концентрации клоквинтосет-кислоты в растворе (мкг/см³), устанавливают методом абсолютной калибровки по 5 растворам для градуировки с концентрацией 1,0; 0,5; 0,2 и 0,1 и 0,05 мкг/см³.

В инжектор хроматографа вводят по 20 мм³ каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 11.5. Осуществляют не менее 5 параллельных измерений.

10.4. Подготовка концентрирующих патронов N 1 для очистки экстрактов и проверка хроматографического поведения клоквинтосет-кислоты на них (схема N 1).

10.4.1. Подготовка концентрирующих патронов N 1 для очистки экстракта (схема N 1).

Все процедуры происходят с использованием вакуума, скорость потока растворов через патрон не должна превышать 5 см³/мин.

Патрон N 1 устанавливают на аллонж с отводом для вакуума, сверху в патрон вставляют шприц с разъемом типа Люер объемом не менее 10 см³ (используют как емкость для элюентов).

Кондиционирование: концентрирующий патрон промывают 15 см³ метилового спирта, затем 10 см³ воды. Элюаты отбрасывают.

Нельзя допускать высыхания поверхности патрона.

10.4.2. Проверка хроматографического поведения клоквинтосет-кислоты на концентрирующих патронах N 1 (схема N 1).

В отгонную колбу объемом 100 см³ вносят 1 см³ стандартного раствора клоквинтосет-кислоты в ацетонитриле с концентрацией 1,0 мкг/см³ и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C.

Сухой остаток растворяют в 10 см³ бидистиллированной воды, обмывают стенки колбы и вносят раствор на подготовленный патрон. Элюат собирают в чистую отгонную колбу объемом 100 см³, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C.

Исходную колбу последовательно обмывают 10 см³ 0,1%-го раствора муравьиной кислоты в ацетонитриле, 10 см³ 1,0%-го раствора муравьиной кислоты в метиловом спирте и вносят раствор на патрон. Элюаты собирают в чистые отгонные колбы объемом 100 см³, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 40 °C. Колбы отдувают током холодного воздуха до исчезновения запаха муравьиной кислоты.

Сухой остаток каждой фракции растворяют в 1 см³ смеси ацетонитрила с водой в соотношении 2:8 и хроматографируют.

Определяют фракции, содержащие клоквинтосет-кислоту, полноту смывания с патрона и необходимый объем элюента.

Изучение поведения клоквинтосет-кислоты на концентрирующих патронах N 1 (схема N 1) проводят каждый раз при отработке методики или поступлении новой партии патронов.

10.5. Подготовка концентрирующих патронов N 1 для очистки экстрактов и проверка хроматографического поведения клоквинтосет-кислоты на них (схема N 2).

10.5.1. Подготовка концентрирующих патронов N 1 для очистки экстракта (схема N 2).

Все процедуры происходят с использованием вакуума, скорость потока растворов через патрон не должна превышать 5 см³/мин.

Патрон N 1 устанавливают на аллонж с отводом для вакуума, сверху в патрон вставляют шприц с разъемом типа Люер объемом не менее 10 см³ (используют как емкость для элюентов).

Кондиционирование: концентрирующий патрон промывают 15 см³ ацетонитрила, затем 10 см³ воды. Элюаты отбрасывают.

10.5.2. Проверка хроматографического поведения клоквинтосет-кислоты на концентрирующих патронах N 1 (схема N 2).

В отгонную колбу объемом 100 см³ вносят 1 см³ стандартного раствора клоквинтосет-кислоты в ацетонитриле с концентрацией 1,0 мкг/см³ и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C.

Сухой остаток растворяют в 10 см³ бидистиллированной воды, тщательно обмывают стенки колбы, перемешивают и вносят на подготовленный патрон. Элюат собирают в чистую отгонную колбу объемом 100 см³, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C.

Исходную колбу обмывают 10 см³ смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:9, 10 см³ смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 и вносят раствор на патрон. Элюаты собирают в чистые отгонные колбы объемом по 100 см³, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C.

Сухой остаток каждой фракции растворяют в 1 см³ смеси ацетонитрила с водой в соотношении 2:8 и хроматографируют.

Определяют фракции, содержащие клоквинтосет-кислоту, полноту смывания с патрона и необходимый объем элюента.

Изучение поведения клоквинтосет-кислоты на концентрирующих патронах N 1 (схема N 2) проводят каждый раз при отработке методики или поступлении новой партии патронов.

10.6. Подготовка и кондиционирование колонки для жидкостной хроматографии.

Хроматографическую колонку с предколонкой устанавливают в термостате хроматографа и стабилизируют при температуре плюс 30 °C в течение 3 - 4 часов.

11.1. Вода.

11.1.1. Подготовка образца воды.

В химический стакан объемом 250 см³ отбирают пробу воды объемом 100 см³ и очищают ее на концентрирующем патроне N 1 (схема N 1).

11.1.2. Очистка пробы на концентрирующих патронах N 1 (схема N 1).

Пробу воды объемом 100 см³ вносят на заранее подготовленный концентрирующий патрон N 1 (п. 10.4.1). Элюат отбрасывают. Исходную колбу обмывают 10 см³ 0,1%-го раствора муравьиной кислоты в ацетонитриле и вносят раствор на патрон. Элюат отбрасывают.

Клоквинтосет-кислоту элюируют с патрона 10 см³ 1,0%-го раствора муравьиной кислоты в метаноле, элюат собирают в отгонную колбу объемом 100 см³ и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C. Отдувают током холодного воздуха до исчезновения запаха муравьиной кислоты.

Сухой остаток растворяют в 5 см³ смеси ацетонитрила с водой в соотношении 2:8 и 20 мм³ пробы вводят в хроматограф.

11.2. Почва.

11.2.1. Экстракция.

Образец почвы массой 20 г помещают в полипропиленовую банку для экстракции объемом 250 см³, прибавляют 10 см³ дистиллированной воды, 50 см³ смеси метилового спирта с цитратным буфером (п. 10.2.2.4) в соотношении 60:40 (по объему) и помещают на 5 минут в ультразвуковую ванну, затем на 5 минут в аппарат для встряхивания проб, а после центрифугируют 5 минут при 4000 об/мин. Экстракт фильтруют через бумажный фильтр низкой плотности в отгонную колбу объемом 250 см³. Экстракцию повторяют еще раз в тех же условиях, используя 50 см³ смеси метилового спирта с цитратным буфером (п. 10.2.2.4) в соотношении 60:40 (по объему). Экстракты фильтруют, объединяют в отгонной колбе объемом 250 см³ и выпаривают до водного остатка на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C.

11.2.2. Очистка экстракта на концентрирующих патронах N 1 (схема N 1).

Водный остаток, полученный по п. 11.2.1, вносят на заранее подготовленный концентрирующий патрон N 1 (п. 10.4.1). Элюат отбрасывают. Исходную колбу обмывают 10 см³ 0,1%-го раствора муравьиной кислоты в ацетонитриле и вносят раствор на патрон. Элюат отбрасывают.

Клоквинтосет-кислоту элюируют с патрона 10 см³ 1,0%-го раствора муравьиной кислоты в метаноле, элюат собирают в отгонную колбу объемом 100 см³ и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C. Отдувают током холодного воздуха до исчезновения запаха муравьиной кислоты.

Сухой остаток растворяют в 2 см³ смеси ацетонитрила с водой в соотношении 2:8 и 20 мм³ пробы вводят в хроматограф.

11.3. Зерно зерновых колосовых культур.

11.3.1. Экстракция.

Образец измельченного зерна массой 20 г помещают в полипропиленовую банку для экстракции объемом 250 см³, прибавляют 50 см³ 0,5%-го раствора соляной кислоты в ацетонитриле (п. 10.2.2.5) и помещают на 5 минут в ультразвуковую ванну, затем на 5 минут в аппарат для встряхивания проб. Экстракт фильтруют через бумажный фильтр низкой плотности в отгонную колбу объемом 250 см³. Экстракцию повторяют еще два раза в тех же условиях, используя по 50 см³ 0,5%-го раствора соляной кислоты в ацетонитриле. Экстракты фильтруют, объединяют в отгонной колбе объемом 250 см³м³ и выпаривают до сухого остатка на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C.

11.3.2. Очистка экстракта на концентрирующих патронах N 1 (схема N 2).

Сухой остаток, полученный по п. 11.3.1, растворяют в 10 см³ бидистиллированной воды, тщательно обмывают стенки колбы и вносят на заранее подготовленный концентрирующий патрон N 1 (п. 10.5.1). Исходную колбу обмывают 10 см³ смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:9, элюат отбрасывают.

Клоквинтосет-кислоту элюируют с патрона 10 см³ смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1. Элюат собирают в чистую отгонную колбу объемом 100 см³, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C.

Сухой остаток растворяют в 2 см³ смеси ацетонитрила с водой в соотношении 2:8 и 20 мм³ пробы вводят в хроматограф.

11.4. Солома зерновых колосовых культур.

11.4.1. Экстракция.

Образец измельченной соломы массой 5 г помещают в полипропиленовую банку для экстракции объемом 250 см³, прибавляют 70 см³ ацетонитрила и помещают на 5 минут в ультразвуковую ванну, затем на 5 минут на аппарат для встряхивания проб. Экстракт фильтруют через бумажный фильтр низкой плотности в отгонную колбу объемом 250 см³. Экстракцию повторяют еще один раз, используя 70 см³ ацетонитрила и помещая пробы на 5 минут в ультразвуковую ванну, а затем на 5 минут в аппарат для встряхивания проб. Экстракты фильтруют, объединяют в отгонной колбе объемом 250 см³ и выпаривают до сухого остатка на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C.

11.4.2. Очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей.

Сухой остаток, полученный по п. 11.4.1, растворяют в 20 см³ бидистиллированной воды, тщательно обмывают стенки колбы, добавляют 30 см³ гексана, перемешивают и переносят в делительную воронку на 250 см³. Воронку интенсивно встряхивают 2 минуты. После полного разделения фаз в делительной воронке верхний слой (гексан) отбрасывают, а нижний (водный) слой возвращают в делительную воронку и повторяют очистку еще одной порцией гексана объемом 30 см³.

Клоквинтосет-кислоту экстрагируют тремя порциями хлористого метилена по 30 см³ каждая, встряхивая делительную воронку по 2 минуты. После полного разделения фаз в делительной воронке нижний слой (хлористый метилен) собирают в отгонную колбу объемом 250 см³, пропуская его через слой безводного сульфата натрия, и выпаривают досуха при температуре не выше плюс 40 °C.

Далее проводят очистку экстракта как указано в п. 11.3.2. Очистка экстракта на концентрирующих патронах N 1 (схема N 2).

Сухой остаток растворяют в 2,5 см³ смеси ацетонитрила с водой в соотношении 2:8 и 20 мм³ пробы вводят в хроматограф.

11.5. Условия хроматографирования.

11.5.1. Хроматографическая система.

Колонка хроматографическая стальная длиной 250 мм, с внутренним диаметром 4,6 мм, зернением 5 мкм, заполненная сорбентом с привитыми полярными группами C8.

Температура колонки: плюс 30 °C.

Подвижная фаза: смесь 0,1%-го водного раствора муравьиной кислоты с ацетонитрилом и метиловым спиртом в соотношении 600:300:100 (по объему) при хроматографировании в изократическом режиме.

Скорость потока элюента: 1,0 см³/мин.

Длина волны: 254 нм.

Чувствительность не менее 8 mAU (миллиединиц абсорбции) на шкалу.

Объем вводимой пробы: 20 мм³.

Линейный диапазон детектирования сохраняется в пределах 2 - 20 нг.

Образцы, дающие пики больше, чем стандартный раствор клоквинтосет-кислоты с концентрацией 1,0 мкг/см³, соответственно разбавляют.

12.1. Для обработки результатов хроматографического анализа используется компьютерное программное обеспечение химического анализа, которое входит в хроматографическую систему.

Альтернативная обработка результатов.

Содержание клоквинтосет-кислоты в пробах рассчитывают по формуле, без учета полноты извлечения вещества из проб:

где X - содержание клоквинтосет-кислоты в пробе, мг/кг или мг/дм³;

S_ст - высота (площадь) пика стандарта, мм;

S_пр - высота (площадь) пика образца, мм;

A - концентрация стандартного раствора, мкг/см³;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, см³;

m - масса анализируемого образца, г (см³);

P - содержание клоквинтосет-кислоты в аналитическом стандарте, %.

13.1. За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:

где X₁, X₂ - результаты параллельных определений, мг/кг или мг/дм³;

r - значение предела повторяемости (табл. 1), при этом .

При невыполнении условия (2) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

14.1. Результат анализа представляют в виде:

где - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

- граница абсолютной погрешности, мг/кг;

где - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

В случае если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

- "При определении остаточного количества клоквинтосет-кислоты в воде содержание вещества в пробе менее 0,005 мг/дм³";

- "При определении остаточного количества клоквинтосет-кислоты в почве и зерне зерновых колосовых культур содержание вещества в пробе менее 0,01 мг/кг";

- "При определении остаточного количества клоквинтосет-кислоты в соломе зерновых колосовых культур содержание вещества в пробе менее 0,05 мг/кг".

15.1. Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений, а также контроль стабильности градуировочной характеристики осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1 - 6.

Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят в начале и по окончании каждой серии анализов.

При контроле стабильности градуировочной характеристики проводят измерения не менее двух образцов концентраций для градуировки, содержание клоквинтосет-кислоты в которых должно охватывать весь диапазон концентраций от 0,05 до 1,00 мкг/см³.

Градуировочная характеристика считается стабильной, если для каждого используемого для контроля градуировочного раствора сохраняется соотношение:

где X - концентрация клоквинтосет-кислоты контрольного измерения, мкг/см³;

C - известная концентрация градуировочного раствора клоквинтосет-кислоты в смеси ацетонитрила с водой в соотношении 2:8, взятая для контроля стабильности градуировочной характеристики, мкг/см³;

10 - погрешность градуировочной характеристики, %.

Если величина расхождения (A) превышает 10%, делают вывод о невозможности применения градуировочной характеристики для дальнейших измерений. В этом случае выясняют и устраняют причины нестабильности градуировочной характеристики и повторяют контроль ее стабильности с использованием других градуировочных растворов клоквинтосет-кислоты, предусмотренных методикой выполнения измерений. При повторном обнаружении нестабильности градуировочной характеристики определяют ее заново согласно п. 10.3.

15.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.

Величина добавки C_д должна удовлетворять условию:

где - характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно), мг/кг, при этом:

где - граница абсолютной погрешности, мг/кг;

где - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

Результат контроля процедуры К_к рассчитывают по формуле:

где , , C_д - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 13.1) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце и концентрация добавки соответственно, мг/кг.

Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (К_к) с нормативом контроля (К).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию:

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (5) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (5) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

15.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), не должно превышать предела воспроизводимости (R):

где X₁, X₂ - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

1. Федеральный закон от 30.03.1999 N 52-ФЗ "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения".

2. Унифицированные правила отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов, N 2051-79 от 21.08.79 г.

3. ГОСТ Р 8.563 "Государственная система обеспечения единства измерений. Методики (методы) измерений".

4. ГОСТ ISO/IEC 17025 "Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий".

5. ГОСТ Р ИСО 5725-1 - 6 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Части 1 - 6".

6. РМГ 76 "Государственная система обеспечения единства измерений. Внутренний контроль качества результатов количественного химического анализа".

7. РМГ 61 "Государственная система обеспечения единства измерений. Показатели точности, правильности, прецизионности методик количественного химического анализа. Методы оценки".

8. ГОСТ 12.1.007 "Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности".

9. ГОСТ 12.1.019 "Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты".

10. ГОСТ 12.1.004 "Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования".

11. ГОСТ 12.4.009 "Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание".

12. ГОСТ 12.0.004 "Система стандартов безопасности труда. Организация обучения безопасности труда. Общие положения".

13. ГОСТ Р 53228 "Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания".

14. ГОСТ 1770 "Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия".

15. ГОСТ 29227 "Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования".

16. ГОСТ 25336 "Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры".

17. ГОСТ 6709 "Вода дистиллированная. Технические условия".

18. ГОСТ 5556 "Вата медицинская гигроскопическая. Технические условия".

19. ГОСТ 22967 "Шприцы медицинские инъекционные многократного применения. Общие технические требования и методы испытаний".

20. ГОСТ 3652 "Кислота лимонная моногидрат и безводная. Технические условия".

21. ГОСТ 5848 "Реактивы. Кислота муравьиная. Технические условия".

22. ГОСТ 3118 "Реактивы. Кислота соляная. Технические условия".

23. ГОСТ 4166 "Реактивы. Натрий сернокислый. Технические условия".

24. ГОСТ 4201 "Реактивы. Натрий углекислый кислый. Технические условия".

25. ГОСТ 4328 "Реактивы. Натрия гидроокись. Технические условия".

26. ГОСТ 31861 "Вода. Общие требования к отбору проб".

27. ГОСТ 17.4.3.01 "Охрана природы. Почвы. Общие требования к отбору проб".

28. ГОСТ 28168 "Почвы. Отбор проб".

29. ГОСТ 13586.3 "Зерно. Правила приемки и методы отбора проб".

30. ГОСТ ISO 6497 "Корма. Отбор проб".