"МУК 4.2.3586-19. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Идентификация и количественное определение новых линий ГМ кукурузы (DAS-40278-9, MZIR098, MZHG0JG) и сои (MON87708) в пищевых продуктах по технологии TaqMan. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 05.11.2019)

1. Разработаны ФГБУН "ФИЦ питания и биотехнологии" (В.А. Тутельян, Н.В. Тышко, Э.О. Садыкова), ФБУЗ "Федеральный центр гигиены и эпидемиологии" Роспотребнадзора (М.В. Зароченцев, Д.С. Кудрявцев), Российской академией наук (Г.Г. Онищенко); Институтом биоинженерии, ФГУ "ФИЦ Биотехнологии" РАН (К.Г. Скрябин, Д.С. Груздев, М.В. Сухачева); МГУ им. М.В. Ломоносова (М.П. Кирпичников).

2. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 05 ноября 2019 г.

3. Введены впервые.

1.1. Настоящие методические указания устанавливают методы идентификации и количественного определения событие-специфичной рекомбинантной ДНК, характерной для уникальных трансформационных событий генно-инженерно-модифицированной (далее - ГМ) кукурузы DAS-40278-9, MZIR098, MZHG0JG и сои MON87708 (ГМ-специфичной ДНК).

1.2. Данные методы, основанные на полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (далее - ПЦР-РВ) по технологии TaqMan <1>, и могут быть использованы для контроля за генно-инженерно-модифицированными организмами (далее - ГМО) в пищевых продуктах, а также в сырье (семена, зерна и другой материал растительного происхождения). Поскольку возможность проведения ПЦР-РВ напрямую зависит от количества и качества ДНК, выделяемой из анализируемого продукта, при выборе метода экстракции ДНК следует руководствоваться требованиями ГОСТ Р ИСО 21571. Количество и качество выделенной ДНК может быть определено согласно ГОСТ Р 53244.

--------------------------------

<1> Основана на использовании Taq-полимеразы, обладающей 5'-экзонуклеазной активностью, и флуоресцентного TaqMan-зонда, меченого флуорофором (5'-конец) и гасителем флуоресценции (3'-конец). В интактном зонде флуоресценция, испускаемая флуорофором, поглощается расположенным рядом гасителем. На этапе отжига праймеров зонд гибридизуется с ампликоном и разрушается во время элонгации благодаря 5'-экзонуклеазной активности полимеразы; при этом испускаемая флуорофором энергия уже не поглощается гасителем. Накопление сигнала флуоресценции регистрируется по мере накопления продуктов ПЦР.

1.3. Для интерпретации результатов ПЦР-РВ и расчета содержания ГМО применен метод относительного анализа по двум калибровочным кривым.

1.4. Методические указания предназначены для органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, осуществляющих контроль качества и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов, а также могут быть использованы организациями, аккредитованными в установленном порядке на проведение исследований продовольственного сырья, пищевых продуктов.

1.5. Методические указания носят рекомендательный характер.

2.1. Идентификация и количественное определение ГМО методом относительного анализа по двум калибровочным кривым включает использование двух независимых систем ПЦР-РВ (реакций, проводимых в отдельных пробирках), каждая из которых имеет специфичные ДНК-праймеры и флуоресцентно-меченые зонды:

- одна ПЦР-система выявляет последовательность области ДНК, специфичной для соответствующего трансформационного события (ГМ-специфичная ДНК);

- другая ПЦР-система выявляет последовательность области ДНК, специфичной для соответствующего вида растения (таксон-специфичная ДНК).

2.2. Для построения калибровочных кривых должны быть использованы соответствующие сертифицированные стандартные образцы (далее - ССО) с известным содержанием ДНК <2>.

--------------------------------

<2> Могут использоваться ССО Института контрольных материалов и измерений (Institute for Reference Materials and Measurements (JRC-IRMM), ССО Американского общества химиков масложировой промышленности (American Oil Chemists Society; AOCS) или эквивалентные образцы, применение которых приводит к тем же результатам.

Построение первой калибровочной кривой (для ГМ-специфичной ДНК) выполняется по результатам ГМ-специфичной ПЦР-РВ, а второй (для таксон-специфичной ДНК) - по результатам таксон-специфичной ПЦР-РВ.

2.3. Количество ГМ-специфичной ДНК (рис. 2.1) и таксон-специфичной ДНК (рис. 2.2) в пробах определяется путем линейной интерполяции по соответствующим калибровочным кривым.

2.4. Содержание ГМО в пробе представляет собой отношение ГМ-специфичной ДНК к таксон-специфичной ДНК, выраженное в процентах. Расчет производят по формуле:

3.1. Метод идентификации и количественного определения кукурузы линии DAS-40278-9 основан на ПЦР-РВ. Мишенями для анализа являются:

- область ДНК, специфичная для трансформационного события DAS-40278-9, расположенная на границе геномной ДНК кукурузы и генно-инженерной генетической конструкции;

- таксон-специфичная для кукурузы целевая последовательность - ген hmg, кодирующий синтез группы ядерных белков с высокой подвижностью (high mobility group, HMG).

3.1.1. Предел обнаружения метода составляет как минимум 0,04% в 200 нг ДНК кукурузы; предел количественного определения метода составляет как минимум 0,08% в 200 нг ДНК кукурузы.

3.1.2. Схема разведений и концентрации растворов для построения калибровочных кривых, протокол состава праймеров и зондов, состав реакционных смесей и режим амплификации представлены в табл. 3.1 - 3.4.

Примечание. Для определения кукурузы линии DAS-40278-9 допустимо использование тест-систем с аналогичными техническими характеристиками и разрешенными для использования в установленном порядке.

--------------------------------

<*> Из расчета массы генома кукурузы, равной 2,725 пкг.

--------------------------------

<**> Для приготовления раствора может быть использован 10% ССО, кат. N ERM-BF433d.

--------------------------------

<*> Реакционная смесь, согласно протоколу Joint Research Centre (Объединенный Научный Центр Европейского Союза, далее - JRC), для количественного определения трансформационного события DAS-40278-9. Допускается применение других реактивов с техническими и метрологическими характеристиками не хуже указанных.

--------------------------------

<*> Согласно протоколу JRC, для количественного определения трансформационного события DAS-40278-9. Температурно-временной режим должен быть скорректирован с учетом рекомендаций производителя реакционной смеси.

3.2. Метод идентификации и количественного определения кукурузы линии MZIR098 основан на ПЦР-РВ. Мишенями для анализа являются:

- область ДНК, специфичная для трансформационного события MZIR098, расположенная на границе геномной ДНК кукурузы и генно-инженерной генетической конструкции;

- таксон-специфичная для кукурузы целевая последовательность - ген adh1, кодирующий алкогольдегидрогеназу 1.

3.2.1. Предел обнаружения метода составляет как минимум 0,04% в 200 нг ДНК кукурузы; предел количественного определения метода составляет как минимум 0,08% в 200 нг ДНК кукурузы.

3.2.2. Схема разведений и концентрации растворов для построения калибровочных кривых, протокол состава праймеров и зондов, состав реакционных смесей и режим амплификации представлены в табл. 3.5 - 3.8.

Примечание. Для определения кукурузы линии MZIR098 допустимо использование тест-систем с аналогичными техническими характеристиками и разрешенными для использования в установленном порядке.

--------------------------------

<*> Из расчета массы генома кукурузы, равной 2,5 пкг.

--------------------------------

<**> Для приготовления раствора может быть использован 99% ССО, кат. N AOCS 1114-B.

--------------------------------

<*> Реакционная смесь, согласно протоколу JRC, для количественного определения трансформационного события MZIR098. Допускается применение других реактивов с техническими и метрологическими характеристиками не хуже указанных.

--------------------------------

<*> Согласно протоколу JRC, для количественного определения трансформационного события MZIR098. Температурно-временной режим должен быть скорректирован с учетом рекомендаций производителя реакционной смеси.

3.3. Метод идентификации и количественного определения кукурузы линии MZHG0JG основан на ПЦР-РВ. Мишенями для анализа являются:

- область ДНК, специфичная для трансформационного события MZHG0JG, расположенная на границе геномной ДНК кукурузы и генно-инженерной генетической конструкции;

- таксон-специфичная для кукурузы целевая последовательность - ген adh1, кодирующий алкогольдегидрогеназу 1.

3.3.1. Предел обнаружения метода составляет как минимум 0,01% в 250 нг ДНК кукурузы; предел количественного определения метода составляет как минимум 0,08% в 250 нг ДНК кукурузы.

3.3.2. Схема разведений и концентрации растворов для построения калибровочных кривых, протокол состава праймеров и зондов, состав реакционных смесей и режим амплификации представлены в табл. 3.9 - 3.12.

Примечание. Для определения кукурузы линии MZHG0JG допустимо использование тест-систем с аналогичными техническими характеристиками и разрешенными для использования в установленном порядке.

--------------------------------

<*> Из расчета массы генома кукурузы, равной 2,73 пкг.

--------------------------------

<**> Для приготовления раствора может быть использован 100% ССО, кат. N AOCS 1114-C.

--------------------------------

<*> Реакционная смесь, согласно протоколу JRC, для количественного определения трансформационного события MZHG0JG. Допускается применение других реактивов с техническими и метрологическими характеристиками не хуже указанных.

--------------------------------

<*> Согласно протоколу JRC, для количественного определения трансформационного события MZHG0JG. Температурно-временной режим должен быть скорректирован с учетом рекомендаций производителя реакционной смеси.

4.1. Метод идентификации и количественного определения сои линии MON87708 основан на ПЦР-РВ. Мишенями для анализа являются:

- область ДНК, специфичная для трансформационного события MON87708, расположенная на границе геномной ДНК сои и генно-инженерной генетической конструкции;

- таксон-специфичная для сои целевая последовательность - ген le1, кодирующий лектин.

4.2.1. Предел обнаружения метода составляет как минимум 0,04% в 200 нг ДНК сои; предел количественного определения метода составляет как минимум 0,085% в 200 нг ДНК сои.

4.2.2. Схема разведений и концентрации растворов для построения калибровочных кривых, протокол состава праймеров и зондов, состав реакционных смесей и режим амплификации представлены в табл. 4.1 - 4.4.

--------------------------------

<*> Из расчета массы генома сои, равной 1,13 пкг

--------------------------------

<**> Для приготовления раствора может быть использован 100% ССО, кат. N AOCS 0311-A.

--------------------------------

<*> Реакционная смесь, согласно протоколу JRC, для количественного определения трансформационного события MON87708. Допускается применение других реактивов с техническими и метрологическими характеристиками не хуже указанных.

--------------------------------

<*> Согласно протоколу JRC, для количественного определения трансформационного события MON87708. Температурно-временной режим должен быть скорректирован с учетом рекомендаций производителя реакционной смеси.

4.2.3. Для определения сои линии MON87708 допустимо использование тест-систем с аналогичными техническими характеристиками и разрешенными для использования в установленном порядке.

1. ГОСТ Р 53244 (ИСО 21570). Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и полученных из них продуктов. Методы, основанные на количественном определении нуклеиновых кислот. М.: Стандартинформ, 2009. 60 с.

2. ГОСТ Р ИСО 21571. Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и полученных из них продуктов. Экстракция нуклеиновых кислот.

3. Arumuganathan K., Earle E.D., 1991. Nuclear DNA content of some important plant species. Plant Molecular Biology Reporter, 9: 208 - 218.

4. Event-specific Method for the Quantification of maize DAS-40278-9 by Real-time PCR. URL: /template/go.php?url=https://gmo-crl.jrc.ec.europa.eu/summaries/2012-08-15_EURL-VL-10-10%20VM_JRC76621.pdf

5. Event-specific Method for the Quantification of maize MZHG0JG by Real-time PCR. URL: /template/go.php?url=https://gmo-crl.jrc.ec.europa.eu/summaries/EURL-VL-04-16-VM.pdf

6. Event-specific Method for the Quantification of maize MZIR098 by Real-time PCR. URL: /template/go.php?url=https://gmo-crl.jrc.ec.europa.eu/StatusOfDossiers.aspx

7. Event-specific Method for the Quantification of soybean MON87708 by Real-time PCR. URL: /template/go.php?url=https://gmo-crl.jrc.ec.europa.eu/summaries/EURL-VL-02-ll_VM.pdf

8. Seifi M., Ghasemi A., Heidarzadeh S., Khosravi M., Namipashaki A., Soofiany V.M. et al. Overview of real-time PCR principles. In: Polymerase chain reaction / ed. by Hernandez-Rodriguez P. Rijeka, Croatia: InTech, 2012. 566 p.