"МУК 4.1.3629-20. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств хлормекват-хлорида в зерне и соломе зерновых культур методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 05.08.2020)

1. Разработаны ФБУН "Федеральный научный центр гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана" Роспотребнадзора (В.Н. Ракитский, Н.Е. Федорова, В.В. Баюшева, М.С. Гречина, Л.В. Горячева).

2. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 5 августа 2020 г.

3. Введены впервые.

1.1. Настоящие методические указания (далее - МУК) устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (далее - ВЭЖХ) для определения в зерне и соломе зерновых культур массовой концентрации хлормекват-хлорида в диапазонах 0,125 - 1,25 мг/кг и 0,25 - 2,5 мг/кг, соответственно.

1.2. МУК предназначены для органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, а также могут быть использованы организациями, осуществляющими исследования в области безопасности и качества пищевой продукции и продовольственного сырья.

1.3. МУК носят рекомендательный характер.

2.1. Хлормекват-хлорид - 2-хлорэтил(триметил)азаниум; хлорид <1>. Брутто формула C₅H₁₃Cl₂N. Молекулярная масса 158,07. Белое кристаллическое гигроскопичное вещество, хорошо растворимо в воде, спиртах и некоторых других органических растворителях, практически нерастворимо в углеводородах. Агрегатное состояние в воздушной среде - аэрозоль. Температура плавления - 225 °C.

--------------------------------

<1> В соответствии с Международным союзом теоретической и прикладной химии (ИЮПАК, англ. International Union of Pure and Applied Chemistry, IUPAC).

2.2. Острая пероральная токсичность (LD₅₀) для кроликов - 115 мг/кг; острая дермальная токсичность (LD₅₀) для кроликов - 964 мг/кг; острая ингаляционная токсичность (LC₅₀) для крыс - более 5,2 мг/м³.

2.3. Используется в качестве ретарданта для обработки пшеницы, для ускорения начала плодоношения груш и яблонь, для ограничения роста усов и повышения урожайности земляники, для повышения урожайности виноградной лозы, белокочанной капусты и т.д.

3.1. При соблюдении всех регламентируемых условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерения при доверительной вероятности p = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 3.1 и 3.2 для соответствующих диапазонов концентраций.

3.2. Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для всего диапазона измерений (n = 20) приведены в табл. 2.

4.1. Методика основана на определении вещества с помощью ВЭЖХ на обращенной фазе с тройным квадрупольным масс-спектрометрическим детектором (далее - ВЭЖХ-МС/МС).

4.2. Экстракцию вещества из анализируемых проб растительной продукции выполняют метанолом и очищают, пропуская через патрон для твердофазной экстракции.

4.3. Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки. Нижний предел измерения хлормекват хлорида в анализируемом объеме пробы - 0,125 нг.

5.1. При выполнении измерений и подготовке проб применяют средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы, приведенные в табл. 5.1 - 5.3.

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.

Примечание. Допускается применение оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

6.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

6.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Организация обучения работников безопасности труда по ГОСТ 12.0.004.

6.3. При работе с газами, находящимися в баллонах под давлением до 15 МПа (150 кгс/см²), необходимо соблюдать нормы и правила <2>. Запрещается открывать вентиль баллона, не установив в нем понижающий редуктор.

--------------------------------

<2> Правила промышленной безопасности опасных производственных объектов, на которых используется оборудование, работающее под избыточным давлением, утвержденные приказом Ростехнадзора от 25.03.2014 N 116.

6.4. Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист, имеющий опыт работы на жидкостном хроматографе, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений.

7.1. При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на газовых хроматографах проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

8.1. Подготовка подвижной фазы для ВЭЖХ.

Компонент А: в мерную колбу вместимостью 1000 см³ помещают 500 см³ деионизированной воды, вносят 1,2 г формиата аммония и 0,1 см³ муравьиной кислоты, доводят до метки деионизированной водой, перемешивают, фильтруют через мембранный фильтр, дегазируют.

Компонент Б: в мерную колбу вместимостью 1000 см³ помещают 500 см³ метанола, вносят 0,1 см³ муравьиной кислоты, доводят до метки метанолом, перемешивают, фильтруют через мембранный фильтр, дегазируют.

Каждый компонент подвижной фазы хранят в темном месте (в емкости из темного стекла) не более 14 дней.

8.2. Приготовление смеси растворителей для рабочих растворов и разбавления проб. В мерную колбу вместимостью 1000 см³ помещают 500 см³ метанола, 0,6 г формиата аммония, 0,1 см³ муравьиной кислоты, доводят до метки 500 см³ деионизованной воды, перемешивают. Раствор хранят в темном месте (в емкости из темного стекла) не более 14 дней.

8.3. Приготовление градуировочных растворов и растворов внесения.

8.3.1. Исходный раствор хлормекват-хлорида для градуировки (концентрация 100 мкг/см³). В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 0,0100 г хлормекват-хлорида, добавляют 50 - 70 см³ метанола, перемешивают, доводят метанолом до метки, вновь перемешивают. Раствор хранятся в холодильнике при температуре (4 +/- 2) °C не более 3 месяцев.

Растворы N 1 - 5 готовят объемным методом путем последовательного разбавления исходного раствора для градуировки.

8.3.2. Раствор N 1 хлормекват-хлорида для градуировки и внесения (концентрация 5 мкг/см³). В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 5 см³ исходного раствора хлормекват-хлорида (п. 8.3.1) с концентрацией 100 мкг/см³, доводят до метки метанолом, тщательно перемешивают, получают рабочий раствор N 1 с концентрацией хлормекват-хлорида 5 мкг/см³. Раствор N 1 хранится в холодильнике при температуре (4 +/- 2) °C не более одного месяца.

8.3.3. Рабочие растворы N 2 - 5 хлормекват-хлорида для градуировки (концентрация 0,025 - 0,25 мкг/см³). В 4 мерные колбы вместимостью 100 см³ помещают 5, 2, 1 и 0,5 см³ градуировочного раствора N 1 с концентрацией хлормекват-хлорида 5 мкг/см³ (п. 8.3.2), доводят до метки смесью растворителей, приготовленной по п. 8.2, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы N 2 - 5 с концентрацией хлормекват-хлорида 0,25, 0,1, 0,05 и 0,025 мкг/см³, соответственно. Растворы хранятся в холодильнике при температуре (4 +/- 2) °C не более двух недель.

8.4. Кондиционирование хроматографической колонки для ВЭЖХ. Промывают колонку подвижной фазой (смесь компонентов А и Б, приготовленных по п. 8.1, в соотношении 1 : 1) при скорости подачи растворителя 0,2 см³/мин до установления стабильной базовой линии.

8.5. Установление градуировочной характеристики.

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика (I) от концентрации хлормекват-хлорида в растворе (мкг/см³), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4 растворам для градуировки.

В инжектор хроматографа вводят по 5 мм³ каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 10.2. Осуществляют не менее 5 параллельных измерений.

8.6. Контроль стабильности градуировочной характеристики.

Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят в начале и по окончании каждой серии анализов.

При контроле стабильности градуировочной характеристики проводят измерения не менее двух образцов концентраций для градуировки, содержание хлормекват-хлорида в которых должно охватывать весь диапазон концентраций от 0,025 до 0,250 мкг/см³.

Градуировочная характеристика считается стабильной, если для каждого из используемого для контроля градуировочного раствора сохраняется соотношение:

X - концентрация хлормекват-хлорида в пробе при контрольном измерении, мкг/см³;

C - известная концентрация градуировочного раствора хлормекват-хлорида, взятая для контроля стабильности градуировочной характеристики, мкг/см³;

B - норматив контроля погрешности градуировочной характеристики, % (равен 20% при P = 0,95).

Если величина расхождения (A) превышает 20%, делают вывод о невозможности применения градуировочной характеристики для дальнейших измерений. В этом случае выясняют и устраняют причины нестабильности градуировочной характеристики и повторяют контроль ее стабильности с использованием других градуировочных растворов хлормекват-хлорида, предусмотренных методикой. При повторном обнаружении нестабильности градуировочной характеристики устанавливают ее заново согласно п. 8.5.

9.1. Отбор проб осуществляется в соответствии с действующими методическими документами <3>.

--------------------------------

<3> ГОСТ 13586.3 "Зерно. Правила приемки и методы отбора проб".

9.2. Пробы зерна и соломы подсушивают и хранят при комнатной температуре не более 2 недель. Для длительного хранения образцы замораживают и хранят при температуре не выше минус 18 °C.

10.1. Экстракция зерна и соломы зерновых культур.

Образец измельченного зерна массой 5 г или соломы массой 2,5 г помещают в плоскодонную колбу вместимостью 250 см³. Вносят 60 см³ метанола, выдерживают 5 минут на ультразвуковой ванне. Надосадочную жидкость сливают в новую плоскодонную колбу вместимостью 250 см³. Повторяют экстракцию, используя 40 см³ метанола, выдерживают 5 минут на ультразвуковой ванне. Экстракты объединяют и перемешивают.

Отбирают часть экстракта объемом 40 см³ в полипропиленовую центрифужную пробирку вместимостью 50 см³, пробу центрифугируют в течение 10 мин при скорости вращения 8500 оборотов/мин. Аликвоту экстракта объемом 20 см³ упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре 35 °C.

10.2. Очистка экстракта. Остаток растворяют в 5 см³ раствора, приготовленного по п. 8.2, выдерживают 1 - 2 минуты на ультразвуковой ванне. Далее пробу пропускают через патрон для твердофазной экстракции. Первые 1 - 1,5 см³ элюата отбрасывают, последующие собирают в виалу. При необходимости пробу дополнительно пропускают через мембранный фильтр (размер пор 0,2 мкм) и анализируют в условиях хроматографирования по п. 10.2.

10.2. Условия хроматографирования.

Измерения выполняют при следующих режимных параметрах:

- жидкостный хроматограф с тандемным масс-спектрометрическим детектором: тройной квадруполь с источником ионизации, оснащенным соосной подачей горячего азота для эффективной десольвации ионов;

- источник ионизации - электростатическое распыление;

- режим работы - регистрация дочерних положительных ионов после разрушения материнских ионов (регистрация "перехода"): материнский ион (масса/заряд) 123,1; дочерние ионы (масса/заряд) 59,2 (количественный расчет), 63,0; напряжение на фрагментаторе 126 В; энергия разрушения (соударения) 30 В , 9 В ; скорость сканирования 200 мс; давление на распылителе 35 psi;

- скорость осушающего газа 1 (азот) 10 дм³/мин; температура газа 1 325 °C; скорость газа 2 (азот) 12 дм³/мин; температура газа 2 400 °C; температура квадруполей (1 и 3) 100 °C;

- хроматографическая колонка стальная длиной 50 мм, внутренним диаметром 2,1 мм, заполненная обращенно-фазным сорбентом с привитыми монофункциональными полярными группами C18, зернением 1,8 мкм; температура колонки 30 °C; скорость потока элюента 0,2 см³/мин; объем вводимой пробы 5 мм³;

- подвижная фаза: 20 мМ раствор формиата аммония и 0,01% муравьиной кислоты в воде : 0,01% раствор муравьиной кислоты в метаноле (65 : 35, по объему).

- линейный диапазон детектирования 0,125 - 1,25 нг.

Образцы, дающие пики большие, чем градуировочный раствор с концентрацией 0,25 мкг/см³, разбавляют подвижной фазой (не более чем в 50 раз).

11.1. Содержание хлормекват-хлорида в пробах зерна и соломы зерновых культур (X, мг/кг) рассчитывают по формуле:

A - концентрация хлормекват-хлорида, найденная по градуировочному графику в соответствии с величинами площадей хроматографических пиков, мкг/см³;

V_кон - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, см³;

m - масса анализируемого образца, г;

C - коэффициент, учитывающий объема экстракта, взятого для анализа, C = 5.

f - полнота извлечения вещества, выраженная в относительных единицах (величину полноты извлечения, приведенную в табл. 2, разделить на 100).

13.1. Результат анализа представляют в виде:

- среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

- граница абсолютной погрешности, мг/кг;

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 3.1), %.

Если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде: "Содержание хлормекват-хлорида в пробе зерна и соломы зерновых культур - менее 0,125 мг/кг и 0,25 мг/кг, соответственно" <4>.

--------------------------------

<4> 0,125 мг/кг и 0,25 мг/кг - пределы обнаружения хлормекват-хлорида в пробе зерна и соломы зерновых культур, соответственно.

13.1 Организация контроля качества измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1 - 6.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.

Величина добавки C_д должна удовлетворять условию:

- характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой) мг/кг, при этом:

- граница абсолютной погрешности, мг/кг;

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 3.1), %.

Результат контроля процедуры К_к рассчитывают по формуле:

, , C_д - среднее арифметическое результатов параллельных определений содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки, соответственно, мг/кг;

Норматив контроля К рассчитывают по формуле

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (К_к) с нормативом контроля (К).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов параллельных определений.

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

X₁, X₂ - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости (табл. 1), при этом .

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

1. ГОСТ Р ИСО 5725-(1 - 6) "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

2. ГОСТ Р 53228 "Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания".

3. ГОСТ 29227 "Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования".

4. ГОСТ 28498 "Термометры жидкостные стеклянные. Общие технические требования. Методы испытаний".

5. ГОСТ 1770 "Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия".

6. ГОСТ OIML R 111-1 "Государственная система обеспечения единства измерений (ГСИ). Гири классов E(1), E(2), F(1), F(2), M(1), M(1-2), M(2), M(2-3) и M(3). Часть 1. Метрологические и технические требования".

7. ГОСТ 9293 (ИСО 2435) "Азот газообразный и жидкий. Технические условия".

8. ГОСТ 13586.3 "Зерно. Правила приемки и методы отбора проб".

9. ГОСТ Р 52501 "Вода для лабораторного анализа. Технические условия".

10. ГОСТ 20490 "Реактивы. Калий марганцовокислый. Технические условия".

11. ГОСТ 6995 "Реактивы. Метанол-яд. Технические условия".

12. ГОСТ 5848 "Реактивы. Кислота муравьиная. Технические условия".

13. ГОСТ 25336 "Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры".

14. ГОСТ 12.1.007 "Система стандартов безопасности труда (ССБТ). Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности".

15. ГОСТ 12.1.019 "Система стандартов безопасности труда (ССБТ). Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты".

16. ГОСТ 12.1.004 "Система стандартов безопасности труда (ССБТ). Пожарная безопасность. Общие требования".

17. ГОСТ 12.4.009 "Система стандартов безопасности труда (ССБТ). Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание".

18. ГОСТ 12.0.004 "Система стандартов безопасности труда (ССБТ). Организация обучения безопасности труда. Общие положения".

19. Правила промышленной безопасности опасных производственных объектов, на которых используется оборудование, работающее под избыточным давлением, утвержденные приказом Ростехнадзора от 25.03.2014 N 116.