"МУК 4.1.3792-22. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточного содержания стероидных гормонов в рыбе и морепродуктах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с масс-спектрометрическим анализом (ВЭЖХ-МС/МС). Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 27.10.2022)

1.1. Настоящие методические указания (далее - МУК) устанавливают методику определения остаточных количеств стероидных гормонов в рыбе, используемых в процессе ее выращивания в условиях аквакультуры и прудах в соответствии с законодательными требованиями по использованию водных объектов рыбохозяйственного значения для целей рыболовства <1>, методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (далее - ВЭЖХ) в сочетании с масс-спектрометрическим анализом (далее - ВЭЖХ-МС/МС).

--------------------------------

<1> Федеральный закон от 02.07.2013 N 148-ФЗ "Об аквакультуре (рыбоводстве) и о внесении изменений в отдельные законодательные акты Российской Федерации".

1.2. МУК предназначены для органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, осуществляющих контроль качества и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов, а также могут быть использованы для производственного контроля испытательными лабораториями, аккредитованными в установленном порядке <2>.

--------------------------------

<2> Федеральный закон от 28.12.2013 N 412-ФЗ "Об аккредитации в национальной системе аккредитации"; Решение Совета Евразийской экономической комиссии от 05.12.2018 N 100 "О Порядке включения аккредитованных органов по оценке соответствия (в том числе органов по сертификации, испытательных лабораторий (центров)) в единый реестр органов по оценке соответствия Евразийского экономического союза, а также его формирования и ведения".

1.3. МУК носят рекомендательный характер.

2.1. Эстрон - женский половой стероидный гормон. Систематическое название - 1,3,5-эстратриен-3-ол-17-он <3>. Химическая формула: C₁₈H₂₂O₂. Молекулярный вес: 270,37 г/моль. Регистрационный номер CAS: 53-16-7. Синонимы: 3-Hydroxy-1,3,5(10)-estratrien-17-one; 1,3,5(10)-Estratrien-3-ol-17-one; Folliculin.

--------------------------------

<3> В соответствии с Международным союзом теоретической и прикладной химии (англ. International Union of Pure and Applied Chemistry, IUPAC, далее - ИЮПАК).

Дигидротестостерон - биологически более активная форма стероидного гормона тестостерона. Систематическое название - (16,16,17-D3) <4>. Химическая формула: C₁₉H₃₀O₂. Молекулярный вес: 290,45 г/моль. Регистрационный номер CAS: 521-18-6.

--------------------------------

<4> В соответствии с ИЮПАК.

- синтетический стероидный гормон, метилпроизводное тестостерона. Систематическое название - 17-метилтестостерон, <5>. Химическая формула: C₂₀H₃₀O₂. Молекулярный вес: 302,45 г/моль. Регистрационный номер CAS: 58-18-4. Синонимы: Mesterone; ; ; Methyltestosterone.

--------------------------------

<5> В соответствии с ИЮПАК.

Местанолон - андроген, анаболический стероидный гормон. Химическая формула C₂₀H₃₂O₂. Молекулярный вес: 304,47 г/моль. Регистрационный номер CAS: 521-11-9. Синонимы: Methylandrostanolone, Mestanolone, , , , Mestaline, .

Химические названия и химические формулы веществ изображены на рис. 1.

3.1. Метод основан на экстракции стероидных гормонов из гомогенизированного мяса рыбы раствором муравьиной кислоты в ацетонитриле с последующей твердофазной экстракцией и дериватизацией раствором гидроксиламина в метиловом спирте. Количественное определение производных гормонов производится при помощи метода ВЭЖХ-МС/МС с использованием внешней калибровки.

4.1. При соблюдении всех регламентируемых условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерения при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

5.1. При выполнении измерений и подготовке проб применяют средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы, приведенные в табл. 2 - 4.

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание. Допускается использование вспомогательных средств измерений, устройств и материалов с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.

6.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать технику безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также технику безопасности, изложенную в технической документации на прибор.

6.2. Помещение должно соответствовать пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Организация обучения работников безопасности труда по ГОСТ 12.0.004.

6.3. Помещение, в котором проводится определение стероидных гормонов, оборудуется приточно-вытяжной вентиляцией. Все операции по подготовке образцов к анализу необходимо проводить в вытяжном шкафу. Анализ содержания стероидных гормонов в подготовленных образцах проводится в специализированном проветриваемом помещении, оснащенном вытяжкой, при температуре не более плюс 25 °C с целью защиты дыхания.

6.4. К выполнению измерений и обработке их результатов допускают специалистов, имеющих высшее или среднее специальное образование, имеющих опыт работы в химико-аналитической лаборатории. Измерения в соответствии с настоящими методическими указаниями может выполнять специалист, имеющий опыт работы на жидкостном хроматографе с масс-спектрометрическим детектором, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений.

7.1. Отбор проб рыбы для проведения анализа осуществляется по ГОСТ 31339. Подготовка к анализу средней пробы рыбы (свежая, охлажденная, мороженая) осуществляется по ГОСТ 7636.

8.1. Условия проведения измерений.

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха плюс 15 - 30 °C и относительной влажности не более 85%;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе и масс-спектрометре проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к приборам.

9.1. Приготовление компонентов подвижной фазы для ВЭЖХ.

9.1.1. Приготовление компонента A подвижной фазы.

Для приготовления компонента A подвижной фазы (0,1%-й (объем) раствор муравьиной кислоты в воде): в мерную колбу вместимостью 1000 см³ помещают 300 - 400 см³ бидистиллированной воды, вносят 1 см³ муравьиной кислоты, перемешивают, доводят водой до метки, вновь перемешивают.

Приготовленный раствор подвижной фазы хранят при температуре плюс 4 - 8 °C не более пяти рабочих дней.

9.1.2. Приготовление компонента B подвижной фазы.

Для приготовления компонента B подвижной фазы (0,1%-й (объем) раствор муравьиной кислоты в метиловом спирте): в мерную колбу вместимостью 1000 см³ помещают 300 - 400 см³ метилового спирта, вносят 1 см³ муравьиной кислоты, перемешивают, доводят метиловым спиртом до метки, вновь перемешивают.

Приготовленный раствор подвижной фазы хранят при температуре плюс 4 - 8 °C не более 1 месяца.

9.2. Приготовление растворов.

9.2.1. Приготовление раствора муравьиной кислоты в ацетонитриле с объемной долей 1% (1%-й раствор).

В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 30 - 40 см³ ацетонитрила, вносят 1 см³ муравьиной кислоты, перемешивают, доводят ацетонитрилом до метки, вновь перемешивают.

Приготовленный раствор подвижной фазы хранят при температуре плюс 4 - 8 °C не более 1 месяца.

9.2.2. Приготовление 100 мМ раствора гидроксиламина гидрохлорида в метиловом спирте.

В мерную колбу вместимостью 10 см³ вносят 0,07 г гидроксиламина гидрохлорида, помещают 3 - 4 см³ метилового спирта, перемешивают, доводят метиловым спиртом до метки, вновь перемешивают.

Приготовленный раствор хранят при температуре плюс 4 - 8 °C не более 1 месяца.

9.2.3. Подготовка сернокислого магния.

Используемый при проведении экстракции в качестве сорбента сернокислый магний в пределах срока годности необходимо высушивать для удаления влаги. Сорбент прокаливают при температуре плюс 180 - 200 °C в течение 6 - 10 часов и хранят в эксикаторе над безводным хлористым кальцием.

Критерием годности реактива служит отсутствие дополнительного водного слоя при проведении стадии экстракции до температуры плюс 30 - 40 °C и через 2 - 3 минуты перемешивания реакционной массы.

9.3. Приготовление индивидуальных, стоковых и градуировочных растворов, матричных градуировочных стандартов.

9.3.1. Приготовление индивидуальных стандартных растворов стероидных гормонов.

Для приготовления индивидуальных стандартных растворов стероидных гормонов эстрона, дигидротестостерона, и местанолона в ацетонитриле с концентрацией 1 мг/см³ в мерную колбу вместимостью 10 см³ вносят 10 мг каждого стандартного образца стероидных гормонов, помещают 3 - 4 см³ ацетонитрила, перемешивают, доводят ацетонитрилом до метки, вновь перемешивают.

Индивидуальные стандартные растворы стероидных гормонов хранят при температуре минус 24 - 18 °C не более 6 месяцев.

9.3.2. Приготовление стокового раствора стероидных гормонов.

Для приготовления стокового раствора стероидных гормонов эстрона, дигидротестостерона, и местанолона в ацетонитриле с концентрацией 10 мкг/см³ в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 3 - 4 см³ ацетонитрила, 0,1 см³ каждого стандартного раствора (по п. 9.3.1), перемешивают, доводят ацетонитрилом до метки, вновь перемешивают.

Стоковый раствор стероидных гормонов хранят при температуре минус 24 - 18 °C не более 3 месяцев.

9.3.3. Приготовление градуировочных растворов стероидных гормонов.

Градуировочные растворы стероидных гормонов эстрона, дигидротестостерона, и местанолона в ацетонитриле с концентрацией 10, 20, 50, 100, 200, 400 и 500 нг/см³ готовятся последовательным разведением стокового раствора (по п. 9.3.2) в микроцентрифужных пробирках объемом 1,5 - 2 см³. Для построения градуировочной кривой необходимо не менее 6 контрольных точек.

Градуировочные растворы стероидных гормонов хранят при температуре плюс 4 - 8 °C не более 1 дня.

9.3.4. Приготовление матричных градуировочных стандартов стероидных гормонов.

Для построения градуировочной характеристики берут "чистые" пробы, не содержащие определяемые аналиты более 0,2 мкг/кг (например, мясо морских рыб (минтай, треска, горбуша)). Пробу измельчают в лабораторном гомогенизаторе до однородного состояния. Добавляют градуировочные растворы стероидных гормонов в ацетонитриле (по п. 9.3.3) из расчета 0,1 см³ на каждые 5 г образца с перемешиванием 1 мин на устройстве типа "вортекс".

Матричные градуировочные стандарты хранят при температуре плюс 4 - 8 °C не более 1 дня.

9.4. Контроль стабильности градуировочной характеристики.

9.4.1. Контроль стабильности градуировочной характеристики.

Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят в начале и по окончании каждой серии анализов. При контроле стабильности градуировочной характеристики проводят измерения не менее двух матричных градуировочных стандартов, содержание стероидных гормонов в которых входит в диапазон линейности градуировочной характеристики от 0,2 - 10 мкг/кг. Градуировочная зависимость считается стабильной, если рассчитанное значение квадрата коэффициента корреляции для градуировочной кривой составляет не менее 0,99.

9.4.2. Построение градуировочной кривой.

Построение градуировочной кривой проводится по отношению площади хроматографического пика фрагментного иона (S., I*сек) к массовой концентрации (мкг/кг) в 6 градуировочных стандартах по п. 10.2. Зависимость линейная, взвешивание равное (рис. 2 - 5). Построение графиков может проводиться при помощи встроенной программы обработки данных ВЭЖХ-МС/МС или при помощи других программ расчета градуировочных характеристик.

9.5. Подготовка проб рыбы к анализу.

9.5.1. Навеску проб рыбы, измельченных с помощью гомогенизатора градуировочного стандарта, массой 5 г помещают в центрифужную полипропиленовую пробирку вместимостью 50 см³. Вносят 10 см³ бидистиллированной воды, перемешивают и помещают в ультразвуковую ванну на 20 минут. Добавляют 10 см³ раствора ацетонитрила (по п. 9.2.1) и перемешивают в течение 30 мин на лабораторном мультиротаторе. В пробу добавляют 1 г NaCl и 4 г MgSO₄ (по п. 9.2.3). После добавления солей смесь интенсивно перемешивают в течение 2 мин. Затем пробу центрифугируют в течение 5 мин со скоростью не менее 3500 об/мин при температуре плюс 4 °C. Аликвоту экстракта объемом 6 см³ с помощью пипеточного дозатора помещают в центрифужную пробирку объемом 15 см³, содержащую 150 мг первичных и вторичных аминов (PSA) и 150 мг C18. Перемешивают в течение 1 мин на перемешивающем устройстве типа "вортекс" и центрифугируют в течение 5 мин со скоростью не менее 7000 об./мин при комнатной температуре. Аликвоту экстракта объемом 5 см³ с помощью пипеточного дозатора помещают в центрифужную пробирку объемом 15 см³ и упаривают досуха в лабораторном концентраторе при температуре плюс 40 °C. Затем добавляют 0,5 см³ раствора гидроксиламина гидрохлорида (по п. 9.2.2), перемешивают в течение 1 мин на перемешивающем устройстве типа "вортекс" и инкубируют при температуре плюс 40 °C в течение 20 мин в шейкере-инкубаторе. После инкубации полученный раствор повторно упаривают в лабораторном концентраторе досуха и перерастворяют в 1 см³ ацетонитрила. Помещают в ультразвуковую ванну на 5 мин, затем перемешивают в течение 1 мин на перемешивающем устройстве типа "вортекс". С помощью пипеточного дозатора аликвоту объемом не менее 0,8 см³ помещают в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 - 2 см³ и центрифугируют в течение 5 мин со скоростью не менее 14000 об/мин при температуре плюс 4 °C. Затем с помощью пипеточного дозатора аликвоту объемом не менее 0,5 см³ помещают в хроматографическую виалу для проведения ВЭЖХ-МС/МС анализа. В инжектор хроматографа вводят не менее 0,005 см³ каждого экстракта в двух повторах и анализируют в условиях по п. 10.2.

10.1. Для осуществления хроматографического анализа используют жидкостной хроматограф, снабженный бинарным насосом, автосамплером и термостатом колонок. Для осуществления масс-спектрометрического анализа используют подключенный к выходу из хроматографической колонки масс-спектрометр с детектором типа "тройной квадруполь".

10.1.1. Условия проведения измерений ВЭЖХ-МС/МС.

Условия проведения ВЭЖХ-МС/МС измерения приведены в табл. 5.

11.1. Обработка полученных результатов.

В соответствии с данными, полученными при анализе градуировочных растворов, проводят количественную обработку хроматограмм с использованием программного обеспечения. Метод обработки хроматограмм - внешний стандарт. При матричной градуировке пересчет полученного результата не требуется.

11.2. Расчет содержания стероидных гормонов в образцах.

Массовую долю стероидных гормонов в пробе рыбы (X₁, мкг/кг) вычисляют по линейному уравнению вида y = ax + b при помощи встроенной программы обработки данных ВЭЖХ-МС/МС или при помощи других программ расчета градуировочных характеристик.

12.1. За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:

где X₁, X₂ - результаты параллельных определений, мкг/кг;

r - значение предела повторяемости (табл. 1), при этом .

При превышении расчетного значения предела повторяемости (r), измерение следует провести заново, используя свежеприготовленную пробу.

13.1. Результат анализа содержания стероидных гормонов представляют в виде:

где - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мкг/кг;

- граница абсолютной погрешности, мкг/кг,

где - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций (табл. 1), %.

В случае, если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде: "содержание вещества в пробе - менее 0,2 мкг/кг".

14.1. Контроль качества результатов измерений в лаборатории при реализации методики осуществляют по ГОСТ Р ИСО 5725 (1 - 6). Периодичность и формы контроля определяются руководством по качеству.

1. Федеральный закон от 30.03.1999 N 52-ФЗ "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения".

2. Федеральный закон от 02.06.2013 N 148-ФЗ "Об аквакультуре (рыбоводстве) и о внесении изменений в отдельные законодательные акты Российской Федерации".

3. Технический регламент таможенного союза "О безопасности пищевой продукции" (ТР ТС 021/2011).

4. СанПиН 1.2.3685-21 "Гигиенические нормативы и требования к обеспечению безопасности и (или) безвредности для человека факторов среды обитания".

5. ГОСТ 12.0.004 "Система стандартов безопасности труда. Организация обучения безопасности труда. Общие положения".

6. ГОСТ 12.1.004 "Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования".

7. ГОСТ 12.1.007 "Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности".

8. ГОСТ 12.1.019 "Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты".

9. ГОСТ 12.4.009 "Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание".

10. ГОСТ 1770 "Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия".

11. ГОСТ 25336 "Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры".

12. ГОСТ 28311 "Дозаторы медицинские лабораторные. Общие технические требования и методы испытаний".

13. ГОСТ 31339 "Рыба, нерыбные объекты и продукция из них. Правила приемки и методы отбора проб".

14. ГОСТ 4233 "Реактивы. Натрий хлористый. Технические условия".

15. ГОСТ 4523 "Реактивы. Магний серно-кислый 7-водный. Технические условия".

16. ГОСТ 5456 "Реактивы. Гидроксиламина гидрохлорид. Технические условия".

17. ГОСТ 7636 "Рыба, морские млекопитающие, морские беспозвоночные и продукты их переработки. Методы анализа".

18. ГОСТ 9147 "Посуда и оборудование лабораторные фарфоровые. Технические условия".

19. ГОСТ Р 52501 (ИСО 3696:1987) "Вода для лабораторного анализа. Технические условия".

20. ГОСТ Р 53228 "Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания".

21. ГОСТ Р ИСО 5725 (1 - 6) "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".