"МУК 4.1.3734-21. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств фенпропидина в бананах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 28.12.2021)

1. Разработаны ФБУН "Федеральный научный центр гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана" Роспотребнадзора (В.Н. Ракитский, Н.Е. Федорова, Л.Г. Бондарева); ФГБОУ ДПО "Российская медицинская академия непрерывного профессионального образования" (И.З. Мустафина).

2. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 28 декабря 2021 г.

3. Введены впервые.

1.1. Настоящие методические указания (далее - МУК) устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (далее - ВЭЖХ) для определения в бананах массовой концентрации фенпропидина в диапазоне 0,01 - 0,2 мкг/кг.

1.2. МУК предназначены для органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, а также могут быть использованы организациями, осуществляющими исследования в области безопасности и качества пищевой продукции и продовольственного сырья.

1.3. МУК носят рекомендательный характер.

2.1. Фенпропидин. RS-1-[4-третбутилфенил)-2-метилпропил]пиперидин (IUPAC <1>). Эмпирическая формула: C₁₉H₃₁N. Молекулярная масса 273,5.

--------------------------------

<1> В соответствии с Международным союзом теоретической и прикладной химии (ИЮПАК, англ. International Union of Pure and Applied Chemistry, IUPAC).

2.2. Физические и химические свойства

Химически чистое вещество представляет собой бледно-желтую слегка вязкую жидкость без запаха. Давление пара (25 °C) 17 Па. Растворимость в воде (25 °C, мг/дм³): 530 (pH 7), 6,2 (pH 9). Легко смешивается с ацетоном, этанолом, толуолом, н-октаном и гексаном (25 °C). Стабилен при хранении в закрытом контейнере при комнатной температуре по крайней мере в течение 3 месяцев. Водные растворы устойчивы к воздействию УФ-света и гидролизу при 80 °C (pH 4,7 и 10). pK_a 10,1 (сильное основание). Коэффициент распределения в системе н-октанол-вода: K_owlog = 2,9 (pH 7,25 °C).

2.3. Область применения определяемого вещества. Фенпропидин является фунгицидом химического класса пиперидинов системного и профилактического действия. Механизм его действия заключается в ингибировании биосинтеза стиролов. Он особенно эффективен против таких болезнетворных микроорганизмов, как Erysiphe graminis, Rhynchosporium secalis и Puccinia.

3.1. При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 3.1 для соответствующих диапазонов концентраций (в соответствии с ГОСТ Р 5725).

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для всего диапазона измерений (n = 20) приведены в табл. 3.2.

--------------------------------

<*> 0,01 - 10 мг/кг при разбавлении в 50 раз.

4.1. Методика основана на определении вещества с помощью ВЭЖХ с ультрафиолетовым детектором.

4.2. Экстракцию фенпропидина из анализируемых проб бананов выполняют смесью ацетонитрила и воды, очистку экстракта проводят на картридже, заполненным пористым сорбентом на основе сополимера N-винилпирролидона и дивинилбензола. Нижний предел измерения фенпропидина в анализируемом объеме пробы - 1 нг.

4.3. Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.

5.1. При выполнении измерений и подготовке проб применяют средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы, приведенные в табл. 5.1 - 5.3.

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующей дополнительной очистки растворителей.

Примечание. Допускается применение оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

6.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

6.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004.

6.3. При работе с газами, находящимися в баллонах под давлением до 15 МПа (150 кгс/см²), необходимо соблюдать нормы и правила <2>. Запрещается открывать вентиль баллона, не установив в нем понижающий редуктор.

--------------------------------

<2> Приказ Ростехнадзора от 15.12.2020 N 536 "Об утверждении федеральных норм и правил в области промышленной безопасности "Правила промышленной безопасности при использовании оборудования, работающего под избыточным давлением" (зарегистрирован Минюстом России 31.12.2020, регистрационный N 61998).

6.4. Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист, имеющий опыт работы на жидкостном хроматографе, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений.

7.1. При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

8.1. Измерениям предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), приготовление подвижной фазы, кондиционирование хроматографической колонки, приготовление растворов, градуировочных растворов, растворов внесения, подготовка картриджа для очистки и концентрирования экстрактов, установление градуировочной характеристики.

8.2. Очистка ацетонитрила

Ацетонитрил кипятят с обратным холодильником над пентоксидом фосфора (на 1 дм³ ацетонитрила 20 г пентоксида фосфора) не менее 1 часа, после чего перегоняют. Непосредственно перед употреблением ацетонитрил повторно перегоняют над прокаленным карбонатом калия (на 1 дм³ ацетонитрила 10 г карбоната калия). Хранят в емкости из темного стекла.

8.3. Приготовление подвижной фазы для ВЭЖХ

8.3.1. Приготовление раствора ортофосфорной кислоты с массовой долей 0,2% (0,2%-й раствор). В мерную колбу вместимостью 1000 см³ помещают 500 см³ бидистиллированной или деионизованной воды, 2 см³ ортофосфорной кислоты, перемешивают, доводят до метки бидистиллированной или деионизованной водой и еще раз тщательно перемешивают.

8.3.2. Приготовление подвижной фазы. В мерную колбу вместимостью 1000 см³ помещают 600 см³ ацетонитрила и 400 см³ 0,2%-го раствора ортофосфорной кислоты, перемешивают, фильтруют и дегазируют.

Подвижную фазу хранят в темном месте (в емкости из темного стекла) не более 14 дней.

8.4. Кондиционирование хроматографической колонки для ВЭЖХ

Промывают колонку подвижной фазой (приготовленной по п. 8.3.2) при скорости подачи растворителя 0,5 см³/мин до установления стабильной базовой линии.

8.5. Приготовление градуировочных растворов и растворов внесения

8.5.1. Исходный раствор фенпропидина для градуировки (концентрация 100 мкг/см³). В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 0,0100 +/- 0,0005 г фенпропидина, растворяют в 50 - 60 см³ ацетонитрила, доводят ацетонитрилом до метки, тщательно перемешивают.

Раствор хранят в холодильнике при температуре плюс 2 - 6 °C не более месяца.

8.5.2. Рабочий раствор N 1 фенпропидина для градуировки и внесения (концентрация 10,0 мкг/см³). В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 10,0 см³ исходного градуировочного раствора с концентрацией 100,0 мкг/см³ (п. 8.5.1), доводят до метки ацетонитрилом, тщательно перемешивают, получают рабочий раствор N 1 с концентрацией фенпропидина 10,0 мкг/см³.

Раствор хранят в холодильнике при температуре плюс 2 - 6 °C не более месяца.

Этот раствор используют для приготовления проб с внесением при оценке полноты извлечения действующего вещества методом "внесено-найдено" и контроля качества результатов измерений методом добавок.

8.5.3. Рабочие растворы N 2 - 6 фенпропидина для градуировки (концентрация 0,1 - 1,0 мкг/см³). В 5 мерных колб вместимостью 100 см³ помещают 0,5; 1,0; 2,5; 5,0; 10 см³ рабочего раствора N 1 с концентрацией 10,0 мкг/см³ (п. 8.5.2), доводят до метки подвижной фазой, приготовленной по п. 8.3.2, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы N 2 - 6 с концентрациями фенпропидина 0,05; 0,1; 0,25; 0,5; 1,0 мкг/см³.

Растворы хранят в холодильнике при температуре плюс 2 - 6 °C не более суток.

8.6. Приготовление смесей органических растворителей для экстракции

8.6.1. Смесь ацетонитрил-вода в соотношении 8:2, по объему

В мерную колбу на 500 см³ вносят 400 см³ ацетонитрила и 100 см³ бидистиллированной воды. Тщательно перемешивают.

8.6.2. Смесь ацетонитрил-вода в соотношении 2:8, по объему

В мерную колбу на 500 см³ вносят 100 см³ ацетонитрила и 400 см³ бидистиллированной воды. Тщательно перемешивают.

8.7. Подготовка картриджа для очистки и концентрирования

Картридж устанавливают на аллонж с прямым отводом для вакуума. Промывают картридж последовательно 1 см³ метанола, 1 см³ ацетонитрила, затем три раза по 1 см³ смеси ацетонитрил-вода в соотношении 2:8 по объему, приготовленной по п. 8.6.2. Процедуру проводят с использованием вакуума. Скорость элюирования 15 - 20 капель в минуту. Не допускать высыхания верхнего слоя сорбента в картридже.

8.8. Установление градуировочной характеристики

Градуировочную характеристику, выражающую линейную (с угловым коэффициентом) зависимость площади пика от концентрации фенпропидина в растворе, устанавливают методом абсолютной калибровки по 5 растворам для градуировки.

В инжектор хроматографа вводят по 20 мм³ каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования, указанных ниже. Осуществляют не менее 3 параллельных измерений. Устанавливают площади пиков фенпропидина, на основании которых строят градуировочную зависимость.

Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят в начале и по окончании каждой серии анализов.

При контроле стабильности градуировочной характеристики проводят не менее двух образцов растворов для градуировки, содержание фенпропидина в которых должно охватывать весь диапазон концентраций от 0,05 до 1,00 мкг/см³. Градуировочная характеристика считается стабильной, если для каждого из используемого для контроля градуировочного раствора сохраняется соотношение:

где X - концентрация фенпропидина в пробе при контрольном измерении, мкг/см³;

C - известная концентрация градуировочного раствора фенпропидина, взятая для контроля стабильности градуировочной характеристики, мкг/см³;

B - норматив контроля погрешности градуировочной характеристики, % (B = 10% при P = 0,95).

Если величина расхождения (A) превышает 10%, делают вывод о невозможности применения градуировочной характеристики для дальнейших измерений. В этом случае выясняют и устраняют причины нестабильности градуировочной характеристики и повторяют контроль ее стабильности. При повторном обнаружении нестабильности градуировочной характеристики устанавливают ее заново.

9.1. Отбор проб осуществляют в соответствии с ГОСТ Р 51603.

9.2. Образцы бананов замораживают и хранят при температуре не выше минус 18 °C.

10.1. Бананы. Навеску образца бананов, массой 10 г, помещают в коническую колбу объемом 250 см³. Добавляют 50 см³ смеси ацетонитрил-вода в соотношении 8:2, приготовленной согласно п. 8.6.1. Перемешивают и помещают на встряхиватель на 30 минут. После чего смеси дают отстояться. Раствор осторожно (для предотвращения взмучивания) фильтруется через неплотный бумажный фильтр. Осадок в колбе заливают 30 см³ смеси ацетонитрил-вода (8:2), приготовленной согласно п. 8.6.1.

Экстрагируется в течение 15 минут на встряхивателе. После отстаивания раствор фильтруют через неплотный бумажный фильтр. Фильтраты объединяются и переносятся в круглодонную колбу объемом 250 см³. Упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 30 °C до водного остатка. Водный остаток пропускают через подготовленный в соответствии с п. 8.7 картридж со скоростью 15 - 20 капель в минуту. После пропускания пробы картридж четыре раза по 1 см³ промывают смесью ацетонитрил-вода в соотношении 2:8, приготовленной в соответствии с п. 8.6.2.

Фенпропидин элюируют с картриджа ацетонитрилом 2 раза по 1 см³. Элюат собирают в круглодонную колбу объемом 50 см³. Упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 30 °C до влажного остатка. Остаток в круглодонной колбе растворяют в 2 см³ смеси ацетонитрил-вода в соотношении 8:2, приготовленной в соответствии с п. 8.6.1.

10.2. Условия хроматографирования. Измерения выполняют при следующих режимных параметрах:

- жидкостный хроматограф с быстросканирующим ультрафиолетовым детектором, снабженный дегазатором и термостатом колонки;

- хроматографическая колонка стальная длиной 250 мм, внутренним диаметром 4,6 мм, заполненная обращенно-фазным сорбентом с привитыми алкильными группами (C-18 или C-8) для удерживания гидрофильных соединений, зернением 5 мкм;

- рабочая длина волны 220 нм;

- температура колонки 30 °C;

- подвижная фаза: ацетонитрил-0,2% ортофосфорная кислота (60:40, по объему);

- скорость потока элюента 0,5 см³/мин;

- объем вводимой пробы 20 мм³;

- линейный диапазон детектирования 1 - 20 нг.

Образцы, дающие пики, большие, чем градуировочный раствор с концентрацией 1,0 мкг/см³, разбавляют подвижной фазой (не более чем в 50 раз). Диапазон измеряемых концентраций с учетом разбавления в 50 раз 0,01 - 10 мг/кг.

11.1. Содержание фенпропидина в пробах бананов (X, мг/кг) рассчитывают по формуле:

где C - концентрация фенпропидина, полученная по градуировочному графику в соответствии с площадью хроматографического пика, мкг/см³;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, см³;

m - масса анализируемого образца, г;

K - коэффициент, учитывающий кратность разбавления образца (при необходимости).

11.2. Проверка приемлемости результатов параллельных определений. За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

где X₁, X₂ - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости (табл. 3.1), при этом .

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

12.1. Результат анализа представляют в виде:

где - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

- граница абсолютной погрешности, мг/кг;

где - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 3.1), %.

Если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде: "Содержание фенпропидина в пробе бананов - менее 0,01 мг/кг" <3>.

--------------------------------

<3> 0,01 мг/кг - предел обнаружения фенпропидина в бананах.

13.1. Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1 - 6.

13.2. Контроль стабильности градуировочной характеристики

Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят в начале и по окончании каждой серии анализов.

При контроле стабильности градуировочной характеристики проводят измерения не менее двух градуировочных растворов, содержание фенпропидина в которых должно входить в диапазон линейности градуировочной характеристики от 0,05 до 1,0 мкг/см³.

Градуировочная характеристика считается стабильной, если для каждого используемого для контроля градуировочного раствора сохраняется соотношение:

где X - концентрация фенпропидина в пробе при контрольном измерении, мкг/см³;

C - известная концентрация градуировочного раствора фенпропидина, взятая для контроля стабильности градуировочной характеристики, мкг/см³;

B - норматив контроля погрешности градуировочной характеристики, % (B = 10% при P = 0,95).

Если величина расхождения (A) превышает 10%, делают вывод о невозможности применения градуировочной характеристики для дальнейших измерений. В этом случае выясняют и устраняют причины нестабильности градуировочной, характеристики и повторяют контроль ее стабильности с использованием других градуировочных растворов фенпропидина, предусмотренных методикой измерения. При повторном обнаружении нестабильности градуировочной характеристики устанавливают ее заново согласно п. 8.8.

13.3. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.

Величина добавки C_д должна удовлетворять условию:

где - характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно), мг/кг, при этом:

где - граница абсолютной погрешности, мг/кг;

где - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 3.1), %.

Результат контроля процедуры К_к рассчитывают по формуле:

где , , C_д - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11.2) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки, соответственно, мг/кг.

Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (К_к) с нормативом контроля (К).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию:

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (7) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (7) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.4. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости

Расхождение между результатами измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), не должно превышать предела воспроизводимости (R):

где X₁, X₂ - результаты измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), мг/кг;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 3.1, 3.2), %.

1. Федеральный закон от 30.03.1999 N 52-ФЗ "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения".

2. Приказ Ростехнадзора от 15.12.2020 N 536 "Об утверждении федеральных норм и правил в области промышленной безопасности "Правила промышленной безопасности при использовании оборудования, работающего под избыточным давлением".

3. ГОСТ Р 53228 "Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания".

4. ГОСТ 1770 "Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия".

5. ГОСТ OIML R 111-1 "Государственная система обеспечения единства измерений (ГСИ). Гири классов E(1), E(2), F(1), F(2), M(1), M(1-2), M(2), M(2-3) и M(3). Часть 1. Метрологические и технические требования".

6. ГОСТ 29227 "Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования".

7. ГОСТ 52501 "Вода для лабораторного анализа. Технические условия".

8. ГОСТ 4221 "Реактивы. Калий углекислый. Технические условия".

9. ГОСТ 6995 "Реактивы. Метанол-яд. Технические условия".

10. ГОСТ 61 "Реактивы. Кислота уксусная. Технические условия".

11. ГОСТ 25336 "Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры".

12. ГОСТ 12026 "Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия".

13. ГОСТ 12.1.007 "Система стандартов безопасности труда (ССБТ). Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности".

14. ГОСТ 12.1.019 "Система стандартов безопасности труда (ССБТ). Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты".

15. ГОСТ 12.1.004 "Система стандартов безопасности труда (ССБТ). Пожарная безопасность. Общие требования".

16. ГОСТ 12.4.009 "Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание".

17. ГОСТ Р 51603 "Бананы свежие. Технические условия".

18. ГОСТ Р ИСО 5725-(1 - 6) "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".