"МУК 4.1.3736-21. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств эмамектина (эмамектина бензоата) в плодах и соке плодовых косточковых методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 28.12.2021)

1. Разработаны ФБУН "Федеральный научный центр гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана" Роспотребнадзора (В.Н. Ракитский, Н.Е. Федорова, Н.А. Степанова); ФГБОУ ДПО "Российская медицинская академия непрерывного профессионального образования" (И.З. Мустафина).

2. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 28 декабря 2021 г.

3. Введены впервые.

1.1. Настоящие методические указания (далее - МУК) устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (далее - ВЭЖХ) для определения в плодах и соке плодовых косточковых массовой концентрации эмамектина в диапазоне 0,005 - 0,050 мг/кг.

1.2. МУК предназначены для органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, а также могут быть использованы организациями, осуществляющими контроль качества и исследования пищевых продуктов и продовольственного сырья.

1.3. МУК носят рекомендательный характер.

2.1. Эмамектин бензоат - смесь, содержащая 90% эмамектина бензоата B_1a и 10% эмамектина бензоата B_1b.

2.1.1. Эмамектин бензоат B_1a - (10E,14E,16E,22Z)-(1R,4S,5'S,6S,6'R,8R,12S,13S,20R,21R,24S)-6'-[(S)-фтор-бутил]-21,24дигидрокси-5',11,13,22-тетра-метил-2-оксо-3,7,19-триоксатетрацикло[15.6.1.1^4,8.0^20,24]пентакоза-10,14,16,22-тетраен-6-спиро-2'-(5',6'-дигидро-2'H-пиран)-12-ил-2,6-дидеокси-3-O-метил-4-O-(2,4,6-тридеокси-3-O-метил-4-метиламино--L-ликсо-гекса-пиранозил)--L-арабиногексопиранозид <1>.

2.1.2. Эмамектин бензоат B_1b - (10E,14E,16E,22Z)-(1R,4S,5'S,6S,6'R,8R,12S,13S,20R,21R,24S)-21,24-дигидрокси-6'-изопропил-5',11,13,22-тетраметил-2-оксо-3,7,19-триоксатетрацикло[15.6.1.1^4,8.0^20,24]пентакоза-10,14,16,22-тетраен-6-спиро-2'-(5',6'-дигидро-2'H-пиран)-12-ил-2,6-дидеокси-3-O-метил-4-O-(2,4,6-тридеокси-3-O-метил-4-метиламино--L-ликсо-гексо-пиранозил)--L-арабиногексопиранозид <1>.

--------------------------------

<1> В соответствии с Международным союзом теоретической и прикладной химии (ИЮПАК, англ. International Union of Pure and Applied Chemistry, IUPAC).

2.1.3. Брутто-формула эмамектина бензоата B_1a C₅₆H₈₁NO₁₅. Молекулярная масса 1008,3. Брутто-формула эмамектина бензоата B_1b C₅₆H₇₉NO₁₅. Молекулярная масса 994,2. Кристаллический порошок с органическим запахом, цвет от белого до грязно-белого. Температура плавления 141 - 146 °C (с разложением при нагревании до 300 °C). Давление паров 4·10^-3 мПа (25 °C). Плотность 1,2 г/см³. Растворимость в органических растворителях (при 25 °C, г/дм³): октанол - 48, ацетон - 140, дихлорметан - > 500, этилацетат - 81, метанол - 270, толуол - 26, гексан - 0,077, циклогексан - 0,23. Растворимость в воде при 25 °C - 0,31 г/дм³ (дистиллированная вода, pH 6,5), 0,32 (буферный раствор, pH 5), 0,024 г/дм³ (буферный раствор, pH 7), 0,0001 (буферный раствор, pH 9). Коэффициент распределения в системе н-октанол-вода K_OW logP = 3,0 +/- 0,1 (pH 5), 5,0 +/- 0,2 (pH 7), 5,9 +/- 0,3 (pH 9). Гидролитически стабилен при pH 5 - 8 (25 °C).

Подвержен быстрой фотодеградации.

2.2. Область применения препарата. Эмамектин бензоат - несистемный инсектицид кишечно-контактного действия для защиты томатов, виноградной лозы, капусты и других культур от широкого спектра личинок лепидоптеры.

3.1. При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 3.1 для соответствующих диапазонов концентраций.

4.1. Методика основана на определении эмамектина методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на обращенной фазе с флуориметрическим детектором после экстракции вещества из анализируемых проб плодов и сока плодовых косточковых метанолом, очистки аликвоты экстракта на концентрирующих патронах, превращения вещества во флуорогенное (N-трифторацетилированное) производное.

4.2. Нижний предел измерения эмамектина бензоата в анализируемом объеме пробы - 0,1 нг.

5.1. При выполнении измерений и подготовке проб применяют средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы, приведенные в табл. 5.1 - 5.3.

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.

Примечание. Допускается использование вспомогательных устройств и материалов с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

6.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостные хроматографы.

6.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004.

6.3. Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист, имеющий опыт работы на жидкостном хроматографе, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений.

7.1. При выполнении измерений, соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

8.1. Очистка ацетонитрила. Ацетонитрил кипятят с обратным холодильником над пентоксидом фосфора (на 1 дм³ ацетонитрила 20 г пентоксида фосфора) не менее 1 часа, после чего перегоняют. Непосредственно перед употреблением ацетонитрил повторно перегоняют над прокаленным карбонатом калия (на 1 дм³ ацетонитрила 10 г карбоната калия).

8.2. Подготовка подвижной фазы для ВЭЖХ.

8.2.1. Приготовление 0,1%-го раствора ортофосфорной кислоты. В мерную колбу вместимостью 500 см³ помещают 200 - 300 см³ деионизованной воды, сносят 0,5 см³ ортофосфорной кислоты, доводят водой до метки.

8.2.2. Приготовление подвижной фазы. В мерную колбу вместимостью 1000 см³ помещают 950 см³ ацетонитрила и 50 см³ 0,1%-го раствора ортофосфорной кислоты, перемешивают, фильтруют через мембранный фильтр и дегазируют.

Подвижную фазу хранят в емкости из темного стекла не более 30 дней.

8.3. Приготовление реактива для дериватизации. Смешивают трифторуксусный ангидрид и свежеперегнанный ацетонитрил в объемном соотношении 1:2. Реактив годен в течение рабочего дня.

8.4. Кондиционирование хроматографической колонки для ВЭЖХ. Промывают колонку подвижной фазой (приготовленной по п. 8.2.2) при скорости подачи растворителя 1,3 см³/мин до установления стабильной базовой линии.

8.5. Приготовление градуировочных растворов и раствора внесения.

8.5.1. Исходный раствор эмамектина бензоата для градуировки (концентрация 100 мкг/см³). В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают (0,0100 +/- 0,0001) г эмамектина бензоата, растворяют в 50 - 60 см³ ацетонитрила, доводят ацетонитрилом до метки, тщательно перемешивают.

Раствор хранят в морозильной камере при температуре не выше минус 18 °C не более 6 месяцев.

Растворы N 1 - 6 готовят объемным методом путем последовательного разбавления исходного раствора для градуировки.

8.5.2. Раствор N 1 эмамектина бензоата для градуировки и внесения (концентрация 1 мкг/см³). В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 1,0 см³ исходного раствора с концентрацией эмамектина бензоата 100 мкг/см³ (п. 8.5.1), разбавляют ацетонитрилом до метки.

Раствор хранят в морозильной камере при температуре не выше минус 18 °C не более 6 месяцев.

Этот раствор используют для приготовления проб с внесением при оценке полноты извлечения действующего вещества методом "внесено-найдено" и контроля качества результатов измерений методом добавок.

8.5.3. Рабочие растворы N 2 - 6 эмамектина бензоата для градуировки (концентрации 0,01 - 0,10 мкг/см³). В 5 мерных колб вместимостью 100 см³ помещают по 1,0; 2,0; 5,0; 8,0 и 10,0 см³ градуировочного раствора N 1 с концентрацией 1 мкг/см³ (п. 8.5.2), доводят до метки ацетонитрилом, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы N 2 - 6 с концентрацией эмамектина бензоата 0,01; 0,02; 0,05; 0,08 и 0,1 мкг/см³ соответственно.

Рабочие растворы сразу после приготовления помещают в морозильную камеру, где хранят при температуре не выше минус 18 °C в течение месяца.

8.5.4. Рабочие растворы N 2а - 6а флуорогенного производного эмамектина бензоата для градуировки (соответствуют содержанию эмамектина бензоата 0,01 - 0,10 мкг). В 5 градуированных пробирок вместимостью 5 см³ вносят по 1 см³ каждого из 5 рабочих растворов эмамектина бензоата N 2 - 6 (п. 8.5.3), прибавляют по 0,1 см³ 1-N-метилимидазола, перемешивают. Смесь охлаждают до 0 - 5 °C, помещая пробирки в ледяную баню, добавляют по каплям 0,3 см³ реактива для дериватизации (приготовленного по п. 8.3), перемешивают и выдерживают час при комнатной температуре. Затем в каждую пробирку вносят по 0,6 см³ деионизованной воды и 3,0 см³ ацетонитрила, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы N 2а - 6а флуорогенного производного с содержанием эмамектина бензоата 0,01; 0,02; 0,05; 0,08 и 0,1 мкг соответственно.

Рабочие растворы сразу после приготовления помещают в морозильную камеру, где хранят при температуре не выше минус 18 °C не более месяца.

8.6. Установление градуировочной характеристики. Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика (единицы люминесценции*сек) от концентрации эмамектина бензоата в растворе (мкг), устанавливают методом абсолютной калибровки по 5 растворам флуорогенного производного эмамектина бензоата N 2а - 6а для градуировки.

В инжектор хроматографа вводят по 10 мм³ каждого градуировочного раствора N 2а - 6а и анализируют в условиях хроматографирования, указанных ниже. Осуществляют не менее 3 параллельных измерений.

Устанавливают площади пиков флуорогенного производного основного компонента действующего вещества эмамектина бензоата B_1a, на основании которых строят градуировочную зависимость.

8.7. Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят в начале и по окончании каждой серии анализов.

При контроле стабильности градуировочной характеристики проводят измерения не менее двух образцов концентраций для градуировки, содержание эмамектина в которых должно охватывать весь диапазон концентраций от 0,01 до 0,10 мкг/см³.

Градуировочная характеристика считается стабильной, если для каждого из используемых для контроля градуировочных растворов сохраняется соотношение:

где X - концентрация эмамектина в пробе при контрольном измерении, мкг/см³;

C - известная концентрация градуировочного раствора эмамектина, взятая для контроля стабильности градуировочной характеристики, мкг/см³;

B - норматив контроля погрешности градуировочной характеристики, % (равен 10% при P = 0,95).

8.8. Подготовка концентрирующих патронов. Патрон устанавливают на аллонж с прямым отводом для вакуума и промывают с помощью разрежения, создаваемого водоструйным насосом. Используют 1 см³ метанола, затем 2 см³ бидистиллированной воды со скоростью прохождения растворителей через патрон 1 - 2 капли в секунду. Патроны готовят непосредственно перед анализом.

9.1. Отбор проб осуществляют в соответствии с методическими документами <2>.

--------------------------------

<2> Унифицированные правила отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов, утвержденные заместителем Главного государственного санитарного врача СССР от 21.08.1979 N 2051-79: "Методические указания по регистрационным испытаниям пестицидов в части биологической эффективности". Москва, 2018. 64 с.; ГОСТ 34340 "Персики и нектарины свежие. Технические условия".

Растительные пробы хранят при температуре (4 +/- 2) °C не более недели. Для длительного хранения образцы замораживают и хранят при температуре не выше минус 18 °C.

Перед анализом образцы измельчают. Соки анализируют в день приготовления.

10.1. Экстракция. Плоды и сок плодовых косточковых. Измельченный образец плодовых косточковых культур или сока массой 10 г помещают в коническую колбу вместимостью 250 см³, добавляют порцию метанола объемом 50 см³, помещают на 3 мин в ультразвуковую баню, затем 15 мин встряхивают на механическом встряхивателе. Пробе дают отстояться, надосадочную жидкость переносят в центрифужную полипропиленовую пробирку вместимостью 50 см³, центрифугируют 5 мин при скорости вращения 3500 об./мин, помещают в морозильную камеру на 1 час при температуре не выше минус 18 °C. Полученный холодный образец повторно центрифугируют 5 мин при скорости вращения 3500 об./мин. Аликвоту надосадочной жидкости объемом 10 см³ (1/5 часть экстракта) с помощью пипетки переносят в плоскодонную колбу вместимостью 50 см³, добавляют порцию бидистиллированной воды объемом 15 см³, помещают на 2 мин в ультразвуковую баню, подвергают очистке по п. 10.2, затем дериватизации по п. 10.3.

10.2. Очистка экстракта на концентрирующем патроне. Пробу, полученную по п. 10.1, вносят с помощью разрежения, создаваемого водоструйным насосом, на концентрирующий патрон, подготовленный по п. 8.8, со скоростью пропускания раствора 2 - 3 капли в секунду, не допуская пересыхания патрона. После нанесения пробы патрон промывают 2 см³ смеси вода-ацетонитрил (7:3, по объему), пропуская растворитель до нижнего края сорбента, элюаты отбрасывают. Вещество элюируют с патрона 5 см³ ацетонитрила, собирая элюат непосредственно в круглодонную колбу для упаривания вместимостью 50 см³. Растворитель упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 35 °C досуха. Для полного удаления следов влаги в колбу вносят 3 - 5 см³ ацетонитрила и вновь упаривают. Остаток в колбе растворяют в 1 см³ ацетонитрила (V_кон), помещая в ультразвуковую баню на 2 мин, и подвергают дериватизации по п. 10.3.

10.3. Дериватизация. К ацетонитрильному раствору, полученному по п. 10.2, прибавляют 0,1 см³ 1-N-метилимидазола, перемешивают. Смесь охлаждают до 0 - 5 °C, помещая пробирки в ледяную баню, добавляют по каплям 0,3 см³ реактива для дериватизации (приготовленного по п. 8.3), перемешивают и выдерживают час при комнатной температуре. Затем в каждую пробирку вносят по 0,6 см³ деионизованной воды и 3,0 см³ ацетонитрила, тщательно перемешивают.

Дериватизированные экстракты анализируют в условиях хроматографирования по п. 10.4.

Пробу вводят в инжектор хроматографа не менее двух раз. Устанавливают площадь пика флуорогенного производного эмамектина бензоата B_1a (основной пик), с помощью градуировочного графика определяют концентрацию эмамектина бензоата в хроматографируемом растворе.

10.4. Условия хроматографирования:

- жидкостный хроматограф с флуориметрическим детектором с переменной длиной волны;

- хроматографическая колонка стальная длиной 150 мм, внутренним диаметром 4,6 мм, заполненная обращенно-фазным сорбентом с привитыми монофункциональными полярными группами C18, зернение 5 мкм; длина волны (возбуждение) 365 нм; длина волны (эмиссия) 470 нм; температура колонки 35 °C;

- подвижная фаза: ацетонитрил - 0,1%-я ортофосфорная кислота (95:5, по объему);

- скорость потока элюента: 1,3 см³/мин;

- ориентировочное время выхода: эмамектин бензоат B_1a - 12,772 - 13,459 мин (основной пик);

- объем вводимой пробы 10 мм³;

- линейный диапазон детектирования 0,1 - 10 нг.

Образцы, дающие пики, большие, чем градуировочный раствор флуорогенного производного эмамектина бензоата с концентрацией 0,1 мкг/см³, разбавляют ацетонитрилом (не более чем в 50 раз). Диапазон измеряемых концентраций с учетом разбавления в 50 раз - 0,05 - 25 мг/кг.

11.1. Содержание эмамектина в пробе плодов и сока плодовых косточковых культур (X, мг/кг) рассчитывают по формуле:

где A - концентрация эмамектина в хроматографируемом растворе, найденная по градуировочному графику в соответствии с усредненной величиной площади хроматографического пика флуорогенного производного эмамектина бензоата B_1a, мкг/см³;

V_кон - объем экстракта, подготовленного для дериватизации, см³;

m - масса анализируемого образца, г;

K₁ = 5 - коэффициент, учитывающий объем экстракта, взятого для анализа;

K₂ - коэффициент, учитывающий кратность разбавления, концентрирования образца (при необходимости).

Примечание - Идентификация и расчет концентрации вещества в пробах могут быть проведены с помощью компьютерной программы обработки хроматографических данных, включенной в аналитическую систему.

12.1. Результат анализа представляют в виде:

где - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

- граница абсолютной погрешности, мг/кг;

где - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 3.1), %.

Если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде: "Содержание эмамектина в пробе плодов и соке плодовых косточковых - менее 0,005 мг/кг" <3>.

--------------------------------

<3> 0,005 мг/кг - предел обнаружения эмамектина в пробах плодов и сока плодовых косточковых.

13.1. Организация контроля качества измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-(1 - 6).

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.

Величина добавки C_д должна удовлетворять условию:

где - характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно), мг/кг, при этом:

где - граница абсолютной погрешности, мг/кг;

где - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 3.1), %.

Результат контроля процедуры К_к рассчитывают по формуле:

где , , C_д - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11.) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки соответственно, мг/кг.

Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (К_к) с нормативом контроля (К).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию:

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов параллельных определений.

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:

где X₁, X₂ - результаты параллельных определений, мг/кг;

R - значение предела повторяемости (табл. 3.1), при этом .

При невыполнении условия выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

1. ГОСТ Р ИСО 5725 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

2. ГОСТ Р 53228 "Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания".

3. ГОСТ OIML R 111-1 "Государственная система обеспечения единства измерений".

4. ГОСТ 29227 "Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования".

5. ГОСТ 25336 "Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры".

6. ГОСТ 9737 "Посуда лабораторная стеклянная. Шлифы сферические взаимозаменяемые".

7. ГОСТ 21241 "Пинцеты медицинские. Общие технические требования и методы испытаний".

8. ГОСТ 12.1.004 "Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования".

9. ГОСТ 12.1.007 "Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности".

10. ГОСТ 12.1.018 "Система стандартов безопасности труда. Пожаровзрывобезопасность статического электричества. Общие требования".

11. ГОСТ 12.1.019 Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты.

12. ГОСТ 12.4.009 "Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание".

13. ГОСТ 1770 (ИСО 1042, ИСО 47880) "Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия".

14. Унифицированные правила отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов, утвержденные заместителем Главного государственного санитарного врача СССР от 21.08.1979 N 2051-79.

15. Методические указания по регистрационным испытаниям пестицидов в части биологической эффективности. Москва, 2018. 64 с.

16. ГОСТ 34340 "Персики и нектарины свежие. Технические условия".