"МУК 4.1.3665-20. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение синтетических красителей методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 29.10.2020)

1. Разработаны ФБУЗ "Федеральный центр гигиены и эпидемиологии" Роспотребнадзора (В.Ю. Ананьев, О.В. Андросова, А.А. Гарбузова, М.В. Зароченцев, А.А. Константинов, И.П. Семенова, И.С. Шумилина, М.М. Дударев).

2. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 29 октября 2020 г.

3. Введены впервые.

1.1. Настоящие методические указания (далее - МУК) устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (далее - ВЭЖХ) для определения синтетических пищевых красителей (далее - СПК) в пищевой продукции в диапазоне 5 - 600 мг/кг.

1.2. МУК предназначены для органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, осуществляющих контроль качества и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов, а также могут быть использованы организациями, аккредитованными в установленном порядке на проведение исследований продовольственного сырья, пищевых продуктов.

1.3. МУК носят рекомендательный характер.

2.1. Методика основана на определении вещества методом ВЭЖХ с диодно-матричным детектором. Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.

3.1. При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Полнота извлечения веществ, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для всего диапазона измерений (n = 20) приведены в табл. 2.

Примечание. Допускается применение других средств измерений, вспомогательного оборудования, не уступающих вышеуказанным по метрологическим и техническим характеристикам, а также посуды, реактивов и материалов, по качеству не хуже вышеуказанных.

5.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007.

5.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004.

5.3. Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист, имеющий опыт работы в химической лаборатории, освоившие данную методику и подтвердившие экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля точности измерений.

6.1. Отбор проб пищевой продукции проводят с учетом требований нормативно-технической документации на конкретный вид пищевого продукта.

7.1. При выполнении измерений соблюдают следующие условия: температуре воздуха от 15 °C до 25 °C, относительная влажность не более 80% (условия измерений должны соответствовать требованиям, изложенным в паспортах или иных документах на используемое оборудование и материалы).

8.1. При подготовке к выполнению измерений проводят следующие работы:

- приготовление растворов;

- построение градуировочного графика;

- отбор и подготовка проб к анализу.

8.2. Подготовка посуды и реактивов: используемую для отбора, хранения и измерения проб посуду сначала ополаскивают водопроводной водой, далее моют небольшим количеством концентрированной серной кислоты, затем тщательно промывают водопроводной водой, чтобы избавиться от следов кислоты, ополаскивают не менее трех раз водой по ГОСТ Р 52501 и ацетонитрилом для ВЭЖХ.

8.3. Приготовление растворов.

8.3.1. Раствора ацетата аммония с концентрацией 100 ммоль/дм³.

Взвешивают (7,70 +/- 0,01) г ацетата аммония, переносят в мерную колбу вместимостью 1000 см³, растворяют в дистиллированной воде, доводят объем водой до метки и перемешивают. Перед использованием раствор дегазируют и фильтруют через фильтр с диаметром пор 0,45 мкм.

Срок годности полученного раствора - не более трех дней при условии визуального отсутствия нерастворимых веществ.

8.4. Приготовление градуировочных растворов.

8.4.1. Основной раствор смеси СПК (100 мг/дм³) готовят, взвешивая по (0,025 +/- 0,001) г каждого СПК, переносят в мерную колбу вместимостью 250 см³ и доводят до метки водой.

Полученный раствор необходимо хранить при температуре от 2 до 8 °C - не более двух-трех недель.

8.4.2. Рабочие градуировочные растворы.

Из основного раствора смеси СПК в мерную колбу отбирают аликвоту в соответствии с табл. 3, доводят до метки водой и перемешивают. Градуировочные растворы используют свежеприготовленными.

8.4.3. Значение массовой концентрации каждого СПК определяют по приготовленным рабочим растворам с помощью спектрофотометра. Отдельно для каждого СПК готовят индивидуальные растворы с массовой концентрацией 100 мг/дм³, которые затем разбавляют - для красителей тартразин (E102), желтый "солнечный закат" FCF (E110), желтый хинолиновый (E104), азорубин (E122) и индигокармин (E132) используют рабочие растворы массовой концентрации 10 мг/дм³, для красителей понсо 4R (E124), красный очаровательный AC (E129), синий патентованный V (E131) и бриллиантовый голубой FCF (E133) - растворы массовой концентрации 1 мг/дм³.

С использованием спектрофотометра регистрируют спектр поглощения соответствующего рабочего раствора красителя относительно воды в диапазоне длин волн 200 - 800 нм. По значению оптической плотности в максимуме поглощения (табл. 4) вычисляют фактическое значение массовой концентрации рабочего раствора C_раб, мг/дм³, по формуле:

1000 - коэффициент перевода граммов в миллиграммы;

A - оптическая плотность раствора красителя в максимуме поглощения;

M - молярная масса красителя (см. табл. 6), г/моль;

- молярный коэффициент поглощения красителя (см. табл. 6), моль^-1·см^-1·дм³;

L - толщина слоя раствора в кювете, см.

Фактическое значение массовой концентрации СПК в исходном растворе C_исх, мг/дм³ вычисляют по формуле:

C_раб - фактическое значение массовой концентрации рабочего раствора красителя, вычисленное по формуле (1), мг/дм³;

K_разб - коэффициент разбавления индивидуального раствора красителя при приготовлении рабочего раствора по п. 8.4.3.

8.5. Установление градуировочной характеристики.

8.5.1. Для построения градуировочной характеристики осуществляют не менее 3 параллельных измерений градуировочных растворов. Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика от концентрации СПК в растворе, устанавливают методом абсолютной калибровки по 5 градуировочным растворам.

8.5.2. Контроль стабильности градуировочной характеристики.

Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят в начале каждой новой серии проб, используя свежеприготовленный градуировочный раствор N 4. Результаты контроля стабильности градуировочной характеристики признаются удовлетворительными при выполнении условия:

X_изм - результат измерения массовой концентрации данного СПК в контрольных растворах, мг/дм³;

C_cm - фактическое значение массовой концентрации данного СПК в контрольных растворах, мг/дм³ (млн^-1);

G - норматив контроля стабильности градуировочной характеристики, %.

Во всем диапазоне градуировочной характеристики G = 10%. При невыполнении условия (3) градуировочную характеристику устанавливают заново во всем диапазоне измерений.

9.1. Условия хроматографирования.

9.1.1. Разделение СПК проводят на обращенно-фазовых хроматографических колонках. Для разделения и идентификации СПК используют градиентный режим элюирования с использованием в качестве подвижной фазы раствора ацетата аммония (CH₃COONH₄) молярной концентрацией 100 ммоль/дм³ (фаза А) и ацетонитрила (фаза Б) (табл. 5).

Используют следующий режим:

- температура термостата колонки - 30 °C;

- диапазон длин волн детектирования - от 90 до 800 нм;

- объем вводимой пробы - от 5 до 20 мм³;

- скорость потока - 1,00 см³/мин;

- режим элюирования - градиентный.

Детектирование СПК проводят при следующих длинах волн:

- тартразин (E102) - 420 нм;

- желтый "солнечный закат" FCF (E110) - 500 нм;

- желтый хинолиновый (E104) - 420 нм;

- азорубин (E122) - 510 нм;

- понсо 4R (E124) - 510 нм;

- красный очаровательный AC (E129) - 510 нм;

- синий патентованный V (E131) - 620 нм;

- индигокармин (E132) - 620 нм;

- бриллиантовый синий FCF (E133) - 620 нм.

9.2. Подготовка проб.

9.2.1. Навеску измельченного и гомогенизированного пищевого продукта массой (3,00 +/- 0,01) г помещают в полипропиленовую пробирку с завинчивающейся крышкой объемом 50 см³. Добавляют 20,0 см³ дистиллированной воды, нагретой до 50 °C. Пробирку встряхивают на шейкере в течение 5 минут, затем помещают на ультразвуковую баню и выдерживают при температуре 50 °C в течение 15 минут. Далее пробирку с пробой центрифугируют в течение 20 минут при оборотах не менее 7000 об./мин и температуре +4 °C. После центрифугирования аккуратно отбирают 2,0 см³ водной фазы пропускают через нейлоновый фильтр объемом пор 0,2 мкм и используют для хроматографического анализа. При анализе каждой пробы проводят два параллельных измерения.

9.3. Выполнение измерений.

9.3.1. Подготовленную пробу вводят в инжектор хроматографа и регистрируют хроматограмму при условиях п. 9.1. На хроматограмме идентифицируют каждый СПК и по градуировочной характеристике вычисляют значения массовой концентрации красителей.

Если измеренное значение массовой концентрации одного или нескольких СПК в подготовленной пробе находится за пределами диапазона градуировочной характеристики (п. 8.4.2), то необходимо разбавить исходную пробу водой бидистиллированной, так, чтобы массовая концентрация СПК в полученном растворе находилась в середине диапазона градуировочной характеристики, но не более чем в 100 раз. Коэффициент разбавления (Q) вычисляют по формуле:

V_р - объем разбавленной пробы, см³;

V_а - объем аликвотной порции подготовленной пробы, взятой для разбавления, см³.

10.1. Массовую концентрацию СПК в пробе X, мг/кг, вычисляют по формуле:

c_изм - массовая концентрация красителя в растворе пробы, подготовленной по п. 9.2 (принимают численно равной измеренному по п. 9.3 значению массовой концентрации соответствующего СПК в этой пробе), млн^-1

m_общ - общая масса анализируемой пробы с добавкой воды (п. 9.2), г;

m_X - масса анализируемой пробы;

Q - коэффициент разбавления.

Вычисления проводят до второго десятичного знака. Окончательный результат округляют до первого десятичного знака.

11.1. За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:

X₁, X₂ - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости (табл. 1), при этом .

При невыполнении условия (6) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

12.1. Результат анализа представляют в виде:

- среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

- граница абсолютной погрешности, мг/кг.

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

13.1. Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6.

1. ГОСТ 12.1.004 "Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования".

2. ГОСТ 12.1.005 "Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны".

3. ГОСТ 12.1.007 "Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности".

4. ГОСТ 12.1.010 "Система стандартов безопасности труда. Взрывобезопасность. Общие требования".

5. ГОСТ 12.1.018 "Система стандартов безопасности труда. Пожаровзрывобезопасность статического электричества. Общие требования".

6. ГОСТ 12.1.019 "Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты".

7. ГОСТ 12.4.009 "Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание".

8. ГОСТ 12.4.021 "Система стандартов безопасности труда. Системы вентиляционные. Общие требования".

9. ГОСТ OIML R 76-1 Государственная система обеспечения единства измерений. Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания.

10. ГОСТ 1770 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) "Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия".

11. ГОСТ Р ИСО 5725-6 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике".

12. ГОСТ ISO/IEC 17025 "Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий".

13. ГОСТ 25336 "Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы. Основные параметры и размеры".

14. ГОСТ 28311 "Дозаторы медицинские лабораторные. Общие технические требования и методы испытаний".

15. ГОСТ Р 52501 "Вода для лабораторного анализа. Технические условия".