"МУК 4.1.3924-23. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств бензовиндифлупира в кофе методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 03.07.2023)

1. Разработаны ФБУН "Федеральный центр гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана" Роспотребнадзора (Кузьмин С.В., Федорова Н.Е., Бондарева Л.Г.).

2. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 3 июля 2023 г.

3. Введены впервые.

1.1. Настоящие методические указания (далее - МУК) устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (далее - ВЭЖХ) для определения массовой концентрации бензовиндифлупира в кофе в диапазонах 0,01 - 0,2 мг/кг без учета разбавления и при разбавлении в 50 раз - 0,01 - 10 мг/кг.

1.2. МУК носят рекомендательный характер.

2.1. Бензовиндифлупир. N-[(1RS,4SR)-9-дихлорметилен)-1,2,3,4-тетрагидро-1,4-метаннафтален-5-ил]-3-дифторметил)-1-(метилпиразол)-4-карбоксамид <1>.

--------------------------------

<1> В соответствии с Международным союзом теоретической и прикладной химии (ИЮПАК, англ. International Union of Pure and Applied Chemistry, IUPAC).

Брутто-формула - C₁₈H₁₅C₁₂F₂N₃O. Молекулярная масса 398,2.

2.2. Физические и химические свойства: белый порошок без запаха. Температура плавления плюс (148,4 +/- 0,5) °C. Плотность 1,466. Давление паров - менее 3,2 x 10⁹ Па (плюс 25 °C). Растворимость в органических растворителях (при плюс 25 °C, в г/дм³): ацетон - 350, дихлорметан - 450, метанол - 76, гексан - 270, октанол - 19, этилацетат - 190, толуол - 48. Растворимость в воде при плюс 25 °C и pH 6,7 - 7,5 - 0,98 мг/дм³. Коэффициент распределения в системе н-октанол - вода K_owlogP = 4,3 +/- 0,3 (плюс 25 °C, pH 6,59). Гидролитически стабилен в стерильном буфере в темноте при pH 4, 5 и 9 до 5-ти дней (плюс 50 °C).

Бензовиндифлупир - фунгицид широкого спектра действия, принадлежащий к химическому классу пиразолкарбоксамидов.

3.1. При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 3.1 для соответствующих диапазонов концентраций.

4.1. Методика основана на определении вещества с помощью ВЭЖХ с ультрафиолетовым детектором.

4.2. Уровень бензовиндифлупира в кофе определяют после извлечения вещества из анализируемых образцов зерен кофе смесью ацетонитрила с водой (80:20 по объему), очистки и концентрирования на картридже, заполненном сорбционным материалом на основе сополимера N-винилпирролидона и дивинилбензола. Элюирование бензовиндифлупира проводят метанолом.

4.3. Нижний предел измерения бензовиндифлупира в анализируемом объеме пробы - 1 нг.

Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.

5.1. При выполнении измерений и подготовке проб применяют средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы, приведенные в табл. 5.1 - 5.3.

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующей дополнительной очистки растворителей.

Примечание. Допускается применение оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

6.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

6.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004.

6.3. Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист, имеющий опыт работы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений.

7.1. При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха плюс (15 - 30) °C и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

8.1. Очистка растворителей.

Ацетонитрил. Ацетонитрил кипятят с обратным холодильником над пентоксидом фосфора (на 1 дм³ ацетонитрила 20 г пентоксида фосфора) не менее 1 часа, после чего перегоняют, непосредственно перед употреблением ацетонитрил повторно перегоняют над прокаленным карбонатом калия (на 1 дм³ ацетонитрила 10 г карбоната калия). Хранят в емкости из темного стекла.

8.2. Подготовка подвижной фазы для ВЭЖХ.

В мерную колбу вместимостью 1000 см³ помещают 750 см³ ацетонитрила и 250 см³ бидистиллированной или деионизованной воды, перемешивают, фильтруют и дегазируют. Подвижную фазу хранят не более 30 дней.

8.3. Кондиционирование хроматографической колонки для ВЭЖХ. Промывают колонку подвижной фазой (приготовленной по п. 8.2) при скорости подачи растворителя 1,0 см³/мин до установления стабильной базовой линии.

8.4. Приготовление градуировочных растворов и растворов внесения.

8.4.1. Исходный раствор бензовиндифлупира для градуировки (концентрация 100 мкг/см³). В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают (0,0100 +/- 0,0005) г бензовиндифлупира, добавляют 50 - 70 см³ ацетонитрила, перемешивают, доводят ацетонитрилом до метки, вновь перемешивают. Раствор хранится в холодильнике (плюс 2 - 6 °C) не более 9 месяцев.

Растворы N 1 - 6 готовят объемным методом путем последовательного разбавления исходных растворов для градуировки.

8.4.2. Раствор N 1 бензовиндифлупира для градуировки и внесения (концентрация 10 мкг/см³).

В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 10 см³ исходного раствора бензовиндифлупира (п. 8.4.1) с концентрацией 100 мкг/см³, разбавляют ацетонитрилом до метки, перемешивают. Раствор N 1 хранится в холодильнике (плюс 2 - 6 °C) не более 6 месяцев.

8.4.3. Рабочие растворы N 2 - 6 бензовиндифлупира для градуировки (концентрация 0,05 - 1,0 мкг/см³). В 5 мерных колб вместимостью 100 см³ помещают 0,5; 1,0; 2,5; 5,0; и 10,0 см³ рабочего раствора N 1 с концентрацией 10,0 мкг/см³ (п. 8.4.2), доводят до метки подвижной фазой, приготовленной по п. 7.2, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы N 2 - 6 с концентрациями бензовиндифлупира 0,05, 0,1, 0,25, 0,5, 1,0 мкг/см³.

Растворы готовят при температуре плюс (20 - 25) °C, хранят в холодильнике при температуре плюс (4 - 6) °C не более трех месяцев.

8.5. Установление градуировочной характеристики. Градуировочную характеристику, выражающую линейную (с угловым коэффициентом) зависимость площади пика от концентрации бензовиндифлупира в растворе, устанавливают методом абсолютной калибровки по 5-ти растворам для градуировки.

В инжектор хроматографа вводят по 20 мм³ каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования, указанных ниже. Осуществляют не менее 3 параллельных измерений. Устанавливают площади пиков бензовиндифлупира, на основании которых строят градуировочную зависимость.

Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят в начале и по окончании каждой серии анализов.

При контроле стабильности градуировочной характеристики проводят анализ не менее двух образцов растворов для градуировки, содержание бензовиндифлупира в которых должно входить в диапазон концентраций от 0,05 до 1,00 мкг/см³. Градуировочная характеристика считается стабильной, если для каждого используемого для контроля градуировочного раствора сохраняется соотношение:

где X - концентрация бензовиндифлупира в пробе при контрольном измерении, мкг/см³;

C - известная концентрация градуировочного раствора бензовиндифлупира, взятая для контроля стабильности градуировочной характеристики, мкг/см³;

B - норматив контроля погрешности градуировочной характеристики, % (B = 10% при P = 0,95).

8.6. Приготовление смесей органических растворителей для экстракции.

8.6.1. Смесь ацетонитрил-вода = 8:2. В мерную колбу на 500 см³ вносят 400 см³ ацетонитрила и 100 см³ бидистиллированной воды. Тщательно перемешивают. Экстракционная смесь хранится при комнатной температуре не более 2-х недель.

8.6.2. Смесь ацетонитрил-вода = 2:8. В мерную колбу на 500 см³ вносят 100 см³ ацетонитрила и 400 см³ бидистиллированной воды. Тщательно перемешивают. Экстракционная смесь хранится при комнатной температуре не более 2-х недель.

8.7. Подготовка картриджа для очистки и концентрирования. Картридж устанавливают на аллонж с прямым отводом для вакуума. Промывают картридж последовательно 1 см³ метанола, 1 см³ ацетонитрила, затем три раза по 1 см³ смесью ацетонитрил-вода, в соотношении 2:8 по объему, приготовленной по п. 8.6.2. Процедуру проводят с использованием вакуума. Скорость элюирования - 15 - 20 капель в минуту. При работе следует не допускать высыхания верхнего слоя сорбента в картридже.

9.1. Отбор проб производится в соответствии с методическими документами <2>.

--------------------------------

<2> Унифицированные правила отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов, утвержденные заместителем Главного государственного санитарного врача СССР 21.08.1979 N 2051-79; ГОСТ ISO 4072 "Межгосударственный стандарт. Кофе зеленый в мешках. Отбор проб".

Пробы зерен кофе подсушивают и хранят при комнатной температуре не более 2 недель. Для длительного хранения образцы замораживают и хранят при температуре не выше минус 18 °C.

10.1. Образец измельченных зерен кофе (10 г) помещают в плоскодонную колбу вместимостью 250 - 300 см³, затем добавляют 100 см³ смеси ацетонитрил-вода, приготовленной в соответствии с п. 8.6.1, перемешивают. Оставляют в покое на 15 минут. После чего колбу со смесью помещают на встряхиватель и продолжают экстракцию в течение 30 минут. После встряхивания смесь фильтруют на воронке Бюхнера с помощью разрежения, создаваемого водоструйным насосом, через двойной бумажный фильтр низкой плотности. Образец повторно экстрагируют 50 см³ смеси ацетонитрил-вода, приготовленной в соответствии с п. 8.6.1, на ультразвуковой ванне в течение 15 минут, раствор фильтруют на воронке Бюхнера. Фильтраты объединяются и переносятся в круглодонную колбу объемом 250 см³. Упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 30 °C до водного остатка (15 - 20 см³). Водный остаток пропускают через подготовленный в соответствии с п. 8.7 картридж со скоростью 15 - 20 капель в минуту, используя разрежение, создаваемое водоструйным насосом. После пропускания пробы картридж четыре раза по 1 см³ промывают смесью ацетонитрил-вода в соотношением 2:8, приготовленной в соответствии с п. 8.6.2. Бензовиндифлупир элюируют с картриджа метанолом 2 раза по 1 см³. Элюат собирают в круглодонную колбу объемом 50 см³. Упаривают на ротационном испарителе при температуре не выше 30 °C до влажного остатка. Остаток в круглодонной колбе растворяют в 2 см³ подвижной фазы, приготовленной в соответствии с п. 8.2.2. Перед хроматографированием пробу дополнительно фильтруют через мембранный фильтр.

10.2. Условия хроматографирования. Измерения выполняют при следующих режимных параметрах:

- жидкостный хроматограф с быстросканирующим ультрафиолетовым детектором, снабженный дегазатором и термостатом колонки;

- хроматографическая колонка стальная длиной 250 мм, внутренним диаметром 4,6 мм, заполненная обращенно-фазным сорбентом с привитыми алкильными группами (C-18 или C-8) для удерживания гидрофильных соединений, зернением 5 мкм;

- рабочая длина волны: 254 нм;

- температура колонки: плюс 25 °C;

- подвижная фаза: ацетонитрил - деионизованная вода (75:25, по объему);

- скорость потока элюента: 1,0 см³/мин;

- объем вводимой пробы: 20 мм³;

- линейный диапазон детектирования: 1 - 20 нг.

Образцы, дающие пики, большие, чем градуировочный раствор бензовиндифлупира с концентрацией 1,0 мкг/см³, разбавляют смесью ацетонитрил - деионизированная вода (75:25 по объему), приготовленной в соответствии с п. 8.2, не более чем в 50 раз.

11.1. Содержание бензовиндифлупира в пробах (X, мг/кг) рассчитывают по формуле:

где V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, см³;

m - масса анализируемого образца, г;

C - концентрация бензовиндифлупира, найденная по градуировочному графику в соответствии с площадью хроматографического пика, мкг/см³;

Кр - кратность разбавления (если экстракт подвергался разбавлению).

Примечание. Идентификация и расчет концентрации вещества в пробах могут быть проведены с помощью компьютерной программы обработки хроматографических данных, включенной в аналитическую систему.

12.1. Результат анализа представляют в виде:

где - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

- граница абсолютной погрешности, мг/кг.

где - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 3.1), %.

Если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде: "Содержание бензовиндифлупира в кофе - менее 0,01 мг/кг" <3>.

--------------------------------

<3> 0,01 мг/кг - предел обнаружения бензовиндифлупира в кофе.

13.1. Контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-(1 - 6). Периодичность и формы контроля определяются руководством по качеству.

1. Федеральный закон от 30 марта 1999 г. N 52-ФЗ "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения".

2. ГОСТ Р ИСО 5725-(1 - 6) "Государственный стандарт Российской Федерации. Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

3. ГОСТ Р 53228 "Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания".

4. ГОСТ OIML R 111-1 "Межгосударственный стандарт. Государственная система обеспечения единства измерений. Гири классов E1, E2, F1, F2, M1, M1-2, M2, M2-3 и M3. Часть 1. Метрологические и технические требования".

5. ГОСТ 29227 "Межгосударственный стандарт. Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования".

6. ГОСТ Р 52501 "Вода для лабораторного анализа. Технические условия".

7. ГОСТ 6995 "Государственный стандарт Союза ССР. Метанол-яд. Технические условия".

8. ГОСТ 25336 "Межгосударственный стандарт. Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры".

9. ГОСТ 12.1.004 "Межгосударственный стандарт. Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования".

10. ГОСТ 12.1.007 "Межгосударственный стандарт. Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности".

11. ГОСТ 12.1.018 "Межгосударственный стандарт. Система стандартов безопасности труда. Пожаровзрывобезопасность статического электричества. Общие требования".

12. ГОСТ 12.1.019 "Межгосударственный стандарт. Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты".

13. ГОСТ 12.4.009 "Межгосударственный стандарт. Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание".

14. ГОСТ 1770 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) "Межгосударственный стандарт. Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия".

15. Унифицированные правила отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов, утвержденные заместителем Главного государственного санитарного врача СССР 21.08.1979 N 2051-79.

16. ГОСТ ISO 4072 "Межгосударственный стандарт. Кофе зеленый в мешках. Отбор проб".

17. ГОСТ 12026 "Межгосударственный стандарт. Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия".