"МУК 4.1.3767-22. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств 6-бензиламинопурина в воде, почве, яблоках и соке яблок методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 30.05.2022)

1. Разработаны Федеральным государственным бюджетным образовательным учреждением высшего образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (Р.А. Стрелецкий, В.С. Горбатов).

2. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 30 мая 2022 г.

3. Введены впервые.

1.1. Настоящие методические указания (далее - МУК) устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (далее - ВЭЖХ) для определения остаточных количества 6-бензиламинопурина в воде в диапазоне 0,001 - 0,01 мг/л и в почве, яблоках, соке яблок в диапазоне 0,01 - 0,1 мг/кг.

1.2. МУК предназначены для органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, осуществляющих контроль качества и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов, а также могут быть использованы организациями, аккредитованными в установленном порядке на проведение исследований продовольственного сырья, пищевых продуктов, воды и почвы.

1.3. МУК носят рекомендательный характер.

2.1. 6-бензиламинопурин (бензиладенин, 6-БА, 6-БАП) - N-(фенилметил)1N-пурин-6-амин <1>. Синтетический цитокинин. Брутто формула C₁₂H₁₁N₅. Молекулярная масса 225,25.

--------------------------------

<1> В соответствии с Международным союзом теоретической и прикладной химии (ИЮПАК, англ. International Union of Pure and Applied Chemistry, IUPAC).

2.2. Физические и химические свойства. Белый порошок без запаха. Температура кипения плюс 387 °C. Давление паров 6,0 x 10^-0,4 МПа (плюс 25 °C). Растворимость в воде 64,5 мг/л (плюс 20 °C). Коэффициент распределение н-октанол - вода K_owlogP = 2,16 (плюс 20 °C). Растворим в органических растворителях (мг/дм³, при плюс 20 °C): ацетон - 1130; этилацетат - 493; метанол - 5820. Гидролитически стабилен (pH 7, плюс 20 °C).

2.3. Краткая токсикологическая характеристика. Острая пероральная токсичность (LD₅₀) для крыс - 1584 мг/кг; острая дермальная токсичность (LD₅₀) для крыс - > 2000 мг/кг; острая ингаляционная токсичность (LK₅₀) 4 ч, для крыс - > 5 мг/кг.

2.4. Область применения. 6-бензиламинопурин - регулятор роста растений. Стимулирует биосинтез белка, ускоряет скорость деления клеток.

3.1. При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в таблице 3.1 для соответствующих диапазонов концентраций.

3.2. Полнота извлечения веществ, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для всего диапазона измерений (n = 20) приведены в таблице 3.2.

4.1. Метод основан на определении 6-бензиламинопурина с помощью ВЭЖХ с использованием ультрафиолетового детектора (ВЭЖХ-УФ).

4.2. Определение 6-бензиламинопурина в воде проводится после его экстракции хлористым метиленом при pH = 7. Определение 6-бензиламинопурина в почве проводится после его экстракции смесью водного раствора ацетата аммония с метанолом, очистки и концентрирования в системе несмешивающихся растворителей, очистки на концентрирующих патронах C16 и дополнительного концентрирования. Определение 6-бензиламинопурина в яблоках проводится после его экстракции смесью водного фосфатного буфера с ацетоном, очистки и концентрирования в системе несмешивающихся растворителей, очистки на концентрирующих патронах C16 и дополнительного концентрирования. Определение 6-бензиламинопурина в соке яблок проводится после его экстракции этилацетатом при pH = 7, очистки на концентрирующих патронах C16 и дополнительного концентрирования. Идентификация 6-бензиламинопурина проводится по времени удерживания. Концентрацию 6-бензиламинопурина определяют по площадям соответствующих хроматографических пиков на хроматограммах по методу абсолютной калибровки. В предлагаемых условиях анализа метод специфичен. Специфичность обеспечивается подбором колонки и условий хроматографирования.

4.3. Нижний предел измерения в анализируемом объеме пробы для воды, почвы, яблок и сока яблок 1,0 нг, средняя полнота извлечения: для воды 96,7%, почвы 93,3%, яблок 92,2%, сока яблок 93,7%.

5.1. При выполнении измерений и подготовке проб применяют средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы, приведенные в табл. 5.1 - 5.3.

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.

Примечание. Допускается использование вспомогательных средств измерений, устройств и материалов с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

6.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на комплекс жидкостного хроматографа.

6.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004.

6.3. К выполнению измерений и обработке их результатов допускаются специалисты, имеющие опыт работы в химической лаборатории, прошедшие обучение и владеющие техникой проведения анализа, освоившие метод анализа в процессе тренировки и уложившиеся в нормативы контроля при проведении процедуры контроля погрешности анализа.

7.1. При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80% и нормальном атмосферном давлении;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе с УФ-детектором проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

8.1. Выполнению измерений предшествуют следующие операции: очистка растворителей (при необходимости), приготовление растворов, кондиционирование хроматографической колонки, установление градуировочных характеристик, отбор проб.

8.1. Подготовка органических растворителей

8.1.1. Очистка ацетонитрила

Ацетонитрил, содержащий воду, предварительно осушают, добавляя в него гранулированный безводный хлористый кальций из расчета не менее 100 г/дм³. Выдерживают его над осушителем в течение 5 - 6 часов. Затем ацетонитрил сливают с осушителя в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 см³ аппарата для перегонки растворителей. Ацетонитрил перегоняют при температуре плюс 81,5 °C, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше плюс 81,5 °C, отбрасывают.

8.1.2. Приготовление бидистиллированной воды

Дистиллированную воду помещают в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 см³ от аппарата для перегонки растворителей, добавляют к ней марганцовокислый калий из расчета 1 г/дм³ и кипятят в течение 6 часов. Собирают фракции, отогнанные при температуре плюс 100,0 °C, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше плюс 100,0 °C, отбрасывают.

8.1.5. Очистка хлористого метилена

Хлористый метилен промывают равным объемом 5% раствора натрия углекислого (безводного), осушают, добавляя в него гранулированный безводный хлористый кальций из расчета не менее 100 г/дм³. Выдерживают его над осушителем в течение 12 - 24 часов. Затем хлористый метилен сливают с осушителя в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 см³ аппарата для перегонки растворителей. Хлористый метилен перегоняют при температуре 40,0 °C, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 40,0 °C, отбрасывают.

8.1.6. Очистка ацетона

Ацетон перегоняют над перманганатом калия и прокаленным карбонатом калия (на 1 дм³ ацетона 10 г KMnO₄ и 2 г K₂CO₃).

8.2. Приготовление растворов для проведения анализа

8.2.1. Приготовление рабочих растворов

8.2.1.1. Приготовление 5% раствора натрия углекислого

50 г гидрокарбоната натрия переносят в мерную колбу на 1000 см³, добавляют 200 - 300 см³ дистиллированной воды, перемешивают до полного растворения и доводят водой объем в колбе до метки.

8.2.1.2. Приготовление 0,5 М ацетата аммония

В мерную колбу объемом 1 дм³ помещают 38,54 г ацетата аммония, добавляют 200 - 300 см³ дистиллированной воды, перемешивают до полного растворения и доводят водой объем в колбе до метки.

8.2.1.3. Приготовление 5 М гидроксида натрия

В термостойкий стакан объемом 1 дм³ помещают 200 г гидроксида натрия, добавляют 500 см³ дистиллированной воды, перемешивают до полного растворения, переливают в мерную колбу объемом 1 дм³ и доводят водой объем в колбе до метки.

8.2.1.4. Приготовление 0,05 М водного раствора гидрофосфата натрия

17,91 г гидрофосфата натрия переносят в мерную колбу на 1000 см³, добавляют 200 - 300 см³ дистиллированной воды, перемешивают до полного растворения и доводят водой объем в колбе до метки.

8.2.1.5. Приготовление 0,05 М водного раствора дигидрофосфата натрия

7,8 г дигидрофосфата натрия переносят в мерную колбу на 1000 см³, добавляют 200 - 300 см³ дистиллированной воды, перемешивают до полного растворения и доводят водой объем в колбе до метки.

8.2.1.6. Приготовление 0,05 М фосфатного буфера

В мерную колбу объемом 1 дм³ помещают 500 см³ дистиллированной воды, прибавляют 30,5 см³ 0,05 М раствора гидрофосфата натрия (п. 8.2.1.4) и 19,5 см³ 0,5 М раствора дигидрофосфата натрия (п. 8.2.1.5), перемешивают и доводят до метки водой.

8.2.1.7. Приготовление 5 М раствора соляной кислоты

Мерным цилиндром отбирают 205 см³ концентрированной соляной кислоты и осторожно переносят в мерную колбу на 500 см³, куда предварительно наливают около 100 см³ дистиллированной воды. Затем раствор перемешивают и после охлаждения доводят водой объем в колбе до метки (при приготовлении раствора соблюдать осторожность и работать под тягой).

8.2.1.8. Приготовление 80% раствора метанола в 0,5 М ацетате аммония

В мерную колбу объемом 1 дм³ помещают 500 см³ метанола, прибавляют 200 см³ 0,5 М ацетата аммония (п. 8.2.1.2), перемешивают, объем доводят до метки метанолом.

8.2.1.9. Приготовление 80% раствора ацетона в фосфатном буфере

В мерную колбу объемом 1 дм³ помещают 500 см³ ацетона, прибавляют 200 см³ 0,05 М фосфатного буфера (п. 8.2.1.6), перемешивают, объем доводят до метки ацетоном.

8.2.1.10. Приготовление 50% раствора метанола в фосфатном буфере

В мерную колбу объемом 1 дм³ помещают 500 см³ метанола, доводят объем до метки 0,05 М фосфатным буфером (п. 8.2.1.6) и перемешивают.

8.2.1.11. Приготовление 20% раствора метанола в фосфатном буфере

В мерную колбу объемом 1 дм³ помещают 200 см³ метанола, доводят объем до метки 0,05 М фосфатным буфером (п. 8.2.1.6) и перемешивают.

8.2.2. Приготовление градуировочных растворов

8.2.2.1. Стандартный раствор N 1 с концентрацией 6-бензиламинопурина 1,0 мг/см³

Взвешивают 10 мг 6-бензиламинопурина в мерной колбе объемом 10 см³. Навеску растворяют в ацетоне и доводят объем до метки ацетоном. Полученный стандартный раствор N 1 используется для приготовления стандартных раствора N 2. Стандартный раствор N 1 хранится в холодильнике в течение 6 месяцев.

8.2.2.2. Промежуточный раствор N 2 с концентрацией 6-бензиламинопурина 10,0 мкг/см³

Из стандартного раствора N 1 отбирают пипеткой 1 см³ и помещают в мерную колбу объемом 100 см³. Доводят объем до метки ацетоном при перемешивании. Промежуточный раствор N 2 используется для для хроматографического исследования и установления градуировочной характеристики. Промежуточный раствор N 2 хранят в холодильнике не более 2 месяцев.

8.2.2.3. Стандартный раствор N 3 с концентрацией 6-бензиламинопурина 1,0 мкг/см³

Из стандартного раствора N 2 отбирают пипеткой 1 см³, помещают в мерную колбу объемом 10 см³ и доводят объем до метки ацетоном. Стандартный раствор N 3 используется для установления градуировочной характеристики и хранится в холодильнике не более 30 суток.

8.2.2.4. Стандартный раствор N 4 с концентрацией 6-бензиламинопурина 0,5 мкг/см³

Из стандартного раствора N 3 отбирают пипеткой 5 см³, помещают в мерную колбу объемом 10 см³ и доводят объем до метки ацетоном. Стандартный раствор N 4 используется для установления градуировочной характеристики и хранится в холодильнике не более 30 суток.

8.2.2.5. Стандартный раствор N 5 с концентрацией 6-бензиламинопурина 0,2 мкг/см³

Из стандартного раствора N 3 отбирают пипеткой 2 см³, помещают в мерную колбу объемом 10 см³ и доводят объем до метки смесью ацетоном. Стандартный раствор N 5 используется для установления градуировочной характеристики и хранится в холодильнике не более 30 суток.

8.2.2.6. Стандартный раствор N 6 с концентрацией 6-бензиламинопурина 0,08 мкг/см³

Из стандартного раствора N 5 отбирают пипеткой 4 см³, помещают в мерную колбу объемом 10 см³ и доводят объем до метки ацетоном. Стандартный раствор N 6 используется для установления градуировочной характеристики и хранится в холодильнике не более 30 суток.

8.2.2.7 Стандартные растворы 6-бензиламинопурина с концентрацией по 1,0; 0,5; 0,2, 0,1 мкг/см³ для внесения в контрольные образцы и установления метрологических характеристик

Методом последовательного разведения ацетоном стандартного раствора N 2 готовят растворы, содержащие по 1,0; 0,5; 0,2; 0,1 мкг/см³, и вносят 1 см³ этих растворов в контрольные образцы.

8.3. Установление градуировочной характеристики

Градуировочную характеристику, выражающую отношение поглощения при длине волны 268 нм от концентрации 6-бензиламинопурина в растворе (мкг/см³), устанавливают путем определения соотношения площади пиков, отвечающих идентифицируемому компоненту, и концентрации аналитического стандарта по 4 растворам для установления градуировочной характеристики.

Градуировочную зависимость для определения 6-бензиламинопурина в воде, почве, яблоках и соке яблок устанавливают по 4 растворам для градуировки с концентрацией 0,08, 0,2, 0,5 и 1,0 мкг/см³, приготовленным согласно п.п. 8.2.2.3 - 8.2.2.6.

В инжектор хроматографа вводят по 10 мм³ каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 10.5. Осуществляют не менее 5 параллельных измерений.

При контроле стабильности градуировочной характеристики проводят измерения не менее двух образцов растворов для градуировки, содержание 6-бензиламинопурина в которых должно охватывать весь диапазон концентраций от 0,08 до 1,0 мкг/см³.

Градуировочная характеристика считается стабильной, если для каждого из используемого для контроля градуировочного раствора сохраняется соотношение:

где X - концентрация 6-бензиламинопурина в пробе при контрольном измерении, мкг/см³;

C - известная концентрация градуировочного раствора 6-бензиламинопурина, взятая для контроля стабильности градуировочной характеристики, мкг/см³;

B - норматив контроля погрешности градуировочной характеристики, % (B = 5% при P = 0,95).

8.4. Подготовка концентрирующих патронов типа C16 для очистки экстрактов и проверка хроматографического поведения 6-бензиламинопурина на них

8.4.1. Подготовка концентрирующих патронов для очистки экстракта

Все процедуры происходят с использованием вакуума, скорость потока растворов через патрон не должна превышать 1 капля/сек.

Патрон C16 устанавливают в манифолд.

Кондиционирование: концентрирующий патрон промывают 5 см³ метанола, затем 5 см³ фосфатного буфера (п. 8.2.1.6). Элюаты отбрасывают.

Высыхание поверхности патрона не допускается.

8.4.2. Проверка хроматографического поведения 6-бензиламинопурина на концентрирующих патронах C16

В концентратор объемом 100 см³ вносят 1 см³ стандартного раствора 6-бензиламинопурина в ацетонитриле с концентрацией 1,0 мкг/см³ и упаривают его досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 60 °C.

В концентратор помещают 10 см³ фосфатного буфера (п. 8.2.1.6), обрабатывают концентратор 2 минуты в ультразвуковой ванне, обмывают стенки концентратора и вносят раствор на подготовленный патрон. Процедуру обработки концентратора повторяют еще раз тем же объемом буфера и вторую порцию раствора также наносят на тот же патрон. Пропускают элюат, собирая его в отдельный концентратор объемом 100 см³ и упаривая досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 60 °C.

На патрон вносят 5 см³ 20% раствора метанола в буфере (п. 8.2.1.11) и собирают элюат в отдельный концентратор объемом 100 см³, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 60 °C.

После этого на патрон вносят 10 см³ 50% метанола в буфере (п. 8.2.1.10), собирают элюат в отдельные концентраторы объемом 50 см³ порциями по 2 см³, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 60 °C.

Сухой остаток каждой фракции растворяют в 1 см³ ацетона, обрабатывая колбы в ультразвуковой ванне в течение 2 минут, и хроматографируют.

Определяют фракции, содержащие 6-бензиламинопурина, полноту смывания с патрона и необходимый объем элюента.

Изучение поведения 6-бензиламинопурина на концентрирующих патронах типа C16 проводят каждый раз при отработке методики или поступлении новой партии патронов.

8.5. Подготовка и кондиционирование колонки для жидкостной хроматографии

Хроматографическую колонку с предколонкой устанавливают в термостате хроматографа и стабилизируют при температуре 25 °C 3 - 4 часа.

9.1. Отбор проб производится в соответствии с документами <2>.

--------------------------------

<2> Унифицированные правила отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов, утвержденные Минздравом СССР 21.08.1979 N 2051-79; ГОСТ 31861 "Вода. Общие требования к отбору проб"; ГОСТ 17.4.3.01 "Охрана природы. Почвы. Общие требования к отбору проб"; ГОСТ Р 58595 "Почвы. Отбор проб"; ГОСТ 27572 "Яблоки свежие для промышленной переработки. Технические условия".

9.2. Пробы воды хранят в стеклянной герметично закрытой таре в холодильнике при температуре плюс 4 °C не более 10 суток.

9.3. Для длительного хранения проб почвы, почву подсушивают при комнатной температуре в отсутствие прямого солнечного света. Сухие почвенные образцы могут храниться в темной таре в течение года. Перед анализом сухую почву просеивают через сито с отверстиями диаметром 1 мм.

9.4. Пробы яблок хранят в холодильнике в полиэтиленовых пакетах при температуре от 0 до плюс 4 °C не более суток. Для длительного хранения пробы замораживают и хранят в морозильной камере при температуре минус 18 °C до 2 лет. Перед анализом яблоки размораживают и измельчают на терке. Пробы яблочного сока хранят до анализа в морозильной камере при температуре не выше минус 18 °C в течение месяца, в холодильнике при температуре 0 до плюс 4 °C в стеклянной таре с притертой пробкой в течение недели.

10.1. Вода

10.1.1. Экстракция

Пробу воды объемом 100 см³ помещают в делительную воронку объемом 500 см³. Доводят до pH = 7 при помощи 5 М гидроксида натрия (п. 8.2.1.3) или 5 М соляной кислоты (п. 8.2.1.7). 6-бензиламинопурин экстрагируют тремя порциями хлористого метилена объемом по 20 см³ каждая, встряхивая делительную воронку каждый раз по 2 минуты. После полного разделения фаз в делительной воронке нижний слой (хлористый метилен) собирают в концентратор объемом 100 см³. Полученный экстракт упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре водяной бани плюс 30 °C. Сухой остаток растворяют в 1 см³ ацетона, обрабатывая в ультразвуковой ванне в течение 2 минут, после чего пробу переносят в виалу объемом 2 см³ для автоматического дозатора проб и 10 мм³ вводят в хроматограф.

10.2. Почва

10.2.1. Экстракция

Образец почвы массой 10 г помещают в коническую плоскодонную колбу на 250 см³, добавляют 40 см³ смеси метанола и 0,5 М водного раствора ацетата аммония (п. 8.2.1.8) и помещают на 15 минут на аппарат для встряхивания проб и затем на 15 минут в ультразвуковую ванну. Дают отстояться 3 минуты, сливают супернатант в центрифужную пробирку на 50 см³ и центрифугируют в течение 10 минут при скорости 5000 оборотов в минуту. Супернатант фильтруют через фильтр 0,45 микрон при помощи медицинского шприца объемом 50 см³ в концентратор объемом 250 см³. Экстракцию повторяют еще раз, переливают экстракт вместе с пробой (не отстаивая) в центрифужную пробирку на 50 см³, центрифугируют, фильтруют и объединяют экстракты.

10.2.2. Подготовка экстракта для определения 6-бензиламинопурина

Полученный экстракт (п. 10.2.1) упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре водяной бани плюс 45 °C до полного улетучивания метанола.

10.2.3. Очистка полученного экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей

К водному остатку (п. 10.2.2) добавляют 10 см³ 0,05 М фосфатного буфера (п. 8.2.1.6), обрабатывают концентратор в ультразвуковой ванне в течение 2 минут и переносят экстракт в делительную воронку объемом 100 см³. Экстракцию производят 30 см³ этилацетата при помощи интенсивного встряхивания в течение 2 минут. Жидкости в воронке дают расслоиться и отбирают верхний слой в колбу концентратор объемом 100 см³. Экстракцию повторяют еще дважды, экстракты объединяют. Экстракт отгоняют на ротационном вакуумном испарителе досуха при температуре водяной бани 30 °C.

10.2.4. Очистка полученного экстракта при помощи твердофазной экстракции

К экстракту в концентраторе (п. 10.2.3) приливают 10 см³ фосфатного буфера (п. 8.2.1.6), обрабатывают в ультразвуковой ванне в течение 2 минут и переносят в лабораторный стакан объемом 25 см³. Процедуру переноса повторяют еще раз тем же объемом буфера, вторую порцию экстракта объединяют с первой и наносят на подготовленный патрон C16. Процедуру переноса повторяют еще раз тем же объемом буфера и вторую порцию раствора объединяют с первой. Далее патрон промывают 5 см³ 20% раствора метанола в фосфатном буфере (п. 8.2.1.11). Затем через патрон пропускают 10 см³ 50% раствора метанола в фосфатном буфере (п. 8.2.1.10), отбрасывая первые 2 см³ и собирая остальные 8 см³ в остродонную колбу объемом 50 см³. Для регенерации патрона с целью повторного использования его промывают 10 см³ метанола.

10.2.5. Дополнительное концентрирование и очистка экстракта

Экстракт (п. 10.2.4) отгоняют на ротационном вакуумном испарителе при плюс 50 °C до улетучивания метанола. К водному остатку приливают 10 см³ фосфатного буфера (п. 8.2.1.6), обрабатывают в ультразвуковой ванне в течение 2 мин и помещают в делительную воронку объемом 50 см³. Далее в отгонную колбу приливают еще 5 см³ фосфатного буфера (п. 8.2.1.6), повторяют обработку в ультразвуковой ванне и присоединяют к экстракту в воронке. Затем в воронку приливают 20 см³ этилацетата и производят экстракцию интенсивным встряхиванием в течение 2 мин. Дают фазам расслоиться и отбирают верхний органический слой в остродонную колбу объемом 50 см³. Экстракцию повторяют еще раз, экстракты объединяют. Далее экстракт отгоняют на ротационном вакуумном испарителе досуха при температуре водяной бани плюс 30 °C. Затем в колбу добавляют 1 см³ ацетона и обрабатывают в ультразвуковой ванне в течение 2 мин.

После этого экстракт переносится в хроматографическую виалу объемом 2 см³ для автоматического дозатора проб и 10 мм³ вводят в хроматограф.

10.3. Яблоки

10.3.1. Экстракция

Образец измельченных яблок массой 10 г помещают в плоскодонную колбу объемом 250 см³, прибавляют 40 см³ раствора 80% ацетона в фосфатном буфере (п. 8.2.1.9) и помещают на 30 минут на аппарат для встряхивания проб. Экстракт отстаивают в течение 3 минут и фильтруют надосадочную жидкость через фильтр "красная лента" в колбу для концентрирования объемом 250 см³. Экстракцию повторяют еще раз, экстракты объединяют.

10.3.2. Подготовка экстракта для определения 6-бензиламинопурина

Полученный экстракт (п. 10.3.1) упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре водяной бани плюс 45 °C до полного улетучивания ацетона.

10.3.3. Очистка полученного экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей

Экстракт (п. 10.3.3) подготавливается согласно п. 10.2.3.

10.3.4. Очистка полученного экстракта при помощи твердофазной экстракции

Экстракт (п. 10.3.3) подготавливается согласно п. 10.2.4.

10.3.5. Дополнительное концентрирование и очистка экстракта

Экстракт (п. 10.3.4) подготавливается согласно п. 10.2.5.

10.4. Сок яблок

10.4.1. Экстракция

Образец сока массой 20 граммов помещают в делительную воронку объемом 125 см³. Доводят значение pH до 7 при помощи 5 М гидроксида натрия (п. 8.2.1.3). Затем в воронку приливают 20 см³ этилацетата и производят экстракцию интенсивным встряхиванием в течение 2 мин. Дают фазам расслоиться и отбирают верхний органический слой в остродонную колбу объемом 50 см³. Экстракцию повторяют еще раз, экстракты объединяют. Далее экстракт отгоняют на ротационном вакуумном испарителе досуха при температуре водяной бани плюс 30 °C.

10.4.2. Подготовка экстракта для определения 6-бензиламинопурина

Полученный экстракт (п. 10.4.1) упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре водяной бани плюс 30 °C.

10.4.3. Очистка полученного экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей

Экстракт (п. 10.4.2) подготавливается согласно п. 10.2.3.

10.4.4. Очистка полученного экстракта при помощи твердофазной экстракции

Экстракт (п. 10.4.3) подготавливается согласно п. 10.2.4.

10.4.5. Дополнительное концентрирование и очистка экстракта

Экстракт (п. 10.4.4) подготавливается согласно п. 10.2.5, к сухому остатку добавляют 2 см³ ацетона и обрабатывают в ультразвуковой ванне в течение 2 мин. После этого экстракт переносится в хроматографическую виалу объемом 2 см³ для автоматического дозатора проб и 10 мм³ вводят в хроматограф.

10.5. Условия хроматографирования

Режим хроматографа:

- температура колонки: плюс 25 °C;

- подвижная фаза: вода - ацетонитрил в градиентном режиме при постоянной скорости потока 1 см³/мин. Градиент потока элюента: 0 - 5 мин - 80:20; к 15 мин - 0:100; 15 - 17 мин - 0:100;

- время стабилизации хроматографической системы после анализа пробы - 5 мин (общее время анализа 22 мин);

- объем вводимой пробы: 10 мм³;

- длина волны детектирования: 268 нм;

- линейный диапазон детектирования сохраняется в пределах 0,8 - 10 нг.

11.1. Для обработки результатов хроматографического анализа используется компьютерное программное обеспечение химического анализа, которое входит в хроматографическую систему.

где X - содержание 6-бензиламинопурина в пробе, мг/кг (мг/л);

C - концентрация 6-бензиламинопурина в экстракте, мкг/см³ (рассчитана при помощи программного обеспечения хроматографической системы);

V - объем экстракта;

m - масса (объем) анализируемого образца, г (см³).

Результат округляют до четвертого знака после запятой.

11.2. Альтернативная обработка результатов

Содержание 6-бензиламинопурина в пробах рассчитывают по формуле:

где X - содержание 6-бензиламинопурина в пробе, мг/кг;

S_ст - высота (площадь) пика стандарта, е.о.п. x сек;

S_пр - высота (площадь) пика образца, е.о.п. x сек;

A - концентрация стандартного раствора, мкг/см³;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, см³;

m - масса анализируемого образца, г.

Результат округляют до четвертого знака после запятой.

12.1. Результат анализа представляют в виде:

где - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

- граница абсолютной погрешности, мг/кг;

- граница относительной погрешности методики (показатель точности по диапазону концентраций, табл. 3.1), %.

Результат измерений должен иметь тот же десятичный разряд, что и погрешность.

В случае если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"При определении остаточного количества 6-бензиламинопурина в воде - содержание вещества в пробе менее 0,001 мг/л" <3>;

"При определении остаточного количества 6-бензиламинопурина в почве, яблоках и соке яблок - содержание вещества в пробе менее 0,01 мг/кг" <4>.

--------------------------------

<3> 0,001 мг/кг - предел обнаружения определяемой концентрации 6-бензиламинопурина в воде.

<4> 0,01 мг/кг - предел обнаружения определяемой концентрации 6-бензиламинопурина в почве, яблоках и соке яблок.

13.1. Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений, а также контроль стабильности градуировочной характеристики осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1 - 6.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.

Величина добавки C_д должна удовлетворять условию:

где - характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой), мг/м³.

Допустимо характеристику погрешности результатов анализа при внедрении методики в лаборатории устанавливать на основе выражения , с последующим уточнением по мере накопления информации, где - граница абсолютной погрешности, мг/м³;

где - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, таблица 3.1), %.

Контроль проводят путем сравнения результата контрольной процедуры К_к с нормативом контроля К.

Результат контрольной процедуры К_к рассчитывают по формуле:

где , , C_д - среднее значение массовой концентрации анализируемого компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки, соответственно (мг/м³).

Норматив оперативного контроля точности К рассчитывают по формуле:

Проводят сопоставление результата контрольной процедуры (К_к) с нормативом контроля (К).

Если результат контрольной процедуры удовлетворяет условию

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости:

Расхождение между результатами измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), не должно превышать предела воспроизводимости (R):

где X₁, X₂ - результаты измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), мг/кг;

R - предел воспроизводимости (табл. 3.1), мг/м³.

1. Федеральный закон от 30.03.1999 N 52-ФЗ "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения".

2. Унифицированные правила отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов, утвержденные Минздравом СССР 21.08.1979 N 2051-79.

3. ГОСТ Р ИСО 5725-(1 - 6) "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

4. ГОСТ Р 53228 "Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания".

5. ГОСТ OIML R 111-1 "Государственная система обеспечения единства измерений (ГСИ). Гири классов E(1), E(2), F(1), F(2), M(1), M(1-2), M(2), M(2-3) и M(3). Часть 1. Метрологические и технические требования".

6. ГОСТ 1770 "Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия".

7. ГОСТ 29227 "Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования".

8. ГОСТ 1770 "Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия".

9. ГОСТ Р 58144 "Вода дистиллированная. Технические условия".

10. ГОСТ Р 52501 "Вода для лабораторного анализа. Технические условия и методы испытаний".

11. ГОСТ 2603 "Реактивы. Ацетон. Технические условия".

12. ГОСТ 4172 "Реактивы. Натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный. Технические условия".

13. ГОСТ 83 "Натрий углекислый. Технические условия".

14. ГОСТ 245 "Реактивы. Натрий фосфорнокислый однозамещенный 2-водный. Технические условия".

15. ГОСТ 3118 "Реактивы. Кислота соляная. Технические условия".

16. ГОСТ 22300 "Реактивы. Эфиры этиловый и бутиловый уксусной кислоты. Технические условия".

17. ГОСТ 4328 "Реактивы. Натрия гидроокись. Технические условия".

18. ГОСТ 6995 "Реактивы. Метанол-яд. Технические условия".

19. ГОСТ 3117 "Реактивы. Аммоний уксуснокислый. Технические условия".

20. ГОСТ 20490 "Реактивы. Калий марганцовокислый. Технические условия".

21. ГОСТ 4221 "Реактивы. Калий углекислый. Технические условия".

22. ГОСТ 25336 "Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры".

23. ГОСТ 9737 "Посуда лабораторная стеклянная. Шлифы сферические взаимозаменяемые".

24. ГОСТ 25336 "Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры".

25. ГОСТ 8682 "Посуда лабораторная стеклянная. Шлифы конические взаимозаменяемые".

26. ГОСТ 34037 "Упаковка стеклянная для химических реактивов и особо чистых химических веществ. Общие технические условия".

27. ГОСТ ISO 7886-1 "Шприцы инъекционные однократного применения стерильные. Часть 1. Шприцы для ручного использования".

28. ГОСТ 12.1.007 "Система стандартов безопасности труда (ССБТ). Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности".

29. ГОСТ 12.1.019 "Система стандартов безопасности труда (ССБТ). Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты".

30. ГОСТ 12.1.004 "Система стандартов безопасности труда (ССБТ). Пожарная безопасность. Общие требования".

31. ГОСТ 12.0.004 "Система стандартов безопасности труда (ССБТ). Организация обучения безопасности труда. Общие положения".

32. ГОСТ 31861 "Вода. Общие требования к отбору проб".

33. ГОСТ 17.4.3.01 "Охрана природы. Почвы. Общие требования к отбору проб".

34. ГОСТ Р 58595 "Почвы. Отбор проб".

35. ГОСТ 27572 "Яблоки свежие для промышленной переработки. Технические условия".