"МУК 4.1.3803-22. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств бициклопирона в воде, почве, зерне и масле кукурузы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 01.12.2022)

1. Разработаны ФБУН "Федеральный научный центр гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана" Роспотребнадзора (С.В. Кузьмин, В.Н. Ракитский, Н.Е. Федорова, М.С. Гречина); ФГБОУ ДПО "Российская медицинская академия непрерывного профессионального образования" (И.З. Мустафина).

2. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 1 декабря 2022 г.

3. Введены впервые.

1.1. Настоящие методические указания (далее - МУК) устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (далее - ВЭЖХ) с масс-спектрометрическим детектированием для определения в воде, почве, зерне и масле кукурузы массовой концентрации бициклопирона в диапазонах: в воде 0,0001 - 0,002 мг/дм³ - без разбавления и 0,0001 - 0,1000 мг/дм³ - при разбавлении в 50 раз, в почве 0,001 - 0,02 мг/кг - без разбавления и 0,001 - 1,000 мг/кг - при разбавлении в 50 раз, в зерне и масле кукурузы 0,01 - 0,2 мг/кг - без разбавления и 0,01 - 10,00 мг/кг - при разбавлении в 50 раз.

1.2. МУК предназначены для органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, осуществляющих контроль качества и безопасности продовольственного (пищевого) сырья и пищевой продукции и объектов окружающей среды, а также могут быть использованы организациями, аккредитованными в установленном порядке на проведение исследований продовольственного (пищевого) сырья, пищевой продукции и объектов окружающей среды.

1.3. МУК носят рекомендательный характер.

2.1. Бициклопирон. 4-гидрокси-3-{2-[(2-метоксиэтокси)метил]-6-(трифтор-метил)-3-пиридилкарбонил}бицикло[3.2.1]окт-3-ен-2-он <1>. Брутто-формула C₁₉H₂₀F₃NO₅. Молекулярная масса 399,4 г/моль.

--------------------------------

<1> В соответствии с Международным союзом теоретической и прикладной химии (ИЮПАК, англ. International Union of Pure and Applied Chemistry, IUPAC).

2.2. Физические и химические свойства. Порошок белого цвета без выраженного запаха. Давление паров 5,0·10^-6 Па при плюс 20 °C. Растворимость в воде 1,2 г/дм³ при плюс 25 °C, при pH = 3,0 мг/дм³, при pH = 4,9 - 38 г/дм³, при pH = 7,2 - 119 г/дм³ при pH = 9,2 - 119 г/дм³. Растворимость в органических растворителях (в г/дм³, при плюс 25 °C): толуол > 500, дихлорметан > 500, этилацетат > 500, метанол > 500, ацетон > 500, гексан > 8,9, октанол > 91. Коэффициент распределения н-октанол/вода при плюс 25 °C: при pH = 5 - 0,25, при pH = 7 - 1,2, при pH = 9 - 1,9. Температура плавления плюс 65,3 °C. Плотность 1,503 г/см³.

2.3. Острая пероральная токсичность для крыс (ЛД₅₀) > 5000 мг/кг, острая дермальная токсичность (ЛД₅₀) > 5000 мг/кг. Острая ингаляционная токсичность (ЛК₅₀) для крыс более 5,08 мг/м³.

2.4. Высокоэффективный системный комбинированный гербицид. Используется для борьбы с сорными травами и защиты кукурузы от комплекса болезней.

3.1. При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 3.1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Примечание. Диапазон определяемых концентраций, указанный в табл. 3.1, приведен с учетом разбавления образца в 50 раз.

4.1. Методика основана на определении вещества с помощью ВЭЖХ на обращенной фазе с тройным квадрупольным масс-спектрометрическим детектором.

4.2. Экстракцию вещества из анализируемых проб растительной продукции (зерно и масло кукурузы) выполняют смесью ацетонитрил - вода (8:2), из образцов почвы - подкисленной смесью ацетонитрил - вода (7:3), очистку проб воды проводят на патронах для твердофазной экстракции с гидрофильно-липофильным сорбентом на основе сополимера N-винилпирролидона и дивинилбензола.

4.3. Нижний предел измерения бициклопирона в анализируемом объеме пробы - 0,5 пг.

5.1. При выполнении измерений и подготовке проб применяют средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы, приведенные в табл. 5.1 - 5.3.

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.

Примечание. Допускается использование вспомогательных средств измерений, устройств и материалов с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

6.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать технику безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостной хроматограф.

6.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004.

6.3. При работе с газами, находящимися в баллонах под давлением до 15 МПа (150 кгс/см²), необходимо соблюдать правила <2> промышленной безопасности. Запрещается открывать вентиль баллона, не установив в нем понижающий редуктор.

--------------------------------

<2> Правила промышленной безопасности при использовании оборудования, работающего под избыточным давлением, утвержденные приказом Ростехнадзора от 15.12.2020 N 536 (зарегистрировано Минюстом России 31.12.2020, регистрационный N 61998).

6.4. Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист, имеющий опыт работы на жидкостном хроматографе с тройным квадрупольным масс-спектрометрическим детектором, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментальное соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений.

7.1. При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха плюс (15 - 30) °C и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией на прибор.

8.1. Очистка растворителей. Ацетонитрил кипятят с обратным холодильником над пентоксидом фосфора (на 1 дм³ ацетонитрила 20 г пентоксида фосфора) не менее 1 часа, после чего перегоняют, непосредственно перед употреблением ацетонитрил повторно перегоняют над прокаленным карбонатом калия (на 1 дм³ ацетонитрила 10 г карбоната калия). Хранят в емкости из темного стекла.

8.2. Приготовление 0,1%-го раствора муравьиной кислоты в воде (компонент А подвижной фазы для ВЭЖХ).

В мерную колбу вместимостью 1000 см³ помещают 500 см³ деионизированной воды, вносят 1,0 см³ муравьиной кислоты, доводят до метки деионизированной водой, перемешивают. Хранят в темном месте (в емкости из темного стекла) не более 14 дней.

8.3. Кондиционирование хроматографической колонки для ВЭЖХ.

Промывают колонку подвижной фазой при соотношении компонентов А и Б (компонент А - 0,1% раствор муравьиной кислоты в воде, компонент Б - ацетонитрил) 1:1 и скорости подачи растворителя 0,3 см³/мин до установления стабильной базовой линии.

8.4. Приготовление смеси растворителей для приготовления рабочих растворов и экстракции.

В мерную колбу вместимостью 1000 см³ помещают 700 см³ ацетонитрила и 1 см³ муравьиной кислоты, доводят до метки деионизованной водой, перемешивают. Раствор хранят в темном месте (в емкости из темного стекла) не более 14 дней.

8.5. Приготовление смеси растворителей для экстракции.

В мерную колбу вместимостью 1000 см³ помещают 800 см³ ацетонитрила, доводят до метки деионизованной водой, перемешивают. Раствор хранят в темном месте (в емкости из темного стекла) не более 14 дней.

8.6. Приготовление 2%-го раствора муравьиной кислоты в воде.

В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 50 см³ деионизированной воды, вносят 2,0 см³ муравьиной кислоты, доводят до метки деионизированной водой, перемешивают. Хранят в темном месте (в емкости из темного стекла) не более 14 дней.

8.7. Подготовка патронов (картриджей) для твердофазной экстракции.

Патроны устанавливают на аллонж с прямым отводом для вакуума, затем промывают с помощью разряжения, создаваемого водоструйным насосом, со скоростью прохождения растворителя через патрон 1 - 2 капли в секунду: последовательно 2 см³ метанола и 2 см³ деонизованной воды. Картриджи готовят непосредственно перед использованием.

8.8. Приготовление градуировочных растворов.

8.8.1. Исходный раствор бициклопирона для градуировки (концентрация 100 мкг/см³).

В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают (0,0100 +/- 0,0005) г бициклопирона, добавляют 50 - 70 см³ ацетонитрила, перемешивают, доводят ацетонитрилом до метки, вновь перемешивают. Массу навески необходимо брать, учитывая чистоту стандартного образца бициклопирона. Раствор хранят в холодильнике при температуре плюс (2 - 6) °C не более 3 месяцев.

Растворы N 1 - 8 готовят путем последовательного разбавления исходного раствора для градуировки.

8.8.2. Раствор N 1 бициклопирона для градуировки и внесения (концентрация 1 мкг/см³).

В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 1 см³ исходного раствора бициклопирона (п. 8.8.1) с концентрацией 100 мкг/см³, доводят до метки ацетонитрилом, тщательно перемешивают, получают рабочий раствор N 1 с концентрацией бициклопирона 1 мкг/см³. Раствор N 1 хранят в холодильнике при температуре плюс (2 - 6) °C не более одного месяца.

8.8.3. Раствор N 2 бициклопирона для градуировки и внесения (концентрация 0,1 мкг/см³).

В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 10,0 см³ градуировочного раствора N 1 с концентрацией бициклопирона 1,0 мкг/см³ (п. 8.8.2), доводят до метки ацетонитрилом, тщательно перемешивают, получают рабочий раствор N 2 с концентрацией бициклопирона 0,1 мкг/см³. Раствор N 2 хранят в холодильнике при температуре плюс (2 - 6) °C не более одного месяца.

Растворы N 1 и N 2 используют для приготовления проб с внесением при оценке полноты извлечения действующего вещества методом "внесено-найдено" и контроля качества результатов измерений методом добавок.

8.8.4. Рабочие растворы N 3 - 8 бициклопирона для градуировки (концентрация 0,1 - 10 нг/см³).

В 3 мерные колбы вместимостью 100 см³ помещают 10,0; 2,0 и 1,0 см³ градуировочного раствора N 2 с концентрацией бициклопирона 0,1 мкг/см³ (п. 8.8.3), доводят до метки смесью растворителей, приготовленной по п. 8.4, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы N 3 - 5 с концентрацией бициклопирона 10; 2 и 1 нг/см³ соответственно.

В 3 мерные колбы вместимостью 100 см³ помещают 5, 2 и 1 см³ градуировочного раствора N 3 с концентрацией бициклопирона 10 нг/см³ (п. 8.8.4), доводят до метки смесью растворителей, приготовленной по п. 8.4, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы N 6 - 8 с концентрацией бициклопирона 0,5, 0,2 и 0,1 нг/см³, соответственно.

Растворы хранятся в холодильнике при температуре плюс (2 - 6) °C не более десяти дней.

8.9. Установление градуировочной характеристики.

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика (I) от концентрации бициклопирона в растворе (нг/см³), устанавливают методом абсолютной калибровки по 5 растворам для градуировки.

В инжектор хроматографа вводят по 5 мм³ каждого градуировочного раствора (N 4 - 8) и анализируют в условиях хроматографирования, указанных в п. 10.4. Осуществляют не менее 3 параллельных измерений.

8.10. Контроль стабильности градуировочной характеристики.

Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят в начале и по окончании каждой серии анализов.

Проводят измерения не менее двух образцов концентраций для градуировки, содержание бициклопирона в которых должно охватывать весь диапазон концентраций от 0,1 до 2 нг/см³.

Градуировочная характеристика считается стабильной, если для каждого из используемых для контроля градуировочных растворов сохраняется соотношение:

где A - величина расхождения, %;

X - концентрация бициклопирона в пробе при контрольном измерении, нг/см³;

C - известная концентрация градуировочного раствора, взятая для контроля стабильности градуировочной характеристики, нг/см³;

B - норматив контроля стабильности градуировочной характеристики, % (равен 20% при P = 0,95).

9.1. Отбор проб осуществляют в соответствии с методическими документами <3>.

--------------------------------

<3> Унифицированные правила отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов, утвержденные заместителем Главного государственного санитарного врача СССР 21.08.1979 N 2051-79; ГОСТ 31861 "Межгосударственный стандарт. Вода. Общие требования к отбору проб"; ГОСТ 17.4.3.01 "Межгосударственный стандарт. Охрана природы. Почвы. Общие требования к отбору проб"; ГОСТ 28168 "Межгосударственный стандарт. Почвы. Отбор проб"; ГОСТ Р 53903 "Кукуруза кормовая. Технические условия"; ГОСТ 8808 "Межгосударственный стандарт. Масло кукурузное. Технические условия".

9.2. Пробы воды отбирают и хранят в бутылях из полиэтилена (полипропилена) при температуре плюс (2 - 6) °C не более недели. Пробы почвы (предварительно подсушивают) и зерна хранят при комнатной температуре не более 2 недель. Для длительного хранения образцы замораживают и хранят при температуре не выше минус 18 °C.

Перед анализом образцы размораживают, пробы зерна измельчают. Масло кукурузы готовят из соответствующих образцов зерна, анализ выполняют в день приготовления.

10.1. Вода.

К 10 см³ воды добавляют примерно 0,2 см³ муравьиной кислоты до pH <= 2.

Далее проводят очистку на концентрирующем патроне (картридже). Образец воды пропускают через картридж, подготовленный по п. 8.7, со скоростью прохождения раствора 1 - 2 см³/мин, пропуская раствор до верхнего края сорбента. После нанесения пробы патрон дополнительно промывают 2 см³ раствора, приготовленного по п. 8.6, и удаляют остатки водного раствора под вакуумом. Бициклопирон элюируют 3 см³ метанола в круглодонную колбу на 50 см³ и упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше плюс 40 °C досуха.

Сухой остаток растворяют в 10 см³ смеси растворителей, приготовленной по п. 8.5, тщательно перемешивают и анализируют при условиях хроматографирования, указанных в п. 10.4.

10.2. Почва.

Образец массой 10 г помещают в стакан на 250 см³, заливают 100 см³ смеси растворителей, приготовленной по п. 8.4, перемешивают и помещают на аппарат для встряхивания на 1 час. Пробам дают отстояться, затем часть надосадочной жидкости фильтруют через мембранный фильтр (размер пор 0,20 мкм) в виалу и анализируют в условиях хроматографирования по п. 10.4.

10.3. Зерно и масло кукурузы.

Образец зерна или масла массой 5 г помещают в центрифужную полипропиленовую пробирку вместимостью 50 см³ и заливают 25 см³ смеси, приготовленной по п. 8.5, интенсивно встряхивают в течение 1 мин и ставят на аппарат для встряхивания на 10 минут. Затем пробу центрифугируют в течение 5 мин при скорости вращения 4000 об./мин. Аликвоту экстракта (верхний слой в пробирке после центрифугирования) объемом 0,1 см³ переносят в градуированную пробирку на 5 см³, затем доводят до 2 см³ деионизованной водой и анализируют в условиях хроматографирования по п. 10.4.

10.4. Измерения выполняют на жидкостном хроматографе с тандемным масс-спектрометрическим детектором: тройной квадруполь с источником ионизации, оснащенным соосной подачей горячего азота для эффективной десольвации ионов при следующих режимных параметрах:

- источник ионизации: электростатическое распыление;

- режим работы: регистрация дочерних положительных ионов после разрушения материнских ионов (регистрация "перехода").

Параметры масс-спектрометрического детектора:

- материнский ион (масса/заряд): 400,1;

- дочерние ионы (масса/заряд): 324 (количественный расчет), 227,9 (подтверждающий ион);

- напряжение на фрагментаторе, В: 124;

- энергия разрушения (соударения), В: 17 , 37 ;

- скорость сканирования: 200 мс;

- давление на распылителе: 35 psi;

- скорость осушающего газа 1 (азот): 10 дм³/мин;

- температура газа 1: плюс 350 °C;

- скорость газа 2 (азот): 12 дм³/мин;

- температура газа 2: плюс 400 °C;

- температура квадруполей (1 и 3): плюс 100 °C.

Условия хроматографирования:

- хроматографическая колонка стальная, длиной 50 мм, внутренним диаметром 2,1 мм, заполненная обращенно-фазным сорбентом с привитыми монофункциональными полярными группами C18, зернением 1,8 мкм;

- температура колонки: плюс 40 °C;

- скорость потока элюента: 0,3 см³/мин;

- объем вводимой пробы: 5 мм³;

- подвижная фаза: 0,1% раствор муравьиной кислоты в воде - ацетонитрил (30:70, по объему).

Линейный диапазон детектирования 0,5 - 10 пг.

Образцы, дающие пики, большие, чем градуировочный раствор с концентрацией 2 нг/см³, разбавляют смесью растворителей, приготовленной по п. 8.4 (не более чем в 50 раз).

11.1. Содержание бициклопирона в пробах воды, почвы, зерна и масла кукурузы (X, мг/дм³, мг/кг) рассчитывают по формуле:

где C - концентрация бициклопирона, найденная по градуировочному графику в соответствии с величиной площади хроматографического пика, нг/см³;

V_кон - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, см³;

Кр - кратность разбавления (если экстракт подвергался разбавлению);

m(V) - масса (объем) анализируемого образца, г, см³;

К - коэффициент, учитывающий объем экстракта, взятого для анализа, К = 1 (вода, почва), К = 250 (зерно и масло кукурузы).

11.2. Проверка приемлемости результатов параллельных определений.

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:

где X₁, X₂ - результаты параллельных определений, мг/дм³, мг/кг;

r - значение предела повторяемости (табл. 3.1), при этом .

При невыполнении условия выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

12.1. Результат анализа представляют в виде:

где - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/дм³, мг/кг;

- граница абсолютной погрешности, мг/дм³, мг/кг;

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 3.1), %.

Если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание бициклопирона в воде, почве, зерне и масле кукурузы - менее 0,0001 мг/дм³, 0,001 мг/кг, 0,01 мг/кг соответственно" <4>.

--------------------------------

<4> 0,0001 мг/дм³, 0,001 мг/кг, 0,01 мг/кг - пределы количественного определения бициклопирона в пробах воды, почвы, зерна и масла кукурузы соответственно.

13.1. Контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-(1 - 6).

Периодичность и формы контроля определяются руководством по качеству.

1. Федеральный закон от 30.03.1999 N 52-ФЗ "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения".

2. Унифицированные правила отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов, утвержденные заместителем Главного государственного санитарного врача СССР 21.08.1979 N 2051-79.

3. ГОСТ Р ИСО 5725 "Государственный стандарт Российской Федерации. Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

4. ГОСТ Р 53228 "Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания".

5. ГОСТ OIML R 111-1 "Межгосударственный стандарт. Государственная система обеспечения единства измерений (ГСИ). Гири классов E(1), E(2), F(1), F(2), M(1), M(1 - 2), M(2), M(2 - 3) и M(3). Часть 1. Метрологические и технические требования".

6. ГОСТ 1770 "Межгосударственный стандарт. Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия".

7. ГОСТ 29227 "Межгосударственный стандарт. Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования".

8. ГОСТ 25336 "Межгосударственный стандарт. Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры".

9. ГОСТ 9293 (ИСО 2435) "Межгосударственный стандарт. Азот газообразный и жидкий. Технические условия".

10. ГОСТ 5848 "Государственный стандарт Союза ССР. Реактивы. Кислота муравьиная. Технические условия".

11. ГОСТ 4221 "Межгосударственный стандарт. Калий углекислый. Технические условия".

12. ГОСТ 4233 "Межгосударственный стандарт. Реактивы. Натрий хлористый. Технические условия".

13. ГОСТ 22280 "Межгосударственный стандарт. Реактивы. Натрий лимоннокислый 5,5-водный. Технические условия".

14. ГОСТ Р 52501 "Вода для лабораторного анализа. Технические условия".

15. ГОСТ ISO 7886-1 "Межгосударственный стандарт. Шприцы инъекционные однократного применения стерильные. Часть 1. Шприцы для ручного использования".

16. ГОСТ 12.1.004 "Межгосударственный стандарт. Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования".

17. ГОСТ 12.1.007 "Межгосударственный стандарт. Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности".

18. ГОСТ 12.1.019 "Межгосударственный стандарт. Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты".

19. ГОСТ 12.0.004 "Межгосударственный стандарт. Система стандартов безопасности труда. Организация обучения безопасности труда. Общие положения".

20. ГОСТ 12.4.009 "Межгосударственный стандарт. Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание".