"МУК 4.1.3890-23. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств хлорантранилипрола в луке методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 28.06.2023)

1. Разработаны ФГБНУ "Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений" (Черменская Т.Д., Алексеев Е.Ю., Долженко В.И.).

2. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой "28" июня 2023 г.

3. Введены впервые.

1.1. Настоящие методические указания (далее - МУК) устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения массовой концентрации хлорантранилипрола в луке в диапазоне концентраций от 0,01 до 0,1 мг/кг включительно.

1.2. МУК носят рекомендательный характер.

2.1. Хлорантранилипрол. 3-бром-4'-хлор-1-(3-хлор-2-пиридил)-2'-метил-6'-(метилкарбамоил)пиразол-5-карбоксанилид.

Структурная формула представлена на рисунке 1.

Химическая формула C₁₈H₁₄BrCl₂N₅O₂.

Молекулярная масса: 483,2.

Химически чистое вещество представляет собой мелкий порошок белого цвета без запаха.

Температура плавления: плюс 209 °C. Давление пара: 6,3 x 10^-9 МПа (плюс 20 °C).

Коэффициент распределения в системе н-октанол - вода: K_ow log P = 2,76 (pH 7).

Растворимость в воде 1,02 мг/дм³ при плюс 20 °C, pH (4 - 9). Растворимость в органических растворителях (плюс 20 °C, в г/дм³): в ацетоне 3,45; ацетонитриле 0,71; этилацетате 1,14; дихлорметане 2,48; метаноле 1,71.

Быстро разлагается на свету. Слабая кислота, pK_a 10,88.

Острая пероральная токсичность ЛД₅₀ более 5000 мг/кг (крысы). При подкожном введении ЛД₅₀ для крыс более 5000 мг/кг. Ингаляционная токсичность (4 ч) ЛК₅₀ более 5,1 мг/дм³ воздуха (крысы). Не раздражает кожу у кроликов.

Контактно-кишечный инсектицид - воздействует на рианидин-рецепторы, регулирующие нервную и мышечную активность насекомых посредством изменения уровня кальция в клетках. Препарат на основе хлорантранилипрола в организме насекомого способствует активации высвобождения внутренних запасов ионов кальция из мышц. Вследствие этого насекомое перестает сокращать мышцы, наступает паралич. Вредитель погибает в течение 2-х - 4-х дней. Препарат эффективен против различных стадий развития чешуекрылых (яблонная плодожорка, листовертки), двукрылых, жесткокрылых (колорадский жук). Применяется на широком спектре культур, включая плодовые, овощные, виноград, хлопок, рис и травы.

3.1. При соблюдении всех условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в таблице 1, для соответствующих диапазонов концентраций.

4.1. Определение хлорантранилипрола основано на экстракционном извлечении определяемого компонента из проб органическим растворителем, очистке экстракта на сорбенте и последующем анализе экстракта методом ВЭЖХ с использованием ультрафиолетового детектора (далее - УФ-детектор).

Идентификация хлорантранилипрола проводится по времени удерживания, количественное определение - методом абсолютной калибровки.

Избирательность метода обеспечивается сочетанием условий подготовки проб и хроматографирования.

3.1. Средства измерений:

- ультраэффективный жидкостный хроматограф с быстро-сканирующим УФ-детектором (диапазон длин волн (190 - 500) нм), (макс. рабочее давление 100 МПа), снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки. Относительное СКО выходного сигнала: по площади пиков - 1%; по времени удерживания - 0,3%;

- весы лабораторные общего назначения, наибольший предел взвешивания 150 г, предел допустимой погрешности 5 мг, ГОСТ Р 53228;

- весы лабораторные аналитические, наибольший предел взвешивания 81/210 г, предел допустимой погрешности 0,1/0,3 мг. ГОСТ Р 53228;

- дозаторы пипеточные переменного объема от 10 до 100 мм³, от 100 до 1000 мм³, от 1000 до 5000 мм³, ГОСТ 28311;

- колбы мерные: 2-10-2, 2-100-2, 2-1000-2, ГОСТ 1770;

- цилиндры мерные: 1-50-2, 1-100-2, ГОСТ 1770.

3.2. Реактивы:

- ацетонитрил для ВЭЖХ;

- вода для лабораторного анализа (бидистиллированная, деионизованная), ГОСТ Р 52501;

- гексан, чистый для анализа;

- кислота ортофосфорная 98%, химически чистая, ГОСТ 6552;

- магний сернокислый безводный, 99%;

- натрий хлористый, чистый для анализа, ГОСТ 4233;

- патроны для твердофазной экстракции, заполненные гидрофильным слабокислотным сорбентом на основе силикагеля с постоянной активностью (0,6 г);

- сорбент для твердофазной экстракции на основе силикагеля с привитыми N-пропилэтилендиаминными группами (PSA), площадь поверхности ~ 500 м²/г, средний размер пор 70 А, средний размер частиц 50 мкм;

- хлорантранилипрол с содержанием основного вещества 99,9%;

- этилацетат, химически чистый, ГОСТ 22300.

3.3. Вспомогательные устройства и материалы:

- аналитическая колонка, заполненная сорбентом с привитыми монофункциональными полярными группами C18 с встроенной карбаматной группой, (100 x 2,1) мм, 1,7 мкм;

- вакуумный манипулятор для работы с патронами для твердофазной экстракции;

- виалы хроматографические объемом 2 см³;

- воздушный испаритель, состоящий из термостата (300 Вт, макс. температура плюс 130 °C), газодозатора (макс. давление 0,5 бар) и компрессора (макс. давление 2,4 бар);

- морозильная камера, обеспечивающая поддержание температуры минус 18 °C;

- предколонка, заполненная сорбентом с привитыми монофункциональными полярными группами C18, (5 x 2,1) мм, 1,7 мкм;

- пробирки полипропиленовые центрифужные с крышками объемом 50 и 15 см³;

- пробирки стеклянные П2-14-100 ХС, ГОСТ 25336;

- устройство перемешивающее с орбитальным движением платформы, (50 - 200) колебаний в мин, амплитуда 20 мм;

- холодильник, обеспечивающий поддержание температуры плюс (0 - 4) °C;

- центрифуга с частотой вращения 4000 об/мин.

5.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на комплекс жидкостного хроматографа.

5.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать гигиенических нормативов <1>. Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004.

--------------------------------

<1> СанПиН 1.2.3685-21 "Гигиенические нормативы и требования к обеспечению безопасности и (или) безвредности для человека факторов среды обитания", утвержденные постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 28.01.2021 N 2 (зарегистрировано Минюстом России 29.01.2021 N 62296).

6.1. К выполнению измерений и обработке их результатов допускаются специалисты, имеющие опыт работы в химической лаборатории, прошедшие обучение и владеющие техникой проведения анализа, освоившие метод анализа в процессе тренировки и уложившиеся в нормативы контроля при проведении процедуры контроля погрешности анализа.

7.1. При выполнении измерений выполняют следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха плюс (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%.

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

8.1. Подготовка к определению.

8.2. Очистка органических растворителей.

Растворители, используемые для анализа, специальной подготовки не требуют. Рекомендуется проверить чистоту применяемых растворителей. При обнаружении примесей, которые могут мешать определению, растворители очищают общепринятыми методами.

8.3. Кондиционирование колонки.

Перед началом анализа аналитическую колонку кондиционируют в потоке подвижной фазы (0,1 - 0,2) см³/мин до стабилизации нулевой линии.

8.4. Приготовление растворов.

8.4.1. 0,005 М раствор ортофосфорной кислоты: (0,50 +/- 0,01) г 98% ортофосфорной кислоты помещают в мерную колбу объемом 1000 см³, растворяют в деионизованной воде и доводят объем до метки. Раствор хранят при комнатной температуре не более 14 дней.

8.4.2. Для приготовления подвижной фазы для ВЭЖХ в мерную колбу вместимостью 1000 см³ помещают 440 см³ ацетонитрила и доводят до метки 0,005 М раствором ортофосфорной кислоты. Раствор хранят при комнатной температуре в темном месте (в емкости из темного стекла) не более 14 дней.

8.4.3. Для приготовления элюента N 1 (смесь гексан-этилацетат 7:3) в колбе на 100 см³ смешивают 70 см³ гексана и 30 см³ этилацетата. Используется в день приготовления.

8.4.4. Для приготовления элюента N 2 (смесь гексан-этилацетат 1:1) в колбе на 100 см³ смешивают 50 см³ гексана и 50 см³ этилацетата. Используется в день приготовления.

8.5. Приготовление основного и градуировочных растворов.

8.5.1. Основной раствор хлорантранилипрола с концентрацией 0,5 мг/см³: точную навеску хлорантранилипрола (50 +/- 0,5) мг помещают в мерную колбу вместимостью 100 см³, растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом.

8.5.2. Приготовление градуировочных растворов.

Градуировочные растворы с концентрациями хлорантранилипрола 0,02, 0,05, 0,1 и 0,2 мкг/см³ готовят методом последовательного разбавления по объему, используя ацетонитрил.

8.5.2.1. Раствор N 1 с концентрацией 1,0 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 100 см³ дозатором вносят 0,2 см³ основного раствора и доводят до метки подвижной фазой.

8.5.2.2. Раствор N 2 с концентрацией 0,2 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ дозатором вносят 2,0 см³ раствора N 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

8.5.2.3. Раствор N 3 с концентрацией 0,1 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ дозатором вносят 1,0 см³ раствора N 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

8.5.2.4. Раствор N 4 с концентрацией 0,05 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ дозатором вносят 0,5 см³ раствора N 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

8.5.2.5. Раствор N 5 с концентрацией 0,02 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ дозатором вносят 1,0 см³ раствора N 2 и доводят объем до метки подвижной фазой.

Основной раствор хлорантранилипрола можно хранить в холодильнике при температуре плюс (0 - 4) °C в течение 6 месяцев, градуировочные растворы - в течение недели.

При изучении полноты определения хлорантранилипрола используют ацетонитрильные растворы веществ, приготовленные из основного раствора методом последовательного разбавления по объему ацетонитрилом.

8.6. Установление градуировочной характеристики.

Градуировочная характеристика, выражающая зависимость площади пика от концентрации хлорантранилипрола в растворе (мкг/см³), устанавливают методом абсолютной калибровки по не менее, чем 4-м растворам для градуировки.

В инжектор хроматографа вводят по 10 мм³ каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 10.3. Осуществляют не менее 3-х параллельных измерений. Устанавливают площади пиков вещества, на основании которых строят градуировочную зависимость.

Градуировки признают удовлетворительными, если значение коэффициента линейной корреляции оказывается не ниже 0,99.

Градуировочные зависимости признают стабильными при выполнении следующего условия:

где C - известная концентрация хлорантранилипрола в градуировочном растворе, мкг/см³;

C_к - результат контрольного измерения массовой концентрации хлорантранилипрола в градуировочном растворе, мкг/см³;

- норматив контроля градуировочного коэффициента, % ( при P = 0,95).

Если расхождение превышает 10%, делают вывод о невозможности применения градуировочной характеристики для дальнейших измерений. В этом случае выясняют и устраняют причины нестабильности градуировочной характеристики и повторяют контроль ее стабильности с использованием других градуировочных растворов хлорантранилипрола. При повторном обнаружении нестабильности градуировочной характеристики устанавливают ее заново.

Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

Градуировочную характеристику следует проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы.

8.7. Кондиционирование патрона для твердофазной экстракции.

Патрон промывают 2,5 см³ элюента N 2, затем 3 см³ элюента N 1, приготовленных по пп. 8.4.3 и 8.4.4.

9.1. Отбор проб производится в соответствии с методическими документами <2>.

--------------------------------

<2> Унифицированные правила отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов, утвержденные заместителем Главного государственного санитарного врача СССР 21.08.1979 N 2051-79; ГОСТ 34306 "Межгосударственный стандарт. Лук репчатый свежий. Технические условия", введен в действие Приказом Росстандарта от 28.11.2017 N 1844-ст.

Пробы лука хранят до анализа в герметичной таре в морозильной камере при температуре не выше минус 18 °C.

10.1. Определение хлорантранилипрола в луке-репке и луке-перо.

Навеску измельченной матрицы 10 г помещают в полипропиленовую центрифужную пробирку вместимостью 50 см³, последовательно добавляют 10 см³ ацетонитрила, 4 г безводного сульфата магния, 1 г хлористого натрия. Пробирку плотно закрывают и помещают в перемешивающее устройство на 10 мин, затем центрифугируют в течение 10 мин при 4000 об./мин. От верхнего ацетонитрильного слоя пипеточным дозатором отбирают 5 см³, переносят в центрифужную пробирку вместимостью 15 см³, содержащую 300 мг сорбента на основе силикагеля с привитыми N-пропилэтилендиаминными группами (PSA) и 900 мг безводного сульфата магния. Пробирку плотно закрывают и помещают в перемешивающее устройство на 10 мин, затем центрифугируют в течение 10 мин при 4000 об./мин. От верхнего ацетонитрильного слоя пипеточным дозатором отбирают 2 см³ в стеклянную пробирку и упаривают растворитель в токе воздуха при температуре не выше плюс 40 °C. Сухой остаток чистят на патроне для твердофазной экстракции по п. 10.2.

10.2. Очистка на патроне для твердофазной экстракции.

Остаток, полученный при упаривании экстрактов (п. 10.1), растворяют в 1 см³ элюента N 1 и переносят на подготовленный патрон (п. 8.7). Пробирку обмывают 1 см³ элюента N 1 и смыв тоже переносят на патрон. Промывают патрон 5 см³ элюента N 1. Хлорантранилипрол элюируют 5 см³ элюента N 2. Элюат упаривают досуха в токе воздуха при температуре не выше плюс 40 °C. Сухой остаток растворяют в 1 см³ подвижной фазы и анализируют по п. 9.3.

10.3. Условия хроматографирования:

- ультраэффективный жидкостный хроматограф с быстро-сканирующим УФ-детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки;

- элюирование в системе ацетонитрил - 0,005 М H₃PO₄ в соотношении 44:56 по объему;

- скорость потока 0,2 см³/мин;

- температура колонки плюс (30 +/- 1) °C;

- аналитическая колонка, заполненная сорбентом с привитыми монофункциональными полярными группами C18 с встроенной карбаматной группой, (100 x 2,1) мм, 1,7 мкм;

- предколонка, заполненная сорбентом с привитыми монофункциональными полярными группами C18, (5 x 2,1) мм с зернением 1,7 мкм;

- объем вводимой пробы 10 мкл;

- детектирование при длине волны 220 нм;

- время удерживания (4,5 +/- 0,1) мин.

11.1. Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки. Содержание хлорантранилипрола в пробе (X, мг/кг) вычисляют по формуле:

где C - концентрация хлорантранилипрола, найденная по градуировочному графику в соответствии с величиной площади хроматографического пика, мкг/см³;

f - полнота извлечения хлорантранилипрола, приведенная в табл. 2, %;

V - объем пробы, подготовленной для хроматографического анализа, см³ (1 см³);

m - окончательная масса анализируемого образца, г (аликвота, соответствующая навеске 2 г).

Содержание остаточных количеств хлорантранилипрола в образце вычисляют как среднее из двух параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор хлорантранилипрола с концентрацией 0,2 мкг/см³, разбавляют подвижной фазой.

12.1. За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:

где X₁, X₂ - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости (приведен в таблице 1).

При невыполнении условия выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

13.1. Результат анализа представляют в виде:

где - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

- граница абсолютной погрешности, мг/кг;

где - граница относительной погрешности методики (приведена в таблице 1), %.

В случае, если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе "менее нижней границы определения".

Например: менее 0,01 мг/кг <*>, где <*> - 0,01 мг/кг - предел обнаружения хлорантранилипрола в луке-репке.

14.1. Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-(1 - 6).

14.2. Стабильность градуировочной характеристики.

Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят ежедневно перед анализом серии проб. Средствами контроля являются свежеприготовленные образцы для градуировки с массовыми концентрациями, соответствующими нижней и верхней границам и середине диапазона построения градуировочной характеристики.

Градуировочная характеристика признается стабильной при выполнении условия, указанного в п. 8.6.

14.3. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

Величина добавки C_д должна удовлетворять условию:

где - характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой, соответственно), мг/кг; при этом:

где - граница абсолютной погрешности, мг/кг:

где - граница относительной погрешности методики (приведена в таблице 1), %.

Результат контроля процедуры К_к рассчитывают по формуле:

где , , C_д - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 12.1) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки, соответственно, мг/кг.

Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (К_к) с нормативом контроля (К).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию:

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении этого условия процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.

14.4. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости:

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

где X₁, X₂ - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;

R - предел воспроизводимости (приведен в таблице 1), %.