"МУК 4.1.3902-23. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств никосульфурона в корнеплодах и ботве свеклы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 29.06.2023)

1. Разработаны ООО "Центр экопестицидных исследований" (Р.А. Стрелецкий, В.С. Горбатов, М.А. Никитина, С.В. Суетина).

2. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 29 июня 2023 г.

3. Введены впервые.

1.1. Настоящие методические указания (далее - МУК) устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (далее - ВЭЖХ) для определения остаточных количеств никосульфурона <1> в ботве и корнеплодах свеклы в диапазоне от 0,01 до 0,1 мг/кг.

--------------------------------

<1> Никосульфурон, CAS N 111991-09-4, [2-(4,6-диметоксипиримидин-2-илкарбомоил-сульфамоил)-N,N-диметилникотинамид] - пестицид, избирательный гербицид.

1.2. МУК носят рекомендательный характер.

2.1. Метод основан на определении никосульфурона с помощью ВЭЖХ с использованием ультрафиолетового детектора (далее - УФ-детектор).

Определение никосульфурона в корнеплодах и ботве свеклы проводится после его экстракции ацетонитрилом, очистки и концентрирования в системе несмешивающихся растворителей и на картриджах типа C18.

Идентификация никосульфурона проводится по времени удерживания. Концентрацию никосульфурона определяют по площадям соответствующих хроматографических пиков на хроматограммах по методу абсолютной калибровки.

В предлагаемых условиях анализа метод специфичен. Специфичность обеспечивается подбором колонки и условий хроматографирования.

При соблюдении всех условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 3.1 для соответствующих диапазонов концентраций.

4.1. При выполнении измерений и подготовке проб применяют средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы, приведенные в табл. 4.1 - 4.3.

Примечание. Допускается применение других средств измерений, не уступающих вышеуказанным по метрологическим и техническим характеристикам.

Примечание. Допускается применение других вспомогательных устройств и материалов, не уступающих вышеуказанным по метрологическим и техническим характеристикам.

Примечание. Допускается применение других реактивов и материалов, по качеству не хуже вышеуказанных.

5.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на комплекс газового хроматографа.

5.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать гигиенических нормативов <2>. Организация обучения работников безопасности труда по ГОСТ 12.0.004.

--------------------------------

<2> СанПиН 1.2.3685-21 "Гигиенические нормативы и требования к обеспечению безопасности и (или) безвредности для человека факторов среды обитания", утвержденные постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 28.01.2021 N 2 (зарегистрировано Минюстом России 29.01.2021 N 62296).

5.3. Работы с газами, находящимися в баллонах под давлением до 15 МПа (150 кгс/см²), осуществляются в соответствии с законодательством Российской Федерации <3> и ГОСТ 12.2.085. Не допускается открывать вентиль баллона, не установив в нем понижающий редуктор.

--------------------------------

<3> Приказ Ростехнадзора от 15.12.2020 N 536 "Об утверждении федеральных норм и правил в области промышленной безопасности "Правила промышленной безопасности при использовании оборудования, работающего под избыточным давлением" (зарегистрирован Минюстом России 31.12.2020, регистрационный N 61998).

6.1. К выполнению измерений и обработке их результатов допускаются специалисты, имеющие опыт работы в химической лаборатории, прошедшие обучение и владеющие техникой проведения анализа, освоившие метод анализа в процессе тренировки и уложившиеся в нормативы контроля при проведении процедуры контроля погрешности анализа.

7.1. Отбор проб производится в соответствии с методическими документами <4>.

--------------------------------

<4> Унифицированные правила отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов, утвержденные заместителем Главного государственного санитарного врача СССР 21.08.1979 N 2051-79; ГОСТ 33884 "Межгосударственный стандарт. Свекла сахарная. Технические условия", введен в действие Приказом Росстандарта от 06.12.2016 N 1957-ст.

Пробы ботвы сахарной свеклы, а также корнеплодов свеклы хранят в холодильнике в полиэтиленовых пакетах при температуре плюс (0 - 4) °C в течение суток. Для длительного хранения пробы замораживают и хранят в морозильной камере при температуре минус 18 °C.

8.1. При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха плюс (15 - 30) °C, относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе с УФ-детектором проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

9.1. Подготовка органических растворителей.

При необходимости производится дополнительная очистка растворителей общепринятыми способами. При использовании растворителей необходимой чистоты, как правило, не возникает необходимости в дополнительной очистке.

9.2. Приготовление растворов для проведения анализа.

9.2.1. Приготовление рабочих растворов

9.2.1.1. Приготовление раствора тетрабората натрия, насыщенного хлоридом натрия.

27,9 г тетрабората натрия 10-водного переносят в мерную колбу на 1000 см³, добавляют 500 - 700 см³ дистиллированной воды, перемешивают до полного растворения и доводят до метки водой. Далее 500 см³ полученного раствора помещают в бутыль объемом 1 дм³ и добавляют хлористый натрий порциями при тщательном перемешивании до выпадения стойкого осадка, после чего оставляют отстаиваться в течение 4 часов. Далее проверяют pH и в случае необходимости доводят до 9 2М раствором гидроксида натрия.

9.2.1.2. Приготовление 2М раствора гидроксида натрия в воде.

В мерную колбу объемом 1 дм³ помещают 80 грамм гидроксида натрия, приливают 500 мл дистиллированной воды, перемешивают до полного растворения и доводят до метки водой (раствор при приготовлении нагревается!).

9.2.1.3. Приготовление 0,1% уксусной кислоты в воде.

В мерную колбу объемом 1 дм³ помещают 500 см³ дистиллированной воды, добавляют 1 см³ уксусной кислоты, перемешивают и доводят до метки деионизированной водой.

9.2.2. Приготовление градуировочных растворов.

9.2.2.1. Стандартный раствор N 1 с концентрацией никосульфурона 1,0 мг/см³.

Взвешивают 10 мг никосульфурона в мерной колбе объемом 10 см³. Навеску растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом. Полученный стандартный раствор N 1 используется для приготовления стандартного раствора N 2. Стандартный раствор N 1 хранится в холодильнике в течение 14 суток.

9.2.2.2. Промежуточный раствор N 2 с концентрацией никосульфурона 10,0 мкг/см³.

Из стандартного раствора N 1 отбирают пипеткой 1 см³ и помещают в мерную колбу объемом 100 см³. Доводят объем до метки ацетонитрилом при перемешивании. Промежуточный раствор N 2 используется для хроматографического исследования и установления градуировочной характеристики. Промежуточный раствор N 2 хранят в холодильнике в течение 14 суток.

9.2.2.3. Стандартный раствор N 3 с концентрацией никосульфурона 1,0 мкг/см³.

Из стандартного раствора N 2 отбирают пипеткой 1 см³, помещают в мерную колбу объемом 10 см³ и доводят объем до метки ацетонитрилом. Стандартный раствор N 3 используется для установления градуировочной характеристики и готовится непосредственно перед использованием.

9.2.2.4. Стандартный раствор N 4 с концентрацией никосульфурона 0,5 мкг/см³.

Из стандартного раствора N 3 отбирают пипеткой 5 см³, помещают в мерную колбу объемом 10 см³ и доводят объем до метки ацетонитрилом. Стандартный раствор N 4 используется для установления градуировочной характеристики и готовится непосредственно перед использованием.

9.2.2.5. Стандартный раствор N 5 с концентрацией никосульфурона 0,2 мкг/см³.

Из стандартного раствора N 3 отбирают пипеткой 2 см³, помещают в мерную колбу объемом 10 см³ и доводят объем до метки смесью ацетонитрилом. Стандартный раствор N 5 используется для установления градуировочной характеристики и готовится непосредственно перед использованием.

9.2.2.6. Стандартный раствор N 6 с концентрацией никосульфурона 0,1 мкг/см³.

Из стандартного раствора N 5 отбирают пипеткой 5 см³, помещают в мерную колбу объемом 10 см³ и доводят объем до метки ацетонитрилом. Стандартный раствор N 6 используется для установления градуировочной характеристики и готовится непосредственно перед использованием.

9.2.2.7. Стандартные растворы никосульфурона с концентрацией по 1,0; 0,5; 0,2, 0,1 мкг/см³ для внесения в контрольные образцы и установления метрологических характеристик.

В контрольные образцы вносят 1 см³ растворов N 3 - 6 (пп. 9.2.2.3 - 9.2.2.6).

9.3. Приготовление элюентов для ВЭЖХ.

9.3.1. Приготовление 0,1% раствора уксусной кислоты в воде (Элюент А).

В мерную колбу объемом 1 дм³ помещают 500 мл деионизированной воды, добавляют 1 см³ уксусной кислоты, перемешивают и доводят до метки деионизированной водой.

9.3.2. Приготовление 0,1% раствора уксусной кислоты в ацетонитриле (Элюент Б).

В мерную колбу объемом 1 дм³ помещают 500 мл ацетонитрила (ВЭЖХ), добавляют 1 см³ уксусной кислоты, перемешивают и доводят ацетонитрилом до метки.

9.4. Установление градуировочной характеристики.

Градуировочную характеристику, выражающую отношение поглощения при длине волны 260 нм от концентрации никосульфурона в растворе (мкг/см³), устанавливают путем определения соотношения площади пиков, отвечающих идентифицируемому компоненту, и концентрации аналитического стандарта по 4-м растворам для установления градуировочной характеристики.

Градуировочную зависимость для определения никосульфурона в корнеплодах и ботве свеклы устанавливают по 4-м растворам для градуировки с концентрацией 0,1, 0,2, 0,5 и 1,0 мкг/см³, приготовленным согласно пп. 9.2.2.3 - 9.2.2.6.

В инжектор хроматографа вводят по 20 мм³ каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 10.5. Осуществляют не менее 5-ти параллельных измерений.

9.5. Подготовка концентрирующих картриджей типа C18 для очистки экстрактов и проверка хроматографического поведения никосульфурона на них.

9.5.1. Подготовка концентрирующих картриджей для очистки экстракта.

Все процедуры происходят с использованием вакуума, скорость потока растворов через картридж не должна превышать 1 капля/сек.

Картридж C18 устанавливают в манифолд.

Кондиционирование: концентрирующий картридж промывают 5 см³ ацетонитрила, затем 5 см³ дистиллированной воды. Элюаты отбрасывают.

Не допускать высыхания поверхности картриджа.

9.5.2. Проверка хроматографического поведения никосульфурона на концентрирующих картриджах C18.

В концентратор объемом 50 см³ вносят 1 см³ стандартного раствора никосульфурона в ацетонитриле с концентрацией 1,0 мкг/см³ и упаривают его досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C.

В концентратор помещают 5 см³ 0,1% уксусной кислоты в воде (п. 9.2.1.3), обрабатывают концентратор 1 минуту в ультразвуковой ванне, обмывают стенки концентратора и вносят раствор на подготовленный картридж. Процедуру обработки концентратора повторяют еще раз 10 см³ и вторую порцию раствора также наносят на тот же картридж. Элюат отбрасывают.

На картридж вносят 6 см³ ацетонитрила (ВЭЖХ) и собирают элюат порциями по 2 см³ в отдельные концентраторы объемом 50 см³ и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C.

Сухой остаток каждой фракции растворяют в 1 см³ ацетонитрила (ВЭЖХ), обрабатывая колбы в ультразвуковой ванне в течение 30 секунд, и хроматографируют.

Определяют фракции, содержащие никосульфурон, полноту смывания с картриджа и необходимый объем элюента.

Изучение поведения никосульфурона на концентрирующих картриджах типа C18 проводят каждый раз при отработке методики или поступлении новой партии картриджей.

9.6. Подготовка и кондиционирование колонки для жидкостной хроматографии.

Хроматографическую колонку с предколонкой устанавливают в термостате хроматографа и стабилизируют при температуре плюс 25 °C 3 - 4 часа.

9.7. Контроль стабильности градуировочной характеристики.

Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

Контроль стабильности градуировочной характеристики для никосульфурона проводят при смене основных градуировочных растворов N 1 и 2 каждые 14 суток.

При контроле стабильности градуировочной характеристики проводят измерения не менее трех образцов концентраций для градуировки, содержание никосульфурона в которых должно охватывать весь диапазон концентраций градуировочных характеристик.

Градуировочная характеристика считается стабильной, если для каждого из используемых для контроля градуировочных растворов сохраняется соотношение (1):

где X - концентрация никосульфурона контрольного измерения, мкг/см³;

C - известная концентрация градуировочного раствора никосульфурона в ацетонитриле, взятая для контроля стабильности градуировочной характеристики, мкг/см³;

10 - погрешность градуировочной характеристики, %.

Если величина расхождения (A) превышает указанные значения, делают вывод о невозможности применения градуировочной характеристики для дальнейших измерений. В этом случае выясняют и устраняют причины нестабильности градуировочной характеристики и повторяют контроль ее стабильности с использованием других градуировочных растворов никосульфурона, предусмотренных методикой измерения. При повторном обнаружении нестабильности градуировочной характеристики определяют ее заново согласно п. 9.4.

10.1. Экстракция.

Образец корнеплодов свеклы или ботвы свеклы массой 10 г помещают в коническую плоскодонную колбу на 250 см³, добавляют 60 см³ ацетонитрила (хч) и помещают на 15 минут на аппарат для встряхивания проб и фильтруют при помощи воронки Бюхнера через фильтр красная лента. Экстракцию повторяют еще раз, переливают экстракт вместе с пробой (не отстаивая) в воронку Бюхнера, и фильтруют, объединяя экстракты. Фильтр в воронке дополнительно промывают 15 см³ ацетонитрила, также объединяя фильтрат с остальным экстрактом.

10.2. Подготовка экстракта для определения никосульфурона.

Полученный экстракт (п. 10.1) упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре водяной бани 40 °C до объема 50 см³.

10.3. Очистка полученного экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей.

Колбу с экстрактом (п. 10.2) обрабатывают в ультразвуковой ванне в течение 30 секунд и переносят экстракт в делительную воронку объемом 250 см³. В колбу-концентратор помещают 80 см³ раствора тетрабората натрия, насыщенного хлоридом натрия (п. 9.2.1.1), обрабатывают в ультразвуковой ванне в течение 30 сек и переносят в ту же воронку. Экстракцию производят интенсивного встряхивания в течение 2 минут. Жидкости в воронке дают расслоиться и отбирают нижний слой в химический стакан объемом 200 см³. Экстракцию повторяют еще раз 40 см³ раствора тетрабората натрия, насыщенного хлоридом натрия (п. 9.2.1.1), экстракты объединяют. Далее подкисляют водный экстракт до pH = 1 соляной кислотой, переносят в делительную воронку объемом 250 см³, приливают 30 см³ хлористого метилена и встряхивают в течение 2 минут. После расслоения нижний органический слой собирают в колбу-концентратор объемом 250 см³. Экстракцию повторяют еще дважды по той же схеме, экстракты объединяют и упаривают на ротационном вакуумном испарителе досуха при температуре водяной бани плюс 40 °C.

10.4. Очистка полученного экстракта при помощи твердофазной экстракции.

К экстракту в концентраторе (п. 10.3) приливают 5 см³ 0,1% уксусной кислоты в воде (п. 9.2.1.3), обрабатывают концентратор 1 минуту в ультразвуковой ванне, обмывают стенки концентратора и вносят раствор на подготовленный картридж. Процедуру обработки концентратора повторяют еще раз 10 см³ 0,1% уксусной кислоты в воде (п. 9.2.1.3) и вторую порцию раствора также наносят на тот же картридж. Элюат отбрасывают, картридж обсушивают.

На картридж вносят 2 см³ ацетонитрила (ВЭЖХ) и собирают элюат в концентратор объемом 50 см³ и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C. Сухой остаток растворяют в 1 см³ ацетонитрила для ВЭЖХ, обрабатывают концентратор в ультразвуковой ванне в течение 30 секунд и переносят экстракт в хроматографическую виалу объемом 2 см³ для последующего хроматографирования.

10.5. Условия хроматографирования приведены в табл. 10.1.

11.1. Для обработки результатов хроматографического анализа используется компьютерное программное обеспечение химического анализа, которое входит в хроматографическую систему (2):

где X - содержание никосульфурона в пробе, мг/кг;

C - концентрация никосульфурона в экстракте, мкг/см³ (рассчитана при помощи программного обеспечения хроматографической системы);

m - масса анализируемого образца, г.

Результат округляют до четвертого знака после запятой.

Альтернативная обработка результатов.

Содержание никосульфурона в пробах рассчитывают по формуле (3):

где X - содержание никосульфурона в пробе, мг/кг;

S_ст - высота (площадь) пика стандарта, е.о.п. x сек;

S_пр - высота (площадь) пика образца, е.о.п. x сек;

A - концентрация стандартного раствора, мкг/см³;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, см³;

m - масса анализируемого образца, г.

Результат округляют до четвертого знака после запятой.

12.1. За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (4):

где X₁, X₂ - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости (таблица 3.1), при этом .

При невыполнении условия (4) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

13.1. Результат анализа представляют в виде:

где - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

- граница абсолютной погрешности, мг/кг:

где - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, таблица 3.1), %.

В случае если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

14.1. Контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-(1 - 6). Периодичность и формы контроля определяются руководством по качеству.

1. Федеральный закон от 30.03.1999 N 52-ФЗ "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения".

2. СанПиН 1.2.3685-21 "Гигиенические нормативы и требования к обеспечению безопасности и (или) безвредности для человека факторов среды обитания".

3. ГОСТ Р 53228 "Национальный стандарт Российской Федерации. Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания".

4. ГОСТ 1770 "Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия".

5. ГОСТ 29227 "Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования".

6. ГОСТ 1770 "Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия".

7. ГОСТ 25336 "Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры".

8. ГОСТ 12026 "Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия".

9. ГОСТ 8682 "Посуда лабораторная стеклянная. Шлифы конические взаимозаменяемые".

10. ГОСТ 9147 "Посуда и оборудование лабораторные фарфоровые. Технические условия".

11. ГОСТ 34037 "Упаковка стеклянная для химических реактивов и особо чистых химических веществ. Общие технические условия".

12. ГОСТ Р 58144 "Вода дистиллированная. Технические условия".

13. ГОСТ Р 52501 "Вода для лабораторного анализа. Технические условия".

14. ГОСТ 61 "Реактивы. Кислота уксусная. Технические условия".

15. ГОСТ 4233 "Реактивы. Натрий хлористый. Технические условия".

16. ГОСТ 2493 "Реактивы. Калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный. Технические условия".

17. ГОСТ 3118 "Реактивы. Кислота соляная. Технические условия".

18. ГОСТ 12.1.007 "Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности".

19. ГОСТ 12.1.019 "Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты".

20. ГОСТ 12.1.004 "Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования".

21. ГОСТ 12.0.004 "Система стандартов безопасности труда. Организация обучения безопасности труда. Общие положения".

22. ГОСТ 33884 "Свекла сахарная. Технические условия".