"МУК 4.1.3938-23. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств пидифлуметофена в зерне зерновых колосовых культур, плодовых косточковых (персик), луке, капусте и моркови методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 03.07.2023)

1. Разработаны ФБУН "Федеральный центр гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана" Роспотребнадзора (Ракитский В.Н., Федорова Н.Е., Бондарева Л.Г.).

2. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой "03" июля 2023 г.

3. Введены впервые.

1.1. Настоящие методические указания (далее - МУК) устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (далее - ВЭЖХ) для определения массовой концентрации пидифлуметофена в зерне зерновых колосовых культур, плодовых косточковых (персик), луке, капусте и моркови в диапазоне 0,01 - 0,2 мг/кг.

1.2. МУК носят рекомендательный характер.

2.1. Пидифлуметофен. 3-(Дифторметил)-N-метокси-1-метил-N-[(RS)1-метил-2(2,4,6-трихлорфенил)этил]-1H-пиразол-4-карбоксамид <1>.

--------------------------------

<1> В соответствии с Международным союзом теоретической и прикладной химии (ИЮПАК, англ. International Union of Pure and Applied Chemistry, IUPAC).

Брутто-формула - C₁₆H₁₆Cl₃F₂N₃O₂. Молекулярная масса 426,7.

2.2. Физические и химические свойства:

- бесцветный порошок;

- температура плавления плюс 113 °C;

- разлагается до кипения;

- давление паров 1,84·10^-4 мПа (при 25 °C);

- коэффициент распределения н-октанол - вода K_owlogP = 3,8 (20 °C);

- растворимость в воде 1,5 мг/дм³ (20 °C);

- растворимость в органических растворителях (мг/дм³): 220000 - ацетон, 130000 - этилацетат, 26000 - метанол, 7200 - октанол.

2.3. Синтетический фунгицид для различных спектров применения на широком ряде культур. Основной механизм действия - ингибитор дегидрогеназы.

3.1. При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в таблице 3.1 для соответствующих диапазонов концентраций (согласно ГОСТ Р ИСО 5725-(1 - 6)).

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для всего диапазона измерений (n = 20) приведены в таблице 3.2.

4.1. Методика основана на определении вещества с помощью ВЭЖХ с ультрафиолетовым детектором.

4.2. Уровень пидифлуметофена в пробах плодовых косточковых (персик), лука, капусты и моркови определяют после экстракции смесью ацетонитрил:вода (8:2), очистки и концентрирования на картридже, заполненном сорбционным материалом на основе сополимера N-винилпирролидона и дивинилбензола. Элюирование пидифлуметофена проводят ацетонитрилом.

4.3. Экстракцию пидифлуметофена из анализируемых проб зерна зерновых колосовых культур выполняют смесью ацетонитрила и воды, с добавлением 1 см³ ледяной уксусной кислоты, центрифугирования, очистки экстракта на картридже, заполненном сорбционным материалом на основе сополимера N-винилпирролидона и дивинилбензола.

4.4. Нижний предел измерения пидифлуметофена в каждом анализируемом объеме пробы - 1 нг.

Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.

5.1. При выполнении измерений и подготовке проб применяют средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы, приведенные в таблицах 5.1 - 5.3.

6.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

6.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004.

6.3. Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист, имеющий опыт работы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, освоивший данную методику и подтвердившего экспериментальное соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений.

7.1. При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха плюс (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

8.1. Очистка растворителей.

8.1.1. Ацетонитрил. Ацетонитрил кипятят с обратным холодильником над пентоксидом фосфора (на 1 дм³ ацетонитрила 20 г пентоксида фосфора) не менее 1 часа, после чего перегоняют, непосредственно перед употреблением ацетонитрил повторно перегоняют над прокаленным карбонатом калия (на 1 дм³ ацетонитрила 10 г карбоната калия). Хранят в емкости из темного стекла.

8.2. Подготовка подвижной фазы для ВЭЖХ. В мерную колбу вместимостью 1000 см³ помещают 750 см³ ацетонитрила и 250 см³ бидистиллированной или деионизованной водой, перемешивают, фильтруют и дегазируют.

Подвижную фазу хранят в темном месте (в емкости из темного стекла) не более 14 дней.

8.3. Кондиционирование хроматографической колонки для ВЭЖХ. Промывают колонку подвижной фазой (приготовленной по п. 8.2) при скорости подачи растворителя 1,0 см³/мин до установления стабильной базовой линии.

8.4. Приготовление градуировочных растворов и растворов внесения.

8.4.1. Исходный раствор пидифлуметофена для градуировки (концентрация 100 мкг/см³). В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 0,0100 +/- 0,0005 г пидифлуметофена, растворяют в 50 - 60 см³ ацетонитрила, доводят ацетонитрилом до метки, тщательно перемешивают.

Раствор хранят в морозильной камере при температуре не выше минус 18 °C в течение шести месяцев.

8.4.2. Рабочий раствор N 1 пидифлуметофена для градуировки и внесения (концентрация 10,0 мкг/см³). В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 10,0 см³ исходного градуировочного раствора с концентрацией 100,0 мкг/см³ (п. 8.4.1), доводят до метки ацетонитрилом, тщательно перемешивают, получают рабочий растворы N 1 с концентрацией пидифлуметофена 10,0 мкг/см³.

Раствор хранят в холодильнике при температуре плюс 2 - 6 °C в течение трех месяцев.

Этот раствор используют для приготовления проб с внесением при оценке полноты извлечения действующего вещества методом "внесено-найдено" и контроля качества результатов измерений методом добавок.

8.4.3. Рабочие растворы N 2 - 6 пидифлуметофена для градуировки (концентрация 0,05 - 1,0 мкг/см³). В 5 мерных колб вместимостью 100 см³ помещают 0,5; 1,0; 2,5; 5,0; 10 см³ рабочего раствора N 1 с концентрацией 10,0 мкг/см³ (п. 8.4.2), доводят до метки подвижной фазой, приготовленной по п. 8.2, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы N 2 - 6 с концентрациями пидифлуметофена 0,05; 0,1; 0,25; 0,5; 1,0 мкг/см³.

Растворы хранят в холодильнике при температуре плюс 2 - 6 °C не более 14 суток.

8.5. Установление градуировочной характеристики. Градуировочную характеристику, выражающую линейную (с угловым коэффициентом) зависимость площади пика от концентрации пидифлуметофена в растворе, устанавливают методом абсолютной калибровки по 5-ти растворам для градуировки.

В инжектор хроматографа вводят по 20 мм³ каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования, указанных ниже. Осуществляют не менее 3-х параллельных измерений. Устанавливают площади пиков пидифлуметофена, на основании которых строят градуировочную зависимость.

Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят в начале и по окончании каждой серии анализов.

При контроле стабильности градуировочной характеристики проводят не менее двух образцов растворов для градуировки, содержание пидифлуметофена в которых должно охватывать весь диапазон концентраций от 0,05 до 1,00 мкг/см³. Градуировочная характеристика считается стабильной, если для каждого из используемого для контроля градуировочного раствора сохраняется соотношение:

где X - концентрация пидифлуметофена в пробе при контрольном измерении, мкг/см³;

C - известная концентрация градуировочного раствора пидифлуметофена, взятая для контроля стабильности градуировочной характеристики, мкг/см³;

B - норматив контроля погрешности градуировочной характеристики, % (B = 10% при P = 0,95).

8.6. Приготовление смесей органических растворителей для экстракции.

8.6.1. Смесь ацетонитрил:вода = 8:2. В мерную колбу на 500 см³ вносят 400 см³ ацетонитрила и 100 см³ бидистиллированной воды. Тщательно перемешивают.

8.6.2. Смесь ацетонитрил:вода = 2:8. В мерную колбу на 500 см³ вносят 100 см³ ацетонитрила и 400 см³ бидистиллированной воды. Тщательно перемешивают.

8.7. Подготовка картриджа для очистки и концентрирования. Картридж устанавливают на аллонж с прямым отводом для вакуума. Промывают картридж последовательно 1 см³ метанолом, 1 см³ ацетонитрилом, затем три раза по 1 см³ смесью ацетонитрил:вода, в соотношении 2:8 по объему, приготовленной по п. 8.6.2. Процедуру проводят с использованием вакуума. Скорость элюирования - 15 - 20 капель в минуту. Не допускать высыхания верхнего слоя сорбента в картридже.

9.1. Отбор проб производится в соответствии с методическими документами <2>.

--------------------------------

<2> Унифицированные правила отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов, утвержденные заместителем Главного государственного санитарного врача СССР 21.08.1979 N 2051-79.

Пробы растительного сырья хранят при температуре плюс 2 - 6 °C неделю. Для длительного хранения образцы замораживают и хранят при температуре не выше минус 18 °C.

10.1. Зерно зерновых колосовых культур.

Измельченные зерна зерновых колосовых культур, массой 10 г, помещают в коническую колбу, объемом 250 см³. Добавляют 100 см³ смеси растворителей ацетонитрила и воды в соотношении 8:2, приготовленной в соответствии с п. 8.6.1, перемешивают. Оставляют в покое на 15 минут. После чего добавляют 1 см³ ледяной уксусной кислоты и помещают на встряхиватель на 30 минут. Раствор декантируют и фильтруют через неплотный бумажный фильтр. Осадок в колбе заливают 30 см³ смеси ацетонитрил:вода (8:2), приготовленной согласно п. 8.6.1. Экстрагируют в течение 15 минут на встряхивателе. После отстаивания раствор фильтруют через неплотный бумажный фильтр. Фильтраты объединяются и переносятся в круглодонную колбу, объемом 250 см³. Упаривают на ротационном вакуумном испарителе, при температуре не выше плюс 30 °C до водного остатка (15 - 20 см³). Водный остаток пропускают через подготовленный в соответствии с п. 8.7 картридж, со скоростью 15 - 20 капель в минуту, используя разрежение, создаваемое водоструйным насосом. После пропускания пробы картридж четыре раза по 1 см³ промывают смесью ацетонитрил:вода в соотношении 2:8, приготовленной в соответствии с п. 8.6.2. Пидифлуметофен элюируют с картриджа ацетонитрилом, 2 раза по 1 см³. Элюат собирают в круглодонную колбу объемом 50 см³. Упаривают на ротационном испарителе при температуре не выше плюс 30 °C до влажного остатка. Остаток в круглодонной колбе растворяют в 2 см³ смеси ацетонитрил:вода в соотношении 8:2, приготовленной в соответствии с п. 8.6.1. Перед хроматографированием пробу дополнительно фильтруют через мембранный фильтр.

10.2. Плодовые косточковые (персик), лук, капуста, морковь.

Измельченную пробу плодов, массой 10 г, помещают в коническую колбу, объемом 250 см³. Добавляют 50 см³ смеси ацетонитрил:вода в соотношении 8:2, приготовленной согласно п. 8.6.1. Помещают на встряхиватель на 30 минут. После чего смеси дают отстояться. Раствор декантируют, фильтруют через неплотный бумажный фильтр. Осадок в колбе заливают 30 см³ смеси ацетонитрил:вода (8:2), приготовленной согласно п. 8.6.1. Экстрагируют в течение 15 минут на встряхивателе. Смеси дают отстояться, раствор фильтруется через неплотный бумажный фильтр. Фильтраты объединяют и переносят в круглодонную колбу объемом 250 см³. Упаривают на ротационном испарителе, при температуре не выше плюс 30 °C до водного остатка (15 - 20 см³). Водный остаток пропускают через подготовленный в соответствии с п. 8.7 картридж, со скоростью 15 - 20 капель в минуту, используя разрежение, создаваемое водоструйным насосом. После пропускания пробы картридж четыре раза по 1 см³ промывают смесью ацетонитрил:вода в соотношении 2:8, приготовленной в соответствии с п. 8.6.2. Пидифлуметофен элюируют с картриджа ацетонитрилом, 2 раза по 1 см³. Элюат собирают в круглодонную колбу объемом 50 см³. Упаривают на ротационном испарителе при температуре не выше плюс 30 °C до влажного остатка. Остаток в круглодонной колбе растворяют в 2 см³ смеси ацетонитрил:вода в соотношении 8:2, приготовленной в соответствии с п. 8.6.1. Перед хроматографированием пробу дополнительно фильтруют через мембранный фильтр.

10.3. Условия хроматографирования. Измерения выполняют при следующих режимных параметрах:

- жидкостный хроматограф с быстросканирующим ультрафиолетовым детектором, снабженный дегазатором и термостатом колонки;

- хроматографическая колонка стальная, длиной 250 мм, внутренним диаметром 4,6 мм, заполненная обращенно-фазным сорбентом с привитыми алкильными группами (C-18 или C-8) для удерживания гидрофильных соединений, зернением 5 мкм;

- рабочая длина волны: 230 нм;

- температура колонки: плюс 25 °C;

- подвижная фаза: ацетонитрил - бидистиллированная вода (75:25, по объему);

- скорость потока элюента: 1,0 см³/мин;

- объем вводимой пробы: 20 мм³;

- линейный диапазон детектирования: 1 - 20 нг.

11.1. Содержание пидифлуметофена в пробах (X, мг/кг) рассчитывают по формуле:

где V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, см³;

m - масса анализируемого образца, г;

C - концентрация пидифлуметофена, найденная по градуировочному графику в соответствии с площадью хроматографического пика, мкг/см³;

f - полнота извлечения вещества, выраженная в относительных единицах (величину полноты извлечения, приведенную в таблице 2, разделить на 100).

12.1. За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

где X₁, X₂ - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости (таблица 1), при этом .

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

13.1. Результат анализа представляют в виде:

где - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

- граница абсолютной погрешности, мг/кг.

где - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, таблица 1), %.

Если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание пидифлуметофена в пробе (зерно зерновых колосовых культур, плодовые косточковые (персик), лук, капуста, морковь) - менее 0,01 мг/кг" <3>.

--------------------------------

<3> 0,01 мг/кг - предел обнаружения пидифлуметофена в зерне зерновых колосовых культур, плодовых косточковых (персик), луке, капусте, моркови.

14.1. Организация контроля качества результатов определения осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-(1 - 6).

14.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.

Величина добавки C_д должна удовлетворять условию:

где - характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно), мг/кг, при этом:

где - граница абсолютной погрешности, мг/кг;

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, таблица 1), %.

Результат контроля процедуры К_к рассчитывают по формуле:

где , , C_д - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки, соответственно, мг/кг.

Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (К_к) с нормативом контроля (К).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию:

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (10) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (10) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

14.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости:

Расхождение между результатами измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), не должно превышать предела воспроизводимости (R):

где X₁, X₂ - результаты измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), мг/кг;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций, таблица 1), %.

1. Федеральный закон от 30 марта 1999 г. N 52-ФЗ "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения".

2. ГОСТ Р ИСО 5725-(1 - 6) "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

3. ГОСТ Р 53228 "Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания".

4. ГОСТ OIML R 111-1 "Государственная система обеспечения единства измерений".

5. ГОСТ 29227 "Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования".

6. ГОСТ 20490 "Реактивы. Калий марганцовокислый. Технические условия".

7. ГОСТ Р 52501 "Вода для лабораторного анализа. Технические условия".

8. ГОСТ 25336 "Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры".

9. ГОСТ 9737 "Посуда лабораторная стеклянная. Шлифы сферические взаимозаменяемые".

10. ГОСТ 21241 "Пинцеты медицинские. Общие технические требования и методы испытаний".

11. ГОСТ 12.1.004 "Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования".

12. ГОСТ 12.1.007 "Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности".

13. ГОСТ 12.1.018 "Система стандартов безопасности труда. Пожаровзрывобезопасность статического электричества. Общие требования".

14. ГОСТ 12.1.019 "Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты".

15. ГОСТ 12.4.009 "Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание".

16. ГОСТ 1770 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) "Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия".

17. Унифицированные правила отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов, утвержденные заместителем Главного государственного санитарного врача СССР 21.08.1979 N 2051-79.

18. "Методические указания по регистрационным испытаниям пестицидов в части биологической эффективности". Москва - 2018. 64 с.