"МУК 4.1.3778-22. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств гекситиазокса в ботве и корнеплодах сахарной свеклы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 22.08.2022)

1. Разработаны ФГБНУ "Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений" (Т.Д. Черменская, В.И. Долженко); ООО "Инновационный центр защиты растений" (А.С. Комарова).

2. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 22 августа 2022 г.

3. Введены впервые.

1.1. Настоящие методические указания (далее - МУК) устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (далее - ВЭЖХ) для определения массовой концентрации гекситиазокса в ботве и корнеплодах сахарной свеклы в диапазоне концентраций от 0,05 до 0,5 мг/кг включительно.

1.2. МУК предназначены для органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, осуществляющих контроль качества и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов, а также могут быть использованы организациями, аккредитованными в установленном порядке на проведение исследований продовольственного сырья, пищевых продуктов.

1.3. МУК носят рекомендательный характер.

2.1. Гекситиазокс. (4RS,5RS)-5-(4-хлорфенил)-N-циклогексил-4-метил-2-оксо-1,3-тиазолидин-3-карбоксамид (ИЮПАК) <1>. Брутто-формула: C₁₇H₂₁ClN₂O₂S.

--------------------------------

<1> В соответствии с Международным союзом теоретической и прикладной химии (ИЮПАК, англ. International Union of Pure and Applied Chemistry, IUPAC).

Молекулярная масса 352,9. Химически чистое вещество представляет собой бесцветные кристаллы. Температура плавления плюс (108,0 - 108,5) °C. Давление пара при плюс 20 °C 0,0034 мПа. Коэффициент распределения в системе н-октанол-вода K_ow logP = 2,63. Растворимость: в воде - 0,5 мг/дм³ (при плюс 20 °C), в хлороформе - 1379, метаноле - 206, ацетоне - 160, ацетонитриле - 28,6, гексане - 4 (г/дм³, при плюс 20 °C). Стабилен к воздействию света, воздуха. Стабилен при нагревании до плюс 300 °C. Стабилен в водных растворах при pH 5, 7 и 9. Для водных растворов на свету DT₅₀ = 16,7 дней.

2.2. Краткая токсикологическая характеристика. Острая пероральная и дермальная токсичность ЛД₅₀ для крыс > 5000 мг/кг. Ингаляционная ЛК₅₀ (4 часа) для крыс более 2 мг/м³ воздуха.

2.3. Область применения. Несистемный акарицид с контактной активностью. Не активен против имаго, но имеет овицидную, ларвицидную и нимфацидную активность в отношении многих видов фитофаговых клещей на плодовых, цитрусовых, овощных культурах, винограде и хлопке.

3.1. При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 3.1, для соответствующих диапазонов концентраций.

4.1. Определение гекситиазокса основано на экстракционном извлечении определяемого компонента из проб органическим растворителем, очистке экстракта на сорбентах и последующем анализе экстракта методом ВЭЖХ с использованием ультрафиолетового (далее - УФ) детектора. Идентификация гекситиазокса проводится по времени удерживания, количественное определение - методом абсолютной калибровки. Избирательность метода обеспечивается сочетанием условий подготовки проб и хроматографирования.

5.1. При выполнении измерений и подготовке проб применяют средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы, приведенные в табл. 5.1 - 5.3.

Примечание: допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание: допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.

Примечание: допускается использование вспомогательных средств измерений, устройств и материалов с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

6.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

6.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004.

6.3. При работе с газами, находящимися в баллонах под давлением до 15 МПа (150 кгс/см²), необходимо соблюдать нормы и правила <2>. Запрещается открывать вентиль баллона, не установив в нем понижающий редуктор.

--------------------------------

<2> Правила промышленной безопасности опасных производственных объектов, на которых используется оборудование, работающее под избыточным давлением, утвержденные приказом Ростехнадзора от 25.03.2014 N 116.

6.4. Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист, имеющий опыт работы на жидкостном хроматографе, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений.

7.1. Отбор проб производится в соответствии с методическими документами <3>.

--------------------------------

<3> Унифицированные правила отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов, утвержденные Минздравом СССР 21.08.1979 N 2051-79; ГОСТ 33884 "Международный стандарт. Свекла сахарная. Технические условия"; ГОСТ Р 53036 "Национальный стандарт Российской Федерации. Свекла сахарная. Методы испытаний".

Пробы ботвы и корнеплодов сахарной свеклы до анализа хранят раздельно в герметичной полиэтиленовой таре в морозильной камере с температурой минус 18 °C не более 1 года.

8.1. При выполнении измерений выполняют следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха плюс (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

9.1. Очистка органических растворителей.

Растворители, используемые для анализа, специальной подготовки не требуют. Рекомендуется проверить чистоту применяемых растворителей. При обнаружении примесей, которые могут мешать определению, растворители очищают общепринятыми методами.

9.2. Кондиционирование колонки.

Перед началом анализа аналитическую колонку кондиционируют в потоке подвижной фазы 0,5 - 1,0 см³/мин до стабилизации нулевой линии.

9.3. Приготовление растворов.

9.3.1. 0,005 М раствор ортофосфорной кислоты: (0,50 +/- 0,01) г 98%-й ортофосфорной кислоты помещают в мерную колбу объемом 1000 см³, растворяют в деионизованной воде и доводят объем до метки.

9.3.2. Для приготовления подвижной фазы для ВЭЖХ в мерную колбу вместимостью 1000 см³ помещают 850 см³ ацетонитрила и доводят до метки 0,005 М раствором ортофосфорной кислоты.

Растворы хранят в темном месте (в емкости из темного стекла) не более 14 дней.

9.4. Приготовление основного, рабочего и градуировочных растворов.

9.4.1. Основной раствор с концентрацией 0,5 мг/см³: точную навеску гекситиазокса (50,0 +/- 0,5 мг) помещают в мерную колбу вместимостью 100 см³, растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом.

9.4.2. Рабочий раствор с концентрацией 10,0 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 100 см³ вносят 2,0 см³ основного раствора и доводят до метки ацетонитрилом.

9.4.3. Приготовление градуировочных растворов.

Градуировочные растворы с концентрациями гекситиазокса 0,025; 0,05; 0,1; 0,2 и 0,5 мкг/см³ готовят методом последовательного разбавления по объему, используя ацетонитрил.

9.4.3.1. Раствор N 1 с концентрацией 0,5 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ дозатором вносят 0,5 см³ рабочего раствора и доводят до метки ацетонитрилом.

9.4.3.2. Раствор N 2 с концентрацией 0,2 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ дозатором вносят 0,2 см³ рабочего раствора и доводят объем до метки ацетонитрилом.

9.4.3.3. Раствор N 3 с концентрацией 0,1 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ дозатором вносят 2 см³ раствора N 1 и доводят объем до метки ацетонитрилом.

9.4.3.4. Раствор N 4 с концентрацией 0,05 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ дозатором вносят 1 см³ раствора N 1 и доводят объем до метки ацетонитрилом.

9.4.3.5. Раствор N 5 с концентрацией 0,025 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ дозатором вносят 0,5 см³ раствора N 1 и доводят объем до метки ацетонитрилом.

Основной и рабочий растворы можно хранить в холодильнике при температуре плюс (0 - 4) °C в течение 1 месяца, градуировочные растворы - в течение недели.

При изучении полноты определения гекситиазокса используют ацетонитрильные растворы вещества, приготовленные из рабочего раствора методом последовательного разбавления по объему ацетонитрилом.

9.5. Установление градуировочной характеристики.

Для установления градуировочной характеристики (площадь пика - концентрация гекситиазокса в растворе) в инжектор хроматографа вводят по 20 мм³ градуировочных растворов (не менее 3 параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4 точек по диапазону измеряемых концентраций) и анализируют в условиях хроматографирования по п. 10.2. Определяют площади пиков вещества, на основании которых устанавливается градуировочная зависимость.

Градуировки признают удовлетворительными, если значение коэффициента линейной корреляции оказывается не ниже 0,99.

Градуировочные зависимости признают стабильными при выполнении следующего условия:

где C - известная концентрация гекситиазокса в градуировочном растворе, мкг/см³;

C_к - результат контрольного измерения массовой концентрации гекситиазокса в градуировочном растворе, мкг/см³;

- норматив контроля градуировочного коэффициента, % ( при P = 0,95).

Если расхождение превышает 10%, делают вывод о невозможности применения градуировочной характеристики для дальнейших измерений. В этом случае выясняют и устраняют причины нестабильности градуировочной характеристики и повторяют контроль ее стабильности с использованием других градуировочных растворов гекситиазокса. При повторном обнаружении нестабильности градуировочной характеристики ее устанавливают заново.

Градуировочную характеристику следует проверять перед началом измерений, при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы.

10.1. Экстракция гекситиазокса из ботвы или корнеплодов сахарной свеклы.

Навеску измельченных ботвы или корнеплодов (10 г) помещают в полипропиленовую центрифужную пробирку вместимостью 50 см³, последовательно добавляют 10 см³ ацетонитрила, 4 г безводного сульфата магния и 1 г хлористого натрия. Пробирку плотно закрывают и помещают в перемешивающее устройство на 10 мин, затем центрифугируют в течение 10 мин при 4000 об./мин. От верхнего ацетонитрильного слоя отбирают 5 см³, переносят в центрифужную пробирку вместимостью 15 см³, содержащую 15 мг активированного угля, 150 мг сорбента на основе силикагеля с привитыми первичными и вторичными аминными группами (PSA) и 900 мг безводного сульфата магния. Пробирку плотно закрывают и помещают в перемешивающее устройство на 10 мин, затем центрифугируют в течение 10 мин при 4000 об./мин. От верхнего слоя отбирают 1,0 см³, переносят в виалу и анализируют по п. 10.2.

10.2. Условия хроматографирования.

Жидкостной хроматограф с УФ-детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки. Аналитическая колонка, заполненная сорбентом с привитыми монофункциональными полярными группами C18 (250 x 4,6) мм, 5 мкм. Температура колонки плюс (25 +/- 1) °C. Подвижная фаза: смесь ацетонитрила и 0,005 М ортофосфорной кислоты в соотношении 85:15. Скорость потока элюента 1,0 см³/мин. Рабочая длина волны УФ-детектора 225 нм. Объем вводимой пробы 20 мм³. Приблизительное время удерживания 8,5 мин.

11.1. Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки. Содержание гекситиазокса в пробе X (мг/кг) вычисляют по формуле:

где C - концентрация гекситиазокса, найденная по градуировочному графику в соответствии с величиной площади хроматографического пика, мкг/см³;

f - полнота извлечения гекситиазокса, приведенная в табл. 3.2, %;

V - объем пробы, подготовленной для хроматографического анализа, см³ (1 см³);

m - окончательная масса анализируемого образца, г (аликвота, равная 1 г).

Содержание гекситиазокса в образце вычисляют как среднее из двух параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор гекситиазокса с концентрацией 0,5 мкг/см³, разбавляют ацетонитрилом.

12.1. За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:

где X₁, X₂ - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости (приведен в табл. 3.1).

При невыполнении условия выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

13.1. Результат анализа представляют в виде:

где X_ср - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

- граница абсолютной погрешности, мг/кг;

где - граница относительной погрешности методики (приведена в табл. 3.1), %.

В случае, если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде: "Содержание вещества в пробе менее нижней границы определения". Например: менее 0,05 мг/кг*, где * - 0,05 мг/кг - предел обнаружения гекситиазокса в ботве свеклы.

14.1. Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1 - 6.

Контроль стабильности градуировочной характеристики.

Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят ежедневно перед анализом серии проб. Средствами контроля являются свежеприготовленные образцы для градуировки с массовыми концентрациями, соответствующими нижней и верхней границам и середине диапазона построения градуировочной характеристики.

Градуировочная характеристика признается стабильной при выполнении условия, указанного в п. 9.5.

14.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

Величина добавки C_д должна удовлетворять условию:

где - характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно), мг/кг; при этом:

где - граница абсолютной погрешности, мг/кг:

где - граница относительной погрешности методики (приведена в табл. 3.1), %.

Результат контроля процедуры К_к рассчитывают по формуле:

где , X_ср, C_д - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 12.1) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки соответственно, мг/кг.

Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (К_к) с нормативом контроля (К).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию:

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении этого условия процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.

14.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

где X₁, X₂ - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;

R - предел воспроизводимости (приведен в табл. 3.1), %.

1. Федеральный закон от 30.03.1999 N 52-ФЗ "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения".

2. Приказ Ростехнадзора от 15.12.2020 N 536 "Об утверждении федеральных норм и правил в области промышленной безопасности "Правила промышленной безопасности при использовании оборудования, работающего под избыточным давлением".

3. Унифицированные правила отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов от 21.08.1979 N 2051-79.

4. ГОСТ Р ИСО 5725-1 - 6 "Государственный стандарт Российской Федерации. Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

5. ГОСТ 12.1.007 "Межгосударственный стандарт. Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности".

6. ГОСТ 12.1.019 "Межгосударственный стандарт. Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты".

7. ГОСТ 12.1.004 "Межгосударственный стандарт. Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования".

8. ГОСТ 12.4.009 "Межгосударственный стандарт. Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание".

9. ГОСТ 12.0.004 "Межгосударственный стандарт. Система стандартов безопасности труда. Организация обучения безопасности труда. Общие положения".

10. ГОСТ Р 53228 "Национальный стандарт Российской Федерации. Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания".

11. ГОСТ 1770 "Межгосударственный стандарт. Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия".

12. ГОСТ 28311 "Межгосударственный стандарт. Дозаторы медицинские лабораторные. Общие технические требования и методы испытаний".

13. ГОСТ Р 52501 "Национальный стандарт Российской Федерации. Вода для лабораторного анализа. Технические условия".

14. ГОСТ 6552 "Межгосударственный стандарт. Реактивы. Кислота ортофосфорная. Технические условия".

15. ГОСТ 4233 "Межгосударственный стандарт. Реактивы. Натрий хлористый. Технические условия".

16. ГОСТ 4453 "Государственный стандарт Союза ССР. Уголь активный осветляющий древесный порошкообразный. Технические условия".

17. ГОСТ 25336 "Межгосударственный стандарт. Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры".

18. ГОСТ 33884 "Международный стандарт. Свекла сахарная. Технические условия".

19. ГОСТ Р 53036 "Национальный стандарт Российской Федерации. Свекла сахарная. Методы испытаний".