"МУК 4.1.3683-20. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Количественное определение остаточных количеств пенициллинов в пищевой продукции животного происхождения методом конкурентного иммуноферментного анализа. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 25.12.2020)

1. Разработаны ФГБУН "ФИЦ питания и биотехнологии" (В.А. Тутельян, Д.Б. Никитюк, С.А. Хотимченко, С.А. Шевелева, Л.П. Минаева, В.В. Бессонов, А.Д. Малинкин, А.В. Галкин), ФБУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии в городе Москве" Роспотребнадзора (Л.И. Иванова, А.Ю. Полторацкий).

2. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Российской Федерации, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 25 декабря 2020 г.

3. Введены впервые.

1.1. Настоящие методические указания (далее - МУК) распространяются на продовольственное (пищевое) сырье и пищевую продукцию животного происхождения: молоко (сырое, питьевое, сухое, сгущенное), сливки, молочные смеси для детей (сухие), йогурт, кефир, сметану, сыворотку сухую и напитки на основе сыворотки, творог и творожные продукты (творог зерненый, творожная масса), сыры (молодой и зрелый), масло из коровьего молока, спред, мясо (говядина, свинина, курица, индейка), мясные субпродукты (печень, почки, жир), рыба (лососевые) и креветки.

МУК устанавливают порядок применения методики количественного определения остаточных количеств пенициллинов методом твердофазного конкурентного иммуноферментного анализа с фотометрической детекцией (при 450 нм) (далее - ИФА) в соответствии с диапазонами определяемых концентраций и метрологическими характеристиками.

1.2. МУК предназначены для органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, осуществляющих контроль качества и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов, а также могут быть использованы организациями, аккредитованными в установленном порядке на проведение исследований продовольственного сырья, пищевых продуктов.

1.3. МУК носят рекомендательный характер.

2.1. Метод ИФА основан на реакции "антиген - антитело". Лунки микротитровального планшета покрыты антителами захвата к антителам на ампициллин (вещество стандарта). В лунки дозируют растворы стандартов или проб, антитела к ампициллину и конъюгат ампициллина. Свободный ампициллин и ампициллин из ферментного конъюгата конкурируют за места связывания антител (конкурентный иммуноферментный анализ). Антитела к ампициллину связываются иммобилизированными антителами захвата. Все несвязанные молекулы конъюгата удаляются на этапе отмывки. В лунки вносят раствор субстрат/хромогена и инкубируют. Связанные молекулы конъюгата преобразуют хромоген в окрашенные в синий продукты реакции. Внесение стоп-раствора ведет к изменению окраски от синего к желтому. Измерение выполняют фотометрически при 450 нм. Оптическая плотность обратно пропорциональна концентрации ампициллина в пробе.

3.1. При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 3.1, для соответствующих диапазонов концентраций.

--------------------------------

<1> Пример метрологических характеристик при использовании тест-набора "Penicillin ELISA (5091PEN)".

--------------------------------

<2> Мягкие и свежие сыры с высоким содержанием влаги (с выдержкой до 1 месяца).

<3> Полутвердые, твердые и сверхтвердые сыры (с выдержкой более 4 месяцев).

Метрологические параметры установлены при проведении количественного определения с тест-набором, указанным в главе IV. Допускается использование метода для тест-наборов с аналогичными или лучшими характеристиками при наличии установленных метрологических параметров.

4.1. При выполнении измерений и подготовке проб применяют средства измерений, вспомогательные устройства, материалы и реактивы, приведенные в табл. 4.1 - 4.3.

Примечание. Допускается использование других средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание. Допускается использование других вспомогательных устройств, посуды и материалов с аналогичными или лучшими характеристиками.

--------------------------------

<4> Пересчет относительного центробежного ускорения (в единицах g) (ОЦУ/RFS) в скорость центрифугирования (об./мин) приведен в приложении к настоящим МУК.

Примечание. Допускается применение других химических реактивов с аналогичными или лучшими характеристиками.

4.2. Количественное определение пенициллинов по технологии ИФА проводят с тест-набором с внутренним стандартом, рассчитанным на проведение анализа 41 исследуемого образца и 6 калибровочных проб (в 2 повторностях), в составе (табл. 4.4).

--------------------------------

<5> Тест-набор "Penicillin ELISA (5091PEN)".

Пример специфичности методики определения пенициллинов, установленной по перекрестной чувствительности к исследованным антибиотикам в буферной системе с тест-набором, представлен в табл. 4.5.

--------------------------------

<6> Тест-набор "Penicillin ELISA (5091PEN)".

5.1 Исследования пищевых продуктов с использованием методики ИФА проводят с соблюдением требований техники безопасности, установленных для работ с токсичными, едкими, легковоспламеняющимися веществами в соответствии с ГОСТ 12.1.007.

5.2. Проведение исследований допускается только в подготовленном лабораторном помещении.

5.3. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией, отвечать требованиям пожарной безопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения в соответствии с ГОСТ 12.4.009.

5.4. При выполнении измерений с использованием планшетного иммуноферментного анализатора и работе с электроустановками необходимо соблюдать правила электробезопасности в соответствии ГОСТ 12.1.019 и инструкцию по эксплуатации прибора.

5.5. При работе с тест-набором необходимо соблюдать следующие требования безопасности:

- стоп-реагент содержит 0,5 М серной кислоты. Не допускается попадание реагента на кожу;

- раствор субстрат/хромоген токсичен при вдыхании, контакте с кожей и проглатывании. При обращении необходимо соблюдать меры предосторожности;

- необходимо избегать контакта всех реагентов с кожей и слизистыми оболочками;

- при дозировании реагентов допускается использовать только указанные инструменты.

6.1. К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области иммуноферментного анализа. К проведению анализа допускается только персонал, ознакомленный с руководством по эксплуатации планшетного иммуноферментного анализатора и освоивший данную методику.

7.1. Отбор проб осуществляют в соответствии с методическим документом <7>.

--------------------------------

<7> МУК 4.1.3534-18 "Подготовка проб для проведения исследований по определению остаточных количеств антибиотиков и антимикробных препаратов".

7.2. Пробы исследуемых продуктов хранят в соответствии с рекомендациями изготовителя, указанными на этикетке или в сопроводительной документации.

7.3. Хранение и транспортирование экстрактов, подготовленных для ИФА.

Готовые экстракты допускается хранить до начала анализа в пределах одной лаборатории при температуре от плюс 2 до плюс 8 °C не более 1 суток.

Допускается транспортирование материала при температуре от плюс 2 до плюс 8 °C в течение 1 суток. Доставленные в лабораторию образцы в виде экстрактов хранению не подлежат и сразу направляются на анализ.

8.1. При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- температура окружающего воздуха от плюс 20 до плюс 30 °C;

- относительная влажность воздуха не более 80%.

9.1. Подготовка стеклянной посуды.

При подготовке к проведению исследований лабораторную стеклянную посуду моют смесью водного раствора бихромата калия с концентрированной серной кислотой, многократно промывают водопроводной водой, ополаскивают дистиллированной водой и высушивают в сушильном шкафу.

9.2. Подготовка оборудования.

Подготовку и проверку фотометра, pH-метра и другого необходимого оборудования проводят в соответствии с руководствами по эксплуатации приборов.

9.3. Хранение и использование наборов и реагентов.

Тест-наборы для ИФА хранят при температуре от плюс 2 до плюс 8 °C, не допуская подмораживания компонентов. Использовать набор допускается только в пределах срока годности.

При подготовке к анализу ИФА, использовании и хранении тест-набора при необходимости дополнительно руководствоваться инструкцией к тест-набору.

9.4. Приготовление растворов.

9.4.1. Приготовление буфера для разбавления.

Разбавить концентрат буфера для разбавления стандартных растворов, конъюгата, антител, проб, имеющийся в комплекте, в соотношении 1:4 (1 + 3) дистиллированной водой (например, 10 см³ концентрата + 30 см³ дистиллированной воды). Готовый буфер для разбавления стандартов, проб, антител и конъюгата может храниться от плюс 2 до плюс 8 °C до в пределах срока годности, указанного на концентрате.

9.4.2. Приготовление моющего буфера.

Разбавить концентрат моющего буфера в соотношении 1:20 (1 + 19) дистиллированной водой (например, 2 см³ концентрата + 38 см³ дистиллированной воды; достаточно для 4 микротитровальных стрипов, т.е. 32 лунок). Разбавленный буфер может храниться от плюс 2 до плюс 8 °C в пределах срока годности, указанного на концентрате.

Примечание. При приготовлении разведений необходимо учитывать следующее: соотношение 1:10 означает, что 1 часть вещества (экстракта, концентрата) содержится в 10 частях готового раствора, то есть к 1 части вещества (экстракта, концентрата) прибавляется 9 частей растворителя, в соответствии с инструкцией производителя тест-набора.

Принимается допущение, что плотность буферных и других растворов (солей, кислот и щелочей), экстрактов, используемых в приведенных методиках, а также 10%-ных растворов (суспензий) продуктов приравнивается к плотности воды, исходя из чего при приготовлении последующих разведений учитывать, что массовые (м/м) и объемные (о/о) проценты принимаются равными.

9.5. Подготовка проб продуктов.

9.5.1. Молоко с содержанием жира < 1,5%.

Пробу исследуемого жидкого продукта перемешивают на вортексе в течение 3 с, разбавляют в соотношении 1:2 (1 + 1) буфером для разбавления проб (п. 9.4.1) (например, 1 см³ молока и 1 см³ буфера для разбавления проб), перемешивают на вортексе в течение 3 с.

Для анализа используют 0,05 см³ подготовленной пробы на лунку планшета. При расчете конечного результата учитывают фактор разбавления - 2.

9.5.2. Молоко с содержанием жира > 1,5%.

Пробу исследуемого жидкого продукта центрифугируют в течение 5 мин при 2 000 g и температуре не выше 4 °C (при отсутствии центрифуги с охлаждением допускается проводить центрифугирование при комнатной температуре с предварительным охлаждением проб в холодильнике до температуры не выше 4 °C).

Образовавшийся верхний слой жира удаляют с помощью шпателя или стеклянной палочки, обезжиренный супернатант отбирают в пустую пробирку. Обезжиренный супернатант разбавляют в соотношении 1:2 (1 + 1) буфером для разбавления проб (п. 9.4.1) (например, 1 см³ молока и 1 см³ буфера для разбавления проб), перемешивают на вортексе в течение 3 с.

Для анализа используют 0,05 см³ подготовленной пробы на лунку планшета. При расчете конечного результата учитывают фактор разбавления - 2.

9.5.3. Молоко сухое, молочные смеси для детского питания сухие.

Навеску исследуемого сухого продукта массой 1 г суспендируют в 9 см³ дистиллированной воды и перемешивают на вортексе до полного растворения.

Пробу исследуемого продукта центрифугируют в течение 5 мин при 2 000 g и температуре не выше плюс 4 °C (при отсутствии центрифуги с охлаждением допускается проводить центрифугирование при комнатной температуре с предварительным охлаждением проб в холодильнике до температуры не выше 4 °C).

Образовавшийся верхний слой жира удаляют с помощью шпателя или стеклянной палочки, обезжиренный супернатант отбирают в пустую пробирку.

Обезжиренный супернатант разбавляют в соотношении 1:2 (1 + 1) буфером для разбавления проб (п. 9.4.1) (например, 1 см³ супернатанта и 1 см³ буфера для разбавления проб), перемешивают на вортексе в течение 3 с.

Для анализа используют 0,05 см³ подготовленной пробы на лунку планшета. При расчете конечного результата (в пересчете на сухой продукт) учитывают фактор разбавления - 20.

Пересчет содержания антибиотика в восстановленном продукте проводят в соответствии с информацией на упаковке по приготовлению восстановленной смеси.

9.5.4. Сыворотка сухая.

Навеску исследуемого сухого продукта массой 1 г суспендируют в 9 см³ дистиллированной воды и перемешивают на вортексе не менее 3 секунд до полного растворения.

Для анализа используют 0,05 см³ подготовленной пробы на лунку планшета. При расчете конечного результата (в пересчете на сухой продукт) учитывают фактор разбавления - 10.

9.5.5. Молоко сгущенное, напитки на основе сыворотки.

Пробу исследуемого продукта массой 1 г вносят в центрифужную пробирку объемом 15 см³, приливают 4 см³ буфера для разбавления проб (п. 9.4.1), перемешивают на вортексе до полного растворения.

Полученную суспензию центрифугируют в течение 5 мин при 2 000 g и температуре не выше плюс 4 °C (при отсутствии центрифуги с охлаждением допускается проводить центрифугирование при комнатной температуре с предварительным охлаждением проб в холодильнике до температуры не выше плюс 4 °C).

Образовавшийся верхний слой жира удаляют с помощью шпателя или стеклянной палочки, обезжиренный супернатант отбирают в пустую пробирку.

Обезжиренный супернатант разбавляют в соотношении 1:2 (1 + 1) буфером для разбавления проб (п. 9.4.1) (например, 1 см³ супернатанта и 1 см³ буфера для разбавления проб), перемешивают на вортексе в течение 3 секунд.

Далее используют 0,05 см³ подготовленной пробы на лунку планшета. При расчете конечного результата учитывают фактор разбавления - 10.

9.5.6. Сливки, кисломолочные продукты: йогурт, кефир, творог и творожные продукты, сметана (разной жирности).

К пробе исследуемого продукта массой 5 г добавляют 20 см³ дистиллированной воды, гомогенизируют полностью на вортексе или в гомогенизаторе.

Центрифугируют 10 мин при 4 000 g при температуре не выше плюс 4 °C (при отсутствии центрифуги с охлаждением допускается проводить центрифугирование при комнатной температуре с предварительным охлаждением проб в холодильнике до температуры не выше плюс 4 °C).

Образовавшийся верхний слой жира удаляют с помощью шпателя или стеклянной палочки, обезжиренный супернатант отбирают в пустую пробирку.

Обезжиренный супернатант разбавляют 1:4 (1 + 3) буфером для разбавления проб (п. 9.4.1) (например, 0,5 см³ нижней водной фазы и 1,5 см³ буфера для разбавления проб).

Для анализа используют 0,05 см³ подготовленной пробы на лунку планшета. При расчете конечного результата учитывают фактор разбавления - 20.

9.5.7. Масло из коровьего молока, спреды сливочно-растительные.

Навеску исследуемого продукта массой 5,0 г вносят в центрифужную пробирку объемом 50 см³, приливают 20 см³ дистиллированной воды и инкубируют при 40 °C на водяной бане до полного расплавления, после чего гомогенизируют с помощью вортекса.

Центрифугируют 10 мин при 4 000 g при температуре не выше плюс 4 °C (при отсутствии центрифуги с охлаждением допускается проводить центрифугирование при комнатной температуре с предварительным охлаждением проб в холодильнике до температуры не выше плюс 4 °C).

Образовавшийся верхний слой жира удаляют с помощью шпателя или стеклянной палочки, нижнюю фазу отбирают в пустую пробирку.

Нижнюю фазу разбавляют в соотношении 1:4 (1 + 3) буфером для разбавления проб (п. 9.4.1) (например, 0,5 см³ нижней водной фазы и 1,5 см³ буфера для разбавления проб).

Для анализа используют 0,05 см³ подготовленной пробы на лунку планшета. При расчете конечного результата учитывают фактор разбавления - 20.

9.5.8. Сыр молодой.

Навеску исследуемого продукта массой 5 г вносят в центрифужную пробирку объемом 50 см³, приливают 20 см³ дистиллированной воды и тщательно гомогенизируют в гомогенизаторе или вручную в фарфоровой ступке.

Центрифугируют 10 мин при 4 000 g при температуре не выше плюс 4 °C (при отсутствии центрифуги с охлаждением допускается проводить центрифугирование при комнатной температуре с предварительным охлаждением проб в холодильнике до температуры не выше плюс 4 °C).

Образовавшийся верхний слой жира удаляют с помощью шпателя или стеклянной палочки, надосадочную водную фазу отбирают в пустую пробирку.

Надосадочную водную фазу разбавляют в соотношении 1:4 (1 + 3) буфером для разбавления проб (п. 9.4.1) (например, 0,5 см³ нижней водной фазы и 1,5 см³ буфера для разбавления проб).

Для анализа используют 0,05 см³ подготовленной пробы на лунку планшета. При расчете конечного результата учитывают фактор разбавления - 20.

9.5.9. Сыр зрелый.

Полностью гомогенизируют все количество представительной пробы в гомогенизаторе или вручную в фарфоровой ступке.

Навеску гомогенизированной пробы массой 1 г вносят в центрифужную пробирку объемом 15 см³, приливают 4 см³ дистиллированной воды и 2 см³ гексана, пробирку плотно закрывают, после чего тщательно перемешивают на вортексе, а затем перемешивают встряхиванием в течение 15 мин, используя встряхиватель с вертикальным вращением (переворотом).

Центрифугируют 10 мин при 4 000 g при температуре не выше плюс 4 °C (при отсутствии центрифуги с охлаждением допускается проводить центрифугирование при комнатной температуре с предварительным охлаждением проб в холодильнике до температуры не выше плюс 4 °C). Нижнюю водную фазу отбирают в пустую пробирку.

Нижнюю водную фазу разбавляют в соотношении 1:4 (1 + 3) буфером для разбавления проб (п. 9.4.1) (например, 0,5 см³ нижней водной фазы и 1,5 см³ буфера для разбавления проб).

Для анализа используют 0,05 см³ подготовленной пробы на лунку планшета. При расчете конечного результата учитывают фактор разбавления - 20.

Примечание. При проведении профподготовки с использованием гексана для исключения ложноположительных результатов необходимо использовать отрицательный контроль. При подготовке отрицательного контроля вместо пробы вносят соответствующий объем дистиллированной воды и проводят все процедуры экстракции, как с исследуемым образцом, с последующим внесением в лунку планшета. При расчете конечного результата полученные значения вычитают из значений исследованного образца (для расчета используют тот же фактор разбавления).

9.5.10. Подготовка проб мяса, печени и почек скота и птицы.

Полностью гомогенизируют все количество представительной пробы в гомогенизаторе или вручную в фарфоровой ступке.

Навеску гомогенизированной пробы массой 1 г вносят в центрифужную пробирку вместимостью 15 см³, прибавляют 4 см³ дистиллированной воды, тщательно перемешивают на вортексе, а затем перемешивают встряхиванием в течение 15 мин, используя встряхиватель с вертикальным вращением (переворотом).

Центрифугируют 10 мин при 2 000 g при комнатной температуре от плюс 20 до плюс 25 °C. Образовавшийся верхний слой жира (при наличии) удаляют с помощью шпателя или стеклянной палочки, надосадочную фазу отбирают в пустую пробирку.

Надосадочную фазу разбавляют в соотношении 1:8 (1 + 7) буфером для разбавления проб (п. 9.4.1) (например, 0,05 см³ пробы и 0,35 см³ буфера для разбавления проб).

Для анализа используют 0,05 см³ подготовленной пробы на лунку планшета. При расчете конечного результата учитывают фактор разбавления - 40.

9.5.11. Подготовка проб рыбы (лососевые) и креветок.

Полностью гомогенизируют все количество представительной пробы в гомогенизаторе или вручную в фарфоровой ступке. Экстракцию проводят по п. 9.5.10.

Для анализа используют 0,05 см³ подготовленной пробы на лунку планшета. При расчете конечного результата учитывают фактор разбавления - 40.

9.5.12. Подготовка проб животного жира.

Пробоподготовку (экстракцию) проводят по п. 9.5.7.

Для анализа используют 0,05 см³ подготовленной пробы на лунку планшета. При расчете конечного результата учитывают фактор разбавления - 20.

10.1. Раствор субстрата/хромогена светочувствителен, поэтому необходимо избегать попадания на него прямого света. При появлении окрашивания раствора субстрата/хромогена в голубоватый цвет реагент к работе непригоден.

Не допускается заменять реагенты в составе одного комплекта реагентами из другого комплекта с другим номером партии. Не допускается перекрестное использование реагентов из комплектов с разными номерами партий.

Каждая лунка стрипа при изменении оптической плотности выступает в роли оптической кюветы, поэтому необходимо избегать прикосновения и загрязнения нижней стороны лунок.

10.2. Подготовка тест-набора к исследованиям.

10.2.1. Перед выполнением анализа из планшета следует извлечь необходимое количество стрипов (8 микролунок, скрепленных в одну полоску). Остальные стрипы следует тщательно упаковать в фольгированный пакет вместе с осушителем, закрыть застежку пакета и поместить в холодильник при температуре от плюс 2 до плюс 8 °C.

10.2.2. Перед использованием тест-набора доводят температуру всех реагентов до комнатной (от плюс 20 до плюс 25 °C) в течение 0,5 - 1 ч. Если в концентратах буфера и конъюгата образовались кристаллы, нужно растворить их путем встряхивания при комнатной температуре перед разведением этих реагентов.

10.2.3. Перед непосредственным использованием встряхивают каждый флакон с реагентами.

10.2.4. После использования реагенты тест-набора сразу убирают в холодильник.

10.2.5. На всех стадиях необходимо избегать воздействия прямого солнечного света.

10.2.6. Для каждого реактива и раствора используют отдельные съемные наконечники автоматических дозаторов. Внесение растворов в лунки проводят осторожно, не касаясь наконечниками их дна и стенок.

10.2.7. Для получения точных результатов на стадиях дозирования реактивов и промывания необходимо соблюдал высокую точность и аккуратность.

10.2.8. Каждый исследуемый раствор экстрактов испытуемых проб и градуировочных растворов анализируют в двух повторностях.

10.2.9. Оптимальные результаты будут получены только при строгом соблюдении приведенной методики.

10.3. Подготовка реагентов к исследованиям.

Приготовление растворов со 100-кратным разведением из концентратов антител и конъюгата должны проводиться автоматическими дозаторами с диапазоном дозирования от 0,005 до 0,050 см³, обеспечивающими строгий количественный отбор концентратов антител и конъюгата. После внесения в буфер для разбавления необходимо провести тщательное перемешивание путем многократного пипетирования, не меняя наконечника.

Проверка используемых автоматических дозаторов на точность и сходимость результатов пипетирования должна проводиться еженедельно (например, весовым методом), допустимая относительная погрешность дозирования не должна превышать установленного в паспорте значения.

Допускается дополнительно контролировать отбираемый объем концентрата с использованием аналитических весов с наименьшим пределом взвешивания не более 0,0001 г.

10.3.1. Антитела к ампициллину поставляются в концентрированном виде. Так как разбавленный раствор антител обладает ограниченной стабильностью, перед исследованием необходимо восстанавливать строго то количество антител, которое необходимо для анализа.

Пробирку с антителами центрифугируют в течение краткого периода времени (1 мин) при 1 000 g при комнатной температуре (от плюс 20 до плюс 25 °C). Для восстановления разбавляют концентрат в соотношении 1:100 (1 + 99) буфером для разбавления (п. 9.4.1) (например, 0,010 см³ концентрата антител + 0,99 см³ буфера для разбавления; такого количества достаточно для 4 стрипов, т.е. 32 лунок).

10.3.2. Ферментный конъюгат ампициллина поставляется в концентрированном виде.

Так как разбавленный раствор конъюгата обладает ограниченной стабильностью, то перед исследованием необходимо восстанавливать строго то количество антител, которое необходимо для анализа.

Пробирку с конъюгатом центрифугируют в течение краткого периода времени (1 мин) при 1 000 g при комнатной температуре (от плюс 20 до плюс 25 °C). Для восстановления разбавляют концентрат в соотношении 1:100 (1 + 99) буфером для разбавления (п. 9.4.1) (например, 0,010 см³ концентрата антител + 0,99 см³ буфера для разбавления; такого количества достаточно на 4 стрипа, т.е. 32 лунок).

10.3.3. Стандарт ампициллина поставляется в виде лиофилизата.

Для восстановления лиофилизата необходимо в 1 флакон со стандартом добавить 2 см³ готового буфера для разбавления (п. 9.4.1); при этом получится стандарт 7 с концентрацией ампициллина 4 нг/см³ (или 0,004 мкг/см³). Далее готовят стандарты 2 - 6, выполнив серию разбавлений по схеме, приведенной в табл. 10.1.

Буфер для разбавления (п. 9.4.1) используется как стандарт 1 = 0 нг/см³.

Для экономичного расходования приготовленных стандартов допускается разделить стандарты на аликвоты и заморозить их при минус 20 °C, в таком виде их можно хранить до 1 недели. Не допускается повторное замораживание/оттаивание стандартов.

10.4. Алгоритм проведения исследования.

10.4.1. В рамку планшета вставляют необходимое количество микролунок, достаточное для всех растворов стандартов и растворов исследуемых проб при анализе в двух повторностях каждый. Записывают положения лунок со стандартами и исследуемыми растворами на бланке планшета.

10.4.2. Добавляют в выбранные пары лунок по 0,05 см³ каждой концентрации раствора стандарта и раствора подготовленной пробы продукта.

10.4.3. Затем в каждую лунку добавляют по 0,025 см³ разбавленного ферментного конъюгата (п. 10.3.2).

10.4.4. Далее в каждую лунку добавляют по 0,025 см³ разбавленного раствора антител (п. 10.3.1). Перемешивают, осторожно покачивая планшет рукой, и оставляют для инкубации при температуре (+4 +/- 2) °C в холодильнике в течение 1 часа в темном месте.

10.4.5. По окончании инкубации выливают жидкость из лунок, переворачивая рамку планшета, и тщательно выбивают капельки жидкости, оставшиеся в лунках, путем троекратного интенсивного постукивания рамкой с лунками по столу (максимально выбивая капли из лунок), накрытому фильтровальной бумагой.

10.4.6. Заполняют лунки моющим буфером (п. 9.4.2), внося по 0,3 см³ в каждую лунку, используя восьмиканальный дозатор. После контакта выливают буфер для промывки из лунок и тщательно выбивают капельки жидкости. Процедура отмывки повторяется трижды.

Допускается для увеличения производительности использование автоматического устройства для отмывки иммунологических планшетов.

Примечание. Необходимо следовать рекомендованной процедуре промывки и не допускать высыхания микролунок в процессе выполнения анализа.

10.4.7. После отмывания добавляют по 0,1 см³ смеси субстрата/хромогена в каждую лунку. Перемешивают, осторожно покачивая планшет рукой, и оставляют для инкубации при комнатной температуре (от плюс 20 до плюс 25 °C) в течение 30 минут в темном месте.

10.4.8. По окончании инкубации добавляют в каждую лунку по 0,1 см³ стоп-реагента. Перемешивают, осторожно покачивая планшет рукой, немедленно измеряют оптическую плотность в каждой лунке.

11.1. Инструментальный учет реакции проводят путем измерения оптической плотности на микропланшетном иммуноферментном анализаторе (планшетный фотометр, ридер) при длине волны 450 нм против нулевого стандарта, значение которого принимается за 100%.

Величина оптической плотности, измеренной в лунке с нулевым стандартом, ниже 0,8 (A_450нм < 0,8) является признаком порчи реагентов. Окрашивание красноватого раствора субстрата/хромогена в голубой цвет перед постановкой анализа также является признаком порчи реагентов. Результаты анализа в таком случае не учитываются.

11.2. Для обработки результатов иммуноферментного анализа используется специальное программное обеспечение, рекомендованное изготовителем тест-набора. Пример стандартной калибровочной кривой дан в сертификате обеспечения качества на тест-набор.

Программное обеспечение выполняет построение градуировочной зависимости относительной оптической плотности B/B₀ от натурального логарифма концентрации антибиотика:

где B_i - оптическая плотность раствора антибиотика;

B₀ - оптическая плотность 1-го градуировочного раствора с концентрацией антибиотика 0,00 мкг/дм³;

C_i - концентрация антибиотика в i-м градуировочном растворе, мкг/дм³ (нг/см³).

Расчет коэффициентов линейной регрессии a и b проводится с помощью метода наименьших квадратов на основании пар значений B_i/B₀, lnC_i, полученных для шести градуировочных растворов, где (i = 2 ... 7), C_i - концентрация i-го градуировочного раствора, B_i - среднее значение оптической плотности, рассчитанное по двум значениям оптической плотности параллельных измерений i-го градуировочного раствора. Массовая концентрация антибиотика в пробе рассчитывается на основании результатов измерений оптической плотности раствора подготовленной пробы, коэффициентов линейной регрессии и фактора разбавления по формуле:

где X - концентрация антибиотика в пробе, мкг/кг (мкг/дм³) (нг/г или нг/см³);

B_x - оптическая плотность, полученная при измерении раствора пробы (экстракта);

F - фактор разбавления пробы.

Градуировочная зависимость считается приемлемой, если рассчитанное программным обеспечением значение коэффициента корреляции r² > 0,98.

11.3. Обработку результатов анализа без программного обеспечения проводят следующим образом.

Измеренные показатели оптической плотности переносят в таблицу и располагают в соответствии с номерами образцов.

Вычисляют средние значения оптической плотности стандартных и исследуемых растворов, полученные по 2 параллельным микролункам в результате двух параллельных определений.

Относительную оптическую плотность (A) вычисляют по формуле:

где A - значение относительной оптической плотности, выраженное в процентах от оптической плотности нулевого стандарта, % поглощения;

B_i - среднее значение оптической плотности шести стандартных растворов антибиотика (i = 2 ... 7) (или исследуемых экстрактов испытуемых проб);

B₀ - среднее значение оптической плотности 1-го градуировочного раствора (нулевого стандарта).

11.4. По величинам значений относительной оптической плотности, вычисленным для стандартных растворов, и соответствующим им значениям концентрации антибиотика в мкг/дм³ строят калибровочную кривую (градуировочный график) в полулогарифмической системе координат.

11.5. Концентрацию антибиотика (x) в мкг/дм³ (нг/см³) в экстракте испытуемой пробы считывают по калибровочной кривой соответственно значениям оптической плотности (в пределах значений 2 - 7 градуировочных растворов), которые вычислены по формуле (3).

11.6. Массовую концентрацию (содержание) антибиотика в испытуемой пробе (X) рассчитывают по формуле:

где X - массовая концентрация антибиотика в испытуемой пробе, мг/кг (мг/дм³ - для жидких продуктов);

x - массовая концентрация антибиотика в экстракте испытуемой пробы, определяемая по градуировочному графику, мкг/дм³;

F - фактор разбавления испытуемой пробы;

K - коэффициент пересчета мкг/дм³ в мг/кг (мг/дм³ - для жидких проб), равный 1000.

При выполнении пробоподготовки и анализа в полном соответствии с приведенной методикой фактор разбавления F принимает следующие значения (табл. 11.1).

12.1. При расчете учитывают только результаты, удовлетворяющие условиям диапазона определяемых концентраций антибиотика в образце (значение равно или выше нижней границы/равно или ниже верхней границы) для соответствующего вида продукции, указанного в табл. 3.1 для каждой группы продуктов.

В случае обнаружения содержания антибиотика в подготовленном экстракте выше верхней границы градуировочного графика проводят дополнительное разведение подготовленного экстракта и в дальнейшем учитывают это разведение при обработке результата анализа.

За результат количественного анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:

где X₁ и X₂ - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости (табл. 3.1), при этом .

При невыполнении условия выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

13.1. Результат анализа представляют в виде:

где - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

- граница абсолютной погрешности, мг/кг:

где - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 3.1), %.

Если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, с учетом границы абсолютной погрешности результат анализа представляют в виде: "Содержание пенициллинов в молоке < 0,0003 мг/дм³".

14.1. Проверку приемлемости результатов измерений, полученных в условиях повторяемости (сходимости) и воспроизводимости, проводят с учетом ГОСТ ИСО 5725-6.

Различные модели центрифуг при одинаковых скоростях вращения ротора могут иметь отличающиеся факторы разделения, поэтому эффективность разделения в центробежном поле принято количественно оценивать как величину относительного центробежного ускорения (ОЦУ/RFS), выраженного в единицах g.

Эффективность разделения - фактор разделения F (ОЦУ/RFS) - зависит от частоты вращения и радиуса центрифугирования и рассчитывается по следующей формуле:

где n - скорость вращения ротора, об./мин;

r - средний радиус вращения столбика жидкости в центрифужной пробирке, см.

Радиус измеряется от оси вращения ротора до середины столбика жидкости в пробирке, когда держатель пробирки (при наличии подвижного держателя) находится в положении центрифугирования (под углом к оси вращения).

Если необходимо обеспечить заданный фактор разделения, то для расчета скорости центрифугирования используют следующую формулу:

Для облегчения расчета можно использовать номограмму, отражающую зависимость относительного ускорения центрифуги (ОЦУ/RFS) от скорости вращения ротора (n) и радиуса (r) - среднего радиуса вращения столбика жидкости в центрифужной пробирке.

Пример.

Необходимо определить скорость вращения центрифуги для достижения относительного центробежного ускорения (фактора разделения) 4 000 g, если средний радиус вращения столбика жидкости в центрифужной пробирке (от оси ротора до точки в середине высоты столбика) равен 8 см.

Способ 1 - путем расчета по формуле (2):

Таким образом, для получения фактора разделения 4 000 g необходимо установить скорость центрифугирования примерно 6700 об./мин.

Способ 2 - с использованием номограммы.

На номограмме проводят прямую линию от точки 8 на шкале "Радиус центрифугирования" через точку 4000 на шкале "Фактор разделения RFS" до пересечения со шкалой "Скорость центрифугирования", значение в точке пересечения с которой определяет скорость центрифугирования - примерно 6700 об./мин.

Примечание. Необходимо учитывать, что средний радиус определяется как расстояние от оси ротора до точки середины высоты столбика жидкости в центрифужной пробирке и будет меняться в зависимости количества жидкости в центрифужной пробирке (высоты столбика жидкости).

1. Приказ Минтруда России от 19.04.2017 N 371 "Об утверждении Правил по охране труда при использовании отдельных видов химических веществ и материалов".

2. МУК 4.1.3534-18 "Подготовка проб для проведения исследований по определению остаточных количеств антибиотиков и антимикробных препаратов".

3. ГОСТ 1770 "Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия".

4. ГОСТ 29227 (ИСО 835-1) "Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования".

5. ГОСТ 6709 "Вода дистиллированная. Технические условия".

6. ГОСТ 12026 "Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия".

7. ГОСТ 23932 "Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Общие технические условия".

8. ГОСТ 25336 "Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры".

9. ГОСТ 12.1.007 "Система стандартов безопасности труда (ССБТ). Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности".

10. ГОСТ 12.1.004 "Система стандартов безопасности труда (ССБТ). Пожарная безопасность. Общие требования".

11. ГОСТ 12.4.009 "Система стандартов безопасности труда (ССБТ). Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание".

12. ГОСТ 12.1.019 "Система стандартов безопасности труда (ССБТ). Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты".

13. ГОСТ Р ИСО 5725-6 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике".