"МУК 4.1.3874-23. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств металаксила в луке, ягодах и соке винограда методом капиллярной газожидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 26.06.2023)

1. Разработаны ФГБНУ "Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений" (Долженко В.И., Цибульская И.А., Павлова В.Ф.).

2. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 26 июня 2023 г.

3. Введены впервые.

1.1. Настоящие методические указания (далее - МУК) устанавливают порядок применения метода капиллярной газожидкостной хроматографии (далее - ГЖХ) для определения остаточных количеств металаксила в луке, ягодах и соке винограда в диапазоне концентраций от 0,2 до 2,0 мг/кг включительно.

1.2. МУК носят рекомендательный характер.

2.1. Металаксил.

Название действующего вещества по ИЮПАК: метиловый эфир N-(2-метокси-ацетил)-H-(2,6-ксилил)-DL-аланина.

Структурная формула представлена на рисунке 1.

Бесцветное кристаллическое вещество без запаха. Температура плавления: плюс 67,9 °C. Давление паров при 25 °C: 0,75 мПа. Коэффициент распределения н-октанол/вода: K_OW log P = 1,65. Растворимость (г/дм³) при плюс 20 °C: вода - 7,1; н-гексан - 9,1; бензол - 550; метанол - 650; дихлорметан - 750.

Вещество устойчиво к фотолизу и гидролизу в кислых и нейтральных условиях (DT₅₀ > 200 дней), в щелочных условиях (pH 9) DT₅₀ = 115 дней.

В биологически активных почвах в аэробных условиях металаксил разлагается со средним значением DT₅₀ = 42 - 46 дней.

2.2. Острая пероральная токсичность (LD₅₀) для крыс - 633 мг/кг; острая дермальная токсичность (LD₅₀) для крыс > 3100 мг/кг; острая ингаляционная токсичность (LC₅₀) для крыс - 3600 мг/м³ воздуха. LC₅₀ для рыб > 100 мг/дм³ (96 ч). Фунгицид нетоксичен для птиц, пчел и дождевых червей.

2.3. Металаксил - системный фунгицид защитного и искореняющего действия из класса фениламидов. Высокоэффективен против возбудителей фитофтороза картофеля и томатов, мильдью винограда, ложной мучнистой росы и корнееда овощных культур, сахарной свеклы и подсолнечника, увядания растений кукурузы.

Применяется в Российской Федерации в составе смесевых препаратов с фунгицидами защитного действия для двух-трехкратной обработки посевов овощных культур, картофеля и винограда в течение вегетационного периода с нормой расхода 0,1 - 0,2 кг/га.

3.1. При соблюдении всех условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в таблице 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

4.1. Определение металаксила основано на экстракционном извлечении определяемого компонента (из проб лука и ягод винограда водно-ацетоновым раствором, из сока винограда - хлористым метиленом) и очистке экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей, а также на патроне для твердофазной экстракции и последующем анализе экстракта методом капиллярной ГЖХ с использованием термоионного детектора.

Идентификация металаксила проводится по времени удерживания, количественное определение - методом абсолютной калибровки.

Избирательность метода обеспечивается сочетанием условий подготовки проб и хроматографирования.

5.1. Средства измерений:

- газовый хроматограф с термоионным детектором и кварцевой капиллярной колонкой длиной 30 м, длиной 30 м, внутренним диаметром 0,25 мм с толщиной слоя неподвижной фазы (35% дифенилсилоксана + 65% диметилсилоксана) - 0,25 мкм;

- весы аналитические с пределом взвешивания до 81/210 г и пределом допускаемой погрешности 0,1/0,3 мг, ГОСТ Р 53228;

- весы технические с пределом взвешивания до 150 г и пределом допускаемой погрешности 5 мг, ГОСТ Р 53228;

- колбы мерные на 25, 50, 100, 250 и 1000 см³, ГОСТ 1770;

- микрошприц МШ-10 на 10 мм³ с ценой деления 0,2 мм³;

- пипетки градуированные объемом 1, 2, 5 и 10 см³, ГОСТ 29227;

- цилиндры мерные на 25, 50 и 100 см³, ГОСТ 1770.

3.2. Реактивы:

- металаксил, аналитический стандарт с содержанием основного вещества 99,0%;

- ацетон, особой чистоты;

- азот особой чистоты в баллонах с редуктором, ГОСТ 9293;

- вода для лабораторного анализа (деионизованная, бидистиллированная), ГОСТ Р 52501;

- н-Гексан, химически чистый;

- метилен хлористый (дихлорметан), химически чистый;

- натрия гидроксид, химически чистый, ГОСТ 4328;

- натрий сернокислый безводный, химически чистый, ГОСТ 4166;

- натрия хлорид, химически чистый, ГОСТ 4233;

- этиловый эфир уксусной кислоты (этилацетат), химически чистый, ГОСТ 22300.

3.3. Вспомогательные устройства, материалы:

- вакуумный манипулятор для работы с патронами для твердофазной экстракции;

- ванна ультразвуковая с рабочей частотой 35 кГц;

- воронки делительные вместимостью 250 см³, ГОСТ 25336;

- воронки лабораторные, стеклянные, ГОСТ 25336;

- генератор водорода;

- колбы круглодонные на шлифе вместимостью 10, 50, 100 см³, ГОСТ 9737;

- колбы плоскодонные на шлифе вместимостью 100, 250 см³, ГОСТ 9737;

- морозильная камера, поддерживающая температуру минус 18 °C;

- патроны концентрирующие для твердофазной экстракции, заполненные гидрофильным слабокислотным сорбентом на основе силикагеля, объем 1 мл;

- ротационный вакуумный испаритель с мембранным насосом, обеспечивающим вакуум до 10 мбар;

- устройство перемешивающее (50 - 200 колебаний в мин);

- фильтры бумажные средней плотности;

- холодильник, поддерживающий температуру плюс (0 - 4) °C;

- шприц медицинский инъекционный однократного применения на 10 см³, ГОСТ Р ИСО 7886-1.

5.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на комплекс жидкостного хроматографа.

5.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать гигиенических нормативов <1>. Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004.

--------------------------------

<1> СанПиН 1.2.3685-21 "Гигиенические нормативы и требования к обеспечению безопасности и (или) безвредности для человека факторов среды обитания", утвержденные постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 28.01.2021 N 2 (зарегистрировано Минюстом России 29.01.2021 N 62296).

6.1. К выполнению измерений и обработке их результатов допускаются специалисты, имеющие опыт работы в химической лаборатории, прошедшие обучение и владеющие техникой проведения анализа, освоившие метод анализа в процессе тренировки и уложившиеся в нормативы контроля при проведении процедуры контроля погрешности анализа.

7.1. При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха плюс (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на газовом хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

8.1. Подготовка органических растворителей.

Перед началом работы рекомендуется проверить чистоту применяемых растворителей. Для этого 100 см³ растворителя упаривают на ротационном испарителе при температуре плюс 40 °C до объема 1,0 см³ и хроматографируют. При обнаружении мешающих определению примесей очистку растворителей производят в соответствии с общепринятыми методиками.

8.2. Приготовление растворов.

8.2.1. Приготовление раствора гидроксида натрия с молярной концентрацией 0,02 моль/дм³ (0,02 М раствор). Растворяют (0,80 +/- 0,05) г гидроксида натрия в 70 - 100 см³ деионизованной воды, затем раствор переносят в мерную колбу вместимостью 1000 см³ и доводят объем раствора до метки деионизованной водой. Раствор хранят при комнатной температуре не более 1 месяца.

8.2.2. Приготовление насыщенного раствора хлористого натрия. 380 г NaCl растворяют при нагревании в 1000 см³ деионизованной воды, фильтруют через бумажный фильтр и охлаждают до комнатной температуры. Раствор хранят при комнатной температуре не более 3 месяцев.

8.2.3. Для приготовления элюента N 1 (смесь гексан-этилацетат 95:5) в колбе на 100 см³ смешивают 95 см³ гексана и 5 см³ этилацетата. Используется в день приготовления.

8.2.4. Для приготовления элюента N 2 (смесь гексан-этилацетат 1:1) в колбе на 100 см³ смешивают 50 см³ гексана и 50 см³ этилацетата. Используется в день приготовления.

8.2.5. Для приготовления элюента N 3 (смесь гексан-этилацетат 7:3) в колбе на 100 см³ смешивают 70 см³ гексана и 30 см³ этилацетата. Используется в день приготовления.

8.2.6. Приготовление раствора ацетон-вода (8:2, по объему). В колбе на 1000 см³ смешивают 800 см³ ацетона и 200 см³ воды. Используется в день приготовления.

8.3. Кондиционирование хроматографической колонки.

Капиллярную кварцевую колонку устанавливают в термостат хроматографа и, не подсоединяя к детектору, кондиционируют при температуре плюс 280 °C и скорости газа-носителя 2 см³/мин в течение 8 - 10 часов.

8.4. Приготовление градуировочных растворов и раствора внесения.

8.4.1. Исходный градуировочный раствор металаксила с массовой концентрацией 100 мкг/см³.

В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают (0,0100 +/- 0,0001) г металаксила, растворяют в 40 - 50 см³ ацетона, доводят объем раствора этим же растворителем до метки, тщательно перемешивают.

Раствор хранят в холодильнике при температуре не выше плюс 4 °C не более 3 месяцев.

8.4.2. Градуировочный раствор металаксила с массовой концентрацией 10 мкг/см³ (раствор N 1). В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 10 см³ исходного градуировочного раствора металаксила с массовой концентрацией 100 мкг/см³ (п. 8.4.1), доводят объем раствора до метки гексаном, тщательно перемешивают. Этот раствор используют для приготовления градуировочных растворов N 2 - 4.

Градуировочный раствор N 1 хранят в холодильнике при температуре не выше плюс 4 °C не более месяца.

8.4.3. Градуировочные растворы металаксила с массовой концентрацией 1,0 - 5,0 мкг/см³ (растворы N 2 - 4).

В 3 мерные колбы вместимостью 25 см³ помещают 2,5; 5,0; 12,5 см³ градуировочного раствора металаксила N 1 с массовой концентрацией 10 мкг/см³ (п. 8.4.2), доводят до метки гексаном, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы N 2 - 4 с концентрацией металаксила 1,0; 2,0 и 5,0 мкг/см³, соответственно.

Для приготовления проб с внесением при оценке полноты извлечения металаксила из исследуемых образцов готовят ацетоновый раствор металаксила с концентрацией 5 мкг/см³. Для этого 2,5 см³ исходного градуировочного раствора металаксила с массовой концентрацией 100 мкг/см³ (п. 8.4.1) помещают в мерную колбу на 50 см³ и доводят до метки ацетоном.

Растворы готовят непосредственно перед использованием.

8.5. Установление градуировочной характеристики.

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика от концентрации металаксила в растворе (мкг/см³), устанавливают методом абсолютной калибровки по не менее, чем 4-м растворам для градуировки.

В инжектор хроматографа вводят по 1 мм³ каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 11.3. Осуществляют не менее 3-х параллельных измерений.

Градуировку признают удовлетворительной, если значение коэффициента линейной корреляции оказывается не ниже 0,99.

Градуировочную характеристику следует проверять перед началом измерений, а также при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы.

Если результат проверки градуировочной характеристики отрицательный (), проводят повторное измерение, заменив контрольный раствор. При повторном получении отрицательного результата градуировочный график строят заново, при этом выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам.

Градуировочную зависимость признают стабильной при выполнении следующего условия:

где C - аттестованное значение массовой концентрации определяемого компонента в градуировочном растворе, мкг/см³,

C_К - результат контрольного измерения массовой концентрации определяемого компонента в градуировочном растворе, мкг/см³,

- норматив контроля градуировочного коэффициента, % ( при P = 0,95).

8.6. Подготовка концентрирующего патрона для очистки экстракта.

Концентрирующий патрон промывают сначала с помощью медицинского шприца 2 см³ смеси гексан-этилацетат (1:1, по объему), а затем 4 см³ смеси гексан-этилацетат (95:5, по объему) со скоростью 1 - 2 капли в секунду.

8.7. Проверка хроматографического поведения металаксила на концентрирующем патроне.

В круглодонную колбу вместимостью 10 см³ градуированной пипеткой помещают 0,5 см³ градуировочного раствора N 1 металаксила с концентрацией 10 мкг/см³ в гексане (п. 7.4.2). Растворитель упаривают досуха на роторном испарителе при температуре не выше 40 °C, остаток растворяют в 2 см³ смеси гексан-этилацетат (95:5, по объему), помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин. Раствор наносят на патрон, подготовленный по п. 8.6. Промывают патрон 5 см³ смеси гексан-этилацетат (7:3, по объему) со скоростью 1 - 2 капли в секунду, элюат отбрасывают. Затем через патрон пропускают 10 см³ смеси гексан-этилацетат (1:1, по объему), отбирая последовательно по 2 см³ элюата непосредственно в круглодонные колбы. Растворы в колбах упаривают досуха при температуре не выше плюс 40 °C, остатки растворяют в 2 см³ гексана, помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин, и растворы анализируют на содержание металаксила по п. 10.3.

По результатам обнаружения металаксила в каждой из фракций определяют объем смеси гексан-этилацетат (1:1, по объему), необходимый для полного вымывания металаксила из патрона.

9.1. Отбор проб производится в соответствии с методическими документами <2>.

--------------------------------

<2> Унифицированные правила отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов, утвержденные заместителем Главного государственного санитарного врача СССР 21.08.1979 N 2051-79.

Пробы ягод винограда и лука хранят до анализа в герметично закрытом двойном полиэтиленовом пакете в морозильной камере при температуре не выше минус 18 °C в течение 6 месяцев. Пробы виноградного сока хранят в холодильнике при температуре плюс (0 - 4) °C в стеклянной таре с притертой пробкой в течение недели.

10.1. Экстракция и очистка.

10.1.1. Ягоды винограда, лук. Измельченный образец массой 10 г помещают в плоскодонную колбу вместимостью 100 см³, добавляют 50 см³ смеси ацетон-вода (8:2, по объему) и экстрагируют на встряхивателе 15 мин. Пробам дают отстояться, затем надосадочную жидкость фильтруют через бумажный фильтр средней плотности. Растительный остаток экстрагируют еще дважды 30 см³ смеси ацетон-вода (8:2, по объему). Объединенный отфильтрованный экстракт переносят в колбу для упаривания на 250 см³ и упаривают на ротационном вакуумном испарителе до водного остатка при температуре не выше 40 °C. Водный остаток переносят в делительную воронку вместимостью 250 см³. Колбу ополаскивают 10 см³ деионизованной воды, которую также переносят в делительную воронку. В воронку вносят 20 см³ насыщенного раствора хлористого натрия и 30 см³ хлористого метилена и содержимое интенсивно встряхивают в течение 2 мин. После разделения фаз нижний дихлорметановый слой собирают. Операцию экстракции водной фазы повторяют еще дважды, используя 30 и 20 см³ хлористого метилена. Объединенную дихлорметановую фракцию, помещенную в делительную воронку, промывают трижды 20 см³ 0,02 М раствора гидроксида натрия, интенсивно встряхивая смесь в делительной воронке в течение 2 мин. После разделения фаз нижний дихлорметановый слой фильтруют через слой безводного сульфата натрия в круглодонную колбу вместимостью 100 см³ и упаривают досуха на роторном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C. Далее проводят очистку экстракта по п. 10.2.

10.1.2. Виноградный сок. Пробу сока массой 10 г помещают в коническую колбу вместимостью 100 см³, добавляют 20 см³ деионизованной воды и 20 см³ насыщенного раствора хлористого натрия. После перемешивания водный раствор переносят в делительную воронку вместимостью 250 см³. В делительную воронку приливают 30 см³ хлористого метилена и содержимое интенсивно встряхивают в течение 2 мин. После разделения фаз нижний дихлорметановый слой собирают. Операцию экстракции водной фазы повторяют еще дважды, используя 30 и 20 см³ хлористого метилена. Объединенную дихлорметановую фракцию, помещенную в делительную воронку, промывают трижды 20 см³ 0,02 М раствора гидроксида натрия, интенсивно встряхивая смесь в делительной воронке в течение 2 мин. После разделения фаз нижний дихлорметановый слой фильтруют через слой безводного сульфата натрия в круглодонную колбу вместимостью 100 см³ и упаривают досуха на роторном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C. Далее проводят очистку экстракта по п. 10.2.

10.2. Очистка экстракта на концентрирующем патроне.

Остаток в круглодонной колбе, полученный по п. 10.1.1 и 10.1.2, растворяют в 2 см³ смеси гексан-этилацетат (95:5, по объему), помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин. Раствор наносят на подготовленный концентрирующий патрон (п. 8.6). Колбу обмывают еще 1 см³ смеси гексан-этилацетат (95:5, по объему), которые также наносят на патрон. Патрон промывают 5 см³ смеси гексан-этилацетат (7:3, по объему) со скоростью 1 - 2 капли в секунду, элюат отбрасывают. Металаксил элюируют 6 см³ смеси гексан-этилацетат (1:1, по объему) в круглодонную колбу вместимостью 50 см³ и раствор упаривают досуха на роторном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C. Остаток экстрактов растворяют в 2 см³ гексана, помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин, и анализируют на содержание металаксила по п. 10.3.

10.3. Условия хроматографирования.

Количественное определение металаксила проводят на газовом хроматографе с термоионным детектором (далее - ТИД). Хроматографическая кварцевая капиллярная колонка длиной 30 м, внутренним диаметром 0,32 мм с толщиной слоя неподвижной фазы (35% дифенилсилоксана + 65% диметилсилоксана) - 0,25 мкм. Температура: детектора - 320 °C. Температура испарителя - 280 °C. Температуру термостата колонки программировали от 150 °C (1 мин) со скоростью 25 градусов в минуту до температуры 280 °C (5 мин). Расход газов: газа-носителя (азот) - 2,0 см³/мин; водорода - 3,0 см³/мин; воздуха - 60 см³/мин; поддув в ТИД - 10 см³/мин. Объем пробы, вводимый в хроматограф 1 мм³.

11.1. Содержание металаксила в пробе (X, мг/кг) рассчитывают методом абсолютной калибровки по формуле:

где C - концентрация металаксила, найденная по градуировочной характеристике в соответствии с величиной площади хроматографического пика, мкг/см³;

f - полнота извлечения металаксила, приведенная в таблице 2, %;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, см³;

P - масса анализируемого образца, г (10 г).

Образцы, дающие пики большие, чем градуировочный раствор с концентрацией 10,0 мкг/см³, разбавляют гексаном.

12.1. За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:

где X₁, X₂ - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости (приведен в таблице 1).

При невыполнении условия выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

13.1. Результат анализа представляют в виде:

где: - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

- граница абсолютной погрешности, мг/кг;

- граница относительной погрешности методики (показатель точности, приведен в таблице 1), %.

В случае, если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

Например: менее 0,2 мг/кг*, где * - 0,2 мг/кг - предел определения металаксила в ягодах винограда.

13.1. Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-(1 - 6).

13.2. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.3. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

Величина добавки должна удовлетворять условию:

где - характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой, соответственно), мг/кг; при этом:

где - граница абсолютной погрешности, мг/кг (мг/дм³):

- граница относительной погрешности методики (приведен в таблице 1), %.

Результат контроля процедуры К_к рассчитывают по формуле:

где , , - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 12.1) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки, соответственно, мг/кг.

Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (К_к) с нормативом контроля (К).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию:

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (3) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (3) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.

13.4. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости:

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

где X₁, X₂ - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;

R - предел воспроизводимости (приведен в таблице 1), %.