"МУК 4.1.3679-20. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Количественное определение остаточных количеств хлорамфеникола (левомицетина) в пищевой продукции животного происхождения методом конкурентного иммуноферментного анализа. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 25.12.2020)

1. Разработаны ФГБУН "ФИЦ питания и биотехнологии" (В.А. Тутельян, Д.Б. Никитюк, С.А. Хотимченко, С.А. Шевелева, Л.П. Минаева, В.В. Бессонов, А.Д. Малинкин, А.В. Галкин), ФБУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии в городе Москве" Роспотребнадзора (Л.И. Иванова, А.Ю. Полторацкий).

2. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Российской Федерации, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 25 декабря 2020 г.

3. МУК 4.1.3679-20 введены взамен пункта 5 МУК 4.1.1912-04 "Определение остаточных количеств левомицетина (Хлорамфеникола, Хлормицетина) в продуктах животного происхождения методом высокоэффективной жидкостной хроматографии и иммуноферментного анализа", утвержденных Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 01.05.2004 и главы 1.1.А МУК 4.1.3535-18 "Определение остаточных количеств антибиотиков и антимикробных препаратов в продуктах животного происхождения", утвержденных Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 23.03.2018.

Свидетельство об аттестации методики (метода) измерений N 0267/РОСС RU.0001.310430/2022 от 07.02.2022 г., номер в реестре аттестованных методик ФР.1.31.2022.42676

1.1. Настоящие методические указания (далее - МУК) распространяются на продовольственное (пищевое) сырье и пищевую продукцию животного происхождения: молоко (сырое, питьевое, сухое, сгущенное), сливки, молочные смеси для детей (сухие), йогурт, кефир, сметану, сыворотку сухую и напитки на основе сыворотки, творог и творожные продукты (творог зерненный, творожная масса), сыры (молодой и зрелый), масло из коровьего молока, спред, мясо (говядина, свинина, курица, индейка), мясные субпродукты (печень, почки, жир), рыбу (лососевые) и креветки.

МУК устанавливают порядок применения методики количественного определения остаточных количеств хлорамфеникола (левомицетина) методом твердофазного конкурентного иммуноферментного анализа с фотометрической детекцией (при 450 нм) (далее - ИФА) в соответствии с диапазонами определяемых концентраций и метрологическими характеристиками.

1.2. МУК предназначены для органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, осуществляющих контроль качества и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов, а также могут быть использованы организациями, аккредитованными в установленном порядке на проведение исследований продовольственного (пищевого) сырья, пищевых продуктов.

1.3. МУК носят рекомендательный характер.

2.1. Метод иммуноферментного анализа основан на реакции "антиген - антитело". Лунки микротитровального планшета покрыты антителами к хлорамфениколу (вещество стандарта), которые связаны иммобилизированными антителами захвата. В лунки вносят растворы стандартов или проб и конъюгат хлорамфеникола. Свободный хлорамфеникол, содержащийся в пробе или стандартных растворах, и хлорамфеникол, конъюгированный с ферментом, конкурируют за места связывания с антителами (конкурентный иммуноферментный анализ). Все несвязанные молекулы конъюгата затем удаляют на этапе отмывки. Конъюгат преобразует хромоген в окрашенные в синий цвет продукты реакции. Внесение стоп-раствора изменяет окраску от синей к желтой. Измерения выполняют фотометрически при длине волны 450 нм. Оптическая плотность обратно пропорциональна концентрации хлорамфеникола в пробе.

3.1. При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 3.1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Метрологические параметры установлены при проведении количественного определения с тест-набором, указанным в главе IV. Допускается использование метода для тест-наборов с аналогичными или лучшими характеристиками при наличии установленных метрологических параметров.

--------------------------------

<1> Пример метрологических характеристик при использовании тест-набора "RIDASCREEN Chloramphenicol".

Примечание. При введении (при необходимости) дополнительного разведения подготовленного экстракта (например, в 33 раза) максимальная граница диапазона определяемого содержания хлорамфеникола (левомицетина) может быть увеличена с учетом фактора разведения и полноты извлечения для каждого вида анализируемого образца (например, при дополнительном разведении в 33 раза диапазон определяемого содержания будет включать значение 0,01 мг/кг).

4.1. При выполнении измерений и подготовке проб применяют средства измерений, вспомогательные устройства, материалы и реактивы, приведенные в табл. 4.1 - 4.3.

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание. Допускается использование других вспомогательных устройств, посуды и материалов с аналогичными или лучшими характеристиками.

--------------------------------

<2> Пересчет относительного центробежного ускорения (в единицах g) (ОЦУ/RFS) в скорость центрифугироваиия (об./мин) приведен в приложении к настоящим МУК.

Примечание. Допускается применение других химических реактивов с аналогичными или лучшими характеристиками.

4.2. Количественное определение хлорамфеникола по технологии ИФА проводят с тест-набором с внутренним стандартом, рассчитанным на проведение анализа 42 исследуемых образцов и 6 калибровочных проб (в 2 повторностях), в составе (табл. 4.4).

--------------------------------

<3> Тест-набор "RIDASCREEN Chloramphenicol".

Пример специфичности методики определения хлорамфеникола, установленной по перекрестной чувствительности к исследованным антибиотикам в буферной системе с тест-набором, представлен в табл. 4.5.

--------------------------------

<4> Тест-набор "RIDASCREEN Chloramphenicol".

5.1. Исследования пищевых продуктов с использованием методики ИФА проводят с соблюдением требований техники безопасности, установленных для работ с токсичными, едкими, легковоспламеняющимися веществами в соответствии с ГОСТ 12.1.007.

5.2. Проведение исследований допускается только в подготовленном лабораторном помещении.

5.3. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией, отвечать требованиям пожарной безопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения в соответствии с ГОСТ 12.4.009.

5.4. При выполнении измерений с использованием планшетного иммуноферментного анализатора и работе с электроустановками необходимо соблюдать правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019 и инструкцию по эксплуатации прибора.

5.5. При работе с тест-набором необходимо соблюдать следующие требования безопасности:

- стоп-реагент содержит 0,5 М серной кислоты. Не допускается попадание реагента на кожу;

- раствор субстрат-хромогена токсичен при вдыхании, контакте с кожей и проглатывании. При обращении необходимо соблюдать меры предосторожности;

- необходимо избегать контакта всех реагентов с кожей и слизистыми оболочками;

- при дозировании реагентов допускается использовать только указанные инструменты.

6.1. К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области иммуноферментного анализа. К проведению анализа допускается только персонал, ознакомленный с руководством по эксплуатации планшетного иммуноферментного анализатора и освоивший данную методику.

7.1. Отбор проб осуществляют в соответствии с методическим документом <5>.

--------------------------------

<5> МУК 4.1.3534-18 "Подготовка проб для проведения исследований по определению остаточных количеств антибиотиков из антимикробных препаратов".

7.2. Пробы исследуемых продуктов хранят в соответствии с рекомендациями изготовителя, указанными в сопроводительной документации или на этикетке.

7.3. Хранение и транспортирование экстрактов, подготовленных для ИФА.

Готовые экстракты допускается хранить до начала анализа в пределах одной лаборатории при температуре от плюс 2 до плюс 8 °C не более 1 суток.

Допускается транспортирование материала при температуре от плюс 2 до плюс 8 °C в течение 1 суток. Доставленные в лабораторию образцы в виде экстрактов хранению не подлежат и сразу направляются на анализ.

8.1. При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- температура окружающего воздуха от плюс 20 до плюс 30 °C;

- относительная влажность воздуха не более 80%.

9.1. Подготовка стеклянной посуды

При подготовке к проведению исследований лабораторную стеклянную посуду моют смесью водного раствора бихромата калия с концентрированной серной кислотой, многократно промывают водопроводной водой, ополаскивают дистиллированной водой и высушивают в сушильном шкафу.

9.2. Подготовка оборудования

Подготовку и проверку фотометра, pH-метра и другого необходимого оборудования проводят в соответствии с руководствами по эксплуатации приборов.

9.3. Хранение и использование наборов и реагентов

Тест-наборы для ИФА хранят при температуре от плюс 2 до плюс 8 °C, не допуская подмораживания компонентов. Использовать набор допускается только в пределах срока годности.

При подготовке к анализу ИФА, использованию и хранению тест-набора при необходимости дополнительно руководствоваться инструкцией к тест-набору.

9.4. Приготовление растворов

9.4.1. Приготовление 10 мМ моющего буферного раствора с pH 7,4 (PBS-буфер с твином)

Для приготовления буферного раствора используют входящий в комплект набора пакет с сухой солью для PBS-буфера.

Способ 1. Растворяют содержимое целого пакетика в 1 дм³ дистиллированной воды. Готовый 10 мМ моющий буфер может храниться при температуре от плюс 2 до плюс 8 °C в течение 4 - 6 недель.

Способ 2. Растворяют содержимое пакетика в 100 см³ дистиллированной воды, чтобы получить 10-кратный концентрат моющего буфера. Раствор может храниться около 8 - 12 недель при комнатной температуре (от плюс 20 до плюс 25 °C).

Для приготовления готового к употреблению 10 мМ моющего буфера растворите одну часть 10-кратного концентрата в 9 частях дистиллированной воды. Готовый 10 мМ моющий буфер может храниться при температуре от плюс 2 до плюс 8 °C в течение 4 - 6 недель.

9.4.2. Приготовление 20 мМ буферного раствора (PBS-буфер)

Навески натрия фосфорнокислого однозамещенного 2-водного 1,10 г, натрия фосфорнокислого двузамещенного 12-водного 3,22 г и натрия хлористого 8,77 г растворяют в объеме 800 - 900 см³ дистиллированной воды, доводят pH до 7,4 0,5 н раствором гидроокиси натрия, далее доводят объем раствора дистиллированной водой в мерной колбе до метки 1 000 см³, тщательно перемешивают.

Готовый 20 мМ буферный раствор (PBS-буфер) хранят при температуре от плюс 2 до плюс 8 °C не более 6 недель.

9.4.3. Приготовление осадителей (растворы Карреза)

Осадитель 1 (раствор Карреза I): навеску 15,21 г калия железистосинеродистого 3-водного разводят в мерной колбе объемом 100 см³ дистиллированной водой до метки, тщательно перемешивают.

Раствор железосинеродистого калия (осадитель I) хранят в склянке из темного стекла не более 10 сут.

Осадитель 2 (раствор Карреза II): навеску 29,90 г сульфата цинка 7-водного разводят в мерной колбе объемом 100 см³ дистиллированной водой до метки, тщательно перемешивают.

Раствор сульфата цинка (осадитель II) хранят в стеклянной посуде не более 10 сут.

9.4.4. Приготовление 0,5 н раствора гидроокиси натрия

Навеску 5 г гидроокиси натрия разводят в мерной колбе объемом 250 см³ дистиллированной водой до метки, тщательно перемешивают.

Раствор гидроокиси натрия хранят в стеклянной или полиэтиленовой таре с плотно закрытой полиэтиленовой/полипропиленовой или резиновой крышкой в течение 2 - 3 недель.

9.4.5. Приготовление 10%-го раствора метанола

Для получения 10%-го раствора метанола отбирают 10 см³ метанола в мерную колбу объемом 100 см³ и разводят дистиллированной водой до метки, тщательно перемешивают.

9.4.6. Приготовление 20%-го растворов метанола

Для получения 20%-го раствора метанола отбирают 20 см³ метанола в мерную колбу объемом 100 см³ и разводят дистиллированной водой до метки, тщательно перемешивают.

Растворы метанола готовят в необходимом количестве непосредственно перед анализом с соблюдением указанных соотношений компонентов, остатки утилизируют в соответствии с установленными правилами.

Примечание. При приготовлении разведений необходимо учитывать следующее: соотношение 1:10 означает, что 1 часть вещества (экстракта, концентрата) содержится в 10 частях готового раствора, то есть к 1 части вещества (экстракта, концентрата) прибавляется 9 частей растворителя, в соответствии с инструкцией производителя тест-набора.

Принимается допущение, что плотность буферных и других растворов (солей, кислот и щелочей), экстрактов, используемых в приведенных методиках, а также 10%-х растворов (суспензий) продуктов приравнивается к плотности воды, исходя из чего при приготовлении последующих разведений учитывать, что массовые (м/м) и объемные (о/о) проценты принимаются равными.

9.5. Подготовка проб продуктов

9.5.1. Подготовка проб молока (сырое, питьевое, сухое), молочных смесей для детского питания (сухие, жидкие)

Образцы продуктов в сухом виде предварительно восстанавливают в воде в соответствии с указанием на этикетке (нормативно-технической документацией на продукт). При отсутствии информации 1,0 г сухого продукта суспендируют в 9,0 см³ дистиллированной воды. Пробы при необходимости нейтрализуют с помощью 0,5 н раствора натрия гидроокиси (п. 9.4.4), доводя уровень pH до 7,0 +/- 0,5.

Способ А (прямое внесение). Жидкий или восстановленный продукт центрифугируют в течение 5 мин при 2 000 g и температуре не выше 4 °C (при отсутствии центрифуги с охлаждением допускается проводить центрифугирование при комнатной температуре с предварительным охлаждением проб в холодильнике до температуры не выше 4 °C).

Образовавшийся верхний слой жира удаляют с помощью шпателя или стеклянной палочки, обезжиренный супернатант отбирают в пустую пробирку и используют для дальнейшего анализа.

Непосредственно перед анализом подготовленную пробу перемешивают с помощью вортекса. Далее вносят по 0,05 см³ пробы в лунку планшета. При расчете конечного результата учитывают фактор разбавления - 1.

Способ Б (экстракция из сухого образца). Экстракцию хлорамфеникола непосредственно из сухого молочного продукта, сухой молочной смеси, в том числе смеси для питания детей, проводят следующим образом.

Растворяют 2 г сухого молока в 10 см³ дистиллированной воды в центрифужной пробирке вместимостью 15 см³. Добавляют 0,5 см³ осадителя 1 (раствор Карреза I) (п. 9.4.3) и тщательно перемешивают на вортексе. Затем добавляют 0,5 см³ осадителя 2 (раствор Карреза II) (п. 9.4.3) и снова интенсивно перемешивают на вортексе. Далее смесь центрифугируют 10 мин при 3 000 g при температуре от плюс 2 до плюс 12 °C (при отсутствии центрифуги с охлаждением предварительно охладить пробы до (8 +/- 1) °C в холодильнике).

Супернатант 3,6 см³ (соответствует 0,6 г сухого молока/смеси) переносят в чистую центрифужную пробирку на 15 см³, добавляют 6 см³ этилацетата и экстрагируют встряхиванием в течение 10 мин. Затем смесь центрифугируют при комнатной температуре (от плюс 20 до плюс 25 °C) в течение 10 минут при 3000 g.

Этилацетатный супернатант 4 см³ переносят в новую чистую стеклянную пробирку и испаряют экстракт досуха при 60 °C в токе азота или воздуха, используя устройство для испарения.

Если после сушки пробы на дне пробирки обнаруживается жирный остаток, то проводят процедуру обезжиривания так, как описано в примечании к настоящему разделу. После чего сухой остаток растворяют так, как описано ниже.

Если жирного остатка не наблюдается, то растворяют сухой остаток в 0,4 см³ 10 мМ моющего буфера (п. 9.4.1) и тщательно перемешивают на вортексе.

Для анализа используют 0,05 см³ подготовленного экстракта на лунку планшета. При расчете конечного результата (в сухом продукте) учитывают фактор разбавления - 1.

При необходимости для получения результатов содержания антибиотика в границах диапазона определяемого содержания вводят дополнительное разведение подготовленного экстракта пробы в 33 раза (например, 0,1 см³ экстракта + 3,2 см³ моющего буфера).

Примечание. Для обезжиривания сухого остатка к сухому остатку приливают 0,4 см³ н-гексана и перемешивают на вортексе, далее приливают 0,4 см³ моющего буфера и повторно перемешивают на вортексе. Смесь центрифугируют 10 мин при 3 000 g при комнатной температуре (20 - 25 °C). Нижнюю водную фазу отбирают в чистую пробирку и далее используют в соответствии с последующей процедурой. При этом фактор разведения пробы не меняется.

При проведении пробоподготовки с использованием этилацетата и гексана для исключения ложноположительных результатов необходимо использовать отрицательный контроль. В качестве отрицательного контроля вместо пробы вносят соответствующий объем дистиллированной воды и проводят все процедуры экстракции так же, как с исследуемым образцом, с последующим внесением в лунку планшета. При расчете конечного результата полученные значения вычитают из значений исследованного образца (для расчета используют тот же фактор разбавления).

9.5.2. Йогурт (без наполнителя/с фруктами), кефир, пахта и сыворотка, сливки

Пробы нейтрализуют с помощью 0,5 н раствора натрия гидроокиси (п. 9.4.4), доводя значение pH до 7,0 +/- 0,5. При исследовании продукта с фруктами отбрасывают частицы твердой консистенции, отбирают жидкую фракцию. Экстракцию хлорамфеникола из исследуемого образца проводят следующим образом.

Навеску 10,0 г пробы вносят в центрифужную пробирку вместимостью 50 см³ с завинчивающейся крышкой, приливают 8,0 см³ 20 мМ буфера (п. 9.4.2) и перемешивают. Далее добавляют 1 см³ осадителя 1 (раствор Карреза I) (п. 9.4.3) и тщательно перемешивают на вортексе. После чего вносят 1 см³ осадителя 2 (раствор Карреза II) (п. 9.4.3) и перемешивают встряхиванием в течение 10 мин, используя встряхиватель с вертикальным вращением (переворотом).

Готовую смесь перед центрифугированием, при необходимости, допускается переносить в центрифужные пробирки объемом 15 см³, далее центрифугируют 10 мин при 4 000 g и температуре не выше 4 °C (при отсутствии центрифуги с охлаждением допускается проводить центрифугирование при комнатной температуре с предварительным охлаждением проб в холодильнике до температуры не выше 4 °C).

Супернатант 4 см³ переносят в новую пробирку, приливают 8 см³ этилацетата и встряхивают, перемешивают встряхиванием в течение 10 мин, используя встряхиватель с вертикальным вращением (переворотом). После чего центрифугируют 10 мин при 3 000 g при комнатной температуре (от плюс 20 до плюс 25 °C).

Супернатант 4 см³ переносят в новую стеклянную пробирку и испаряют при 60 °C досуха в токе азота или воздуха, используя устройство для испарения.

Если после сушки пробы на дне пробирки обнаруживается жирный остаток, то проводят процедуру обезжиривания, как описано в примечании к п. 9.5.1. После чего сухой остаток растворяют так, как описано ниже.

Если жирного остатка не наблюдается, то растворяют сухой остаток в 0,5 см³ 10 мМ моющего буфера (п. 9.4.1).

Для анализа используют 0,05 см³ подготовленного экстракта на лунку планшета. При расчете конечного результата учитывают фактор разбавления - 0,5.

При необходимости для получения результатов содержания антибиотика в границах диапазона определяемого содержания вводят дополнительное разведение подготовленного экстракта пробы в 33 раза (например, 0,1 см³ экстракта + 3,2 см³ моющего буфера).

9.5.3. Творог, сметана

Навеску 5,0 г пробы вносят в центрифужную пробирку вместимостью 50 см³, прибавляют 15 см³ 10%-го раствора метанола (п. 9.4.5) и интенсивно перемешивают на вортексе в течение 1 мин. Допускается распределение пробы в двух центрифужных пробирках объемом 15 см³ при сохранении пропорций количества пробы и объема раствора метанола и с последующим объединением экстрактов. Далее смесь центрифугируют 15 мин при 4 000 g при температуре не выше 4 °C (при отсутствии центрифуги с охлаждением допускается проводить центрифугирование при комнатной температуре с предварительным охлаждением проб в холодильнике до температуры не выше 4 °C).

Из пробирок удаляют образовавшийся верхний слой жира с помощью шпателя или стеклянной палочки, из обезжиренной средней части переносят 4 см³ пробы в новую пробирку (если проба была распределена на 2 пробирки, то далее используют объединенную пробу по 2 см³ из каждой пробирки).

К супернатанту прибавляют 8 см³ этилацетата, перемешивают встряхиванием в течение 10 мин, используя встряхиватель с вертикальным вращением (переворотом). После чего центрифугируют 10 мин при 3 000 g при комнатной температуре (20 - 25 °C).

Супернатант 4 см³ переносят в новую чистую стеклянную пробирку и испаряют при 60 °C досуха в токе азота или воздуха, используя устройство для испарения.

Если после сушки пробы на дне пробирки обнаруживается жирный остаток, то проводят процедуру обезжиривания, как описано в примечании к п. 9.5.1. После чего сухой остаток растворяют так, как описано ниже.

Если жирного остатка не наблюдается, то растворяют сухой остаток в 0,5 см³ 10 мМ моющего буфера (п. 9.4.1).

Для анализа используют 0,05 см³ подготовленного экстракта на лунку планшета. При расчете конечного результата учитывают фактор разбавления - 1.

При необходимости для получения результатов содержания антибиотика в границах диапазона определяемого содержания вводят дополнительное разведение подготовленного экстракта пробы в 33 раза (например, 0,1 см³ экстракта + 3,2 см³ моющего буфера).

9.5.4. Масло сливочное

Навеску 2,0 масла вносят в центрифужную пробирку объемом 15 см³, расплавляют масло на водяной бане при температуре примерно (40 +/- 1) °C. Прибавляют 2 см³ н-гексана и перемешивают интенсивно на вортексе в течение 10 - 15 с. После этого прибавляют 1 см³ 20%-го раствора метанола (п. 9.4.6) и повторно интенсивно перемешивают на вортексе в течение 10 - 15 с, затем перемешивают встряхиванием в течение 10 мин, используя встряхиватель с вертикальным вращением (переворотом). Центрифугируют 10 мин при 2 000 g при температуре не выше 4 °C (при отсутствии центрифуги с охлаждением допускается проводить центрифугирование при комнатной температуре с предварительным охлаждением проб в холодильнике до температуры не выше 4 °C).

Нижнюю водную фазу 0,7 см³ переносят в пробирку по типу "Эппендорф" на 1,5 - 2 см³ и помещают на лед на 10 мин. После чего центрифугируют 5 мин при 20 000 g при комнатной температуре (от плюс 20 до плюс 25 °C). Отбирают нижнюю водную фазу в пустую пробирку.

Нижнюю водную фазу разбавляют 10 мМ моющим буфером (п. 9.4.1) в соотношении 1:4,5 (например, 0,2 см³ нижней фазы + 0,7 см³ моющего буфера).

Для анализа используют 0,05 см³ подготовленного экстракта на лунку планшета. При расчете конечного результата учитывают фактор разбавления - 5,2.

При необходимости для получения результатов содержания антибиотика в границах диапазона определяемого содержания вводят дополнительное разведение подготовленного экстракта пробы в 33 раза (например, 0,1 см³ экстракта + 3,2 см³ моющего буфера).

9.5.5. Сыр

С поверхности образца сыра удаляют плесневый налет (при наличии). Полностью гомогенизируют все количество представительной пробы в гомогенизаторе или вручную в фарфоровой ступке.

Навеску сыра 10 г вносят в центрифужную пробирку вместимостью 50 см³ и добавляют 30 см³ 10%-го раствора метанола, тщательно перемешивают и инкубируют на водяной бане при (40 +/- 1) °C в течение 10 мин, встряхивая интенсивно минимум 3 раза во время инкубации.

После чего центрифугируют 15 мин при 4 000 g при температуре не выше 4 °C (при отсутствии центрифуги с охлаждением допускается проводить центрифугирование при комнатной температуре с предварительным охлаждением проб в холодильнике до температуры не выше 4 °C).

Нижнюю водную фазу 3,5 см³ переносят в новую центрифужную пробирку, приливают 7 см³ этилацетата и перемешивают встряхиванием в течение 10 мин, используя встряхиватель с вертикальным вращением (переворотом). После чего центрифугируют 10 мин при 3 000 g при комнатной температуре (от плюс 20 до плюс 25 °C).

Супернатант 3,5 см³ переносят в новую чистую стеклянную пробирку и испаряют экстракт досуха при 60 °C в токе азота или воздуха, используя устройство для испарения.

Если после сушки пробы на дне пробирки обнаруживается жирный остаток, то проводят процедуру обезжиривания, как описано в примечании к п. 9.5.1. После чего сухой остаток растворяют так, как описано ниже.

Если жирного остатка не наблюдается, то растворяют сухой остаток в 0,5 см³ 10 мМ моющего буфера (п. 9.4.1).

Для анализа используют 0,05 см³ подготовленного экстракта на лунку планшета. При расчете конечного результата учитывают фактор разбавления - 1.

При необходимости для получения результатов содержания антибиотика в границах диапазона определяемого содержания вводят дополнительное разведение подготовленного экстракта пробы в 33 раза (например, 0,1 см³ экстракта + 3,2 см³ моющего буфера).

9.5.6. Подготовка проб мяса (скота и птицы), рыбы (сырая, охлажденная, мороженая, варено-мороженая), креветок

Полностью гомогенизируют все количество представительной пробы в гомогенизаторе или вручную в фарфоровой ступке.

Навеску гомогенизированной пробы 3 г вносят в центрифужную пробирку вместимостью 15 см³, прибавляют 3 см³ дистиллированной воды, 6 см³ этилацетата и перемешивают встряхиванием в течение 10 мин, используя встряхиватель с вертикальным вращением (переворотом).

После чего центрифугируют 10 мин при 3 000 g при комнатной температуре (20 - 25 °C).

Супернатант 4 см³ переносят в новую чистую стеклянную пробирку и испаряют экстракт досуха при 60 °C в токе азота или воздуха, используя устройство для испарения.

Сухой остаток растворяют в 1 см³ н-гексана, прибавляют 0,5 см³ 10 мМ моющего буфера (п. 9.4.1) и тщательно перемешивают на вортексе.

Центрифугируют 10 мин при 3 000 g при комнатной температуре (20 - 25 °C). Нижнюю водную фазу отбирают в чистую пробирку.

Нижнюю водную фазу разбавляют 10 мМ моющим буфером (п. 9.4.1) в соотношении 1:10 (например, 0,05 см³ нижней фазы + 0,45 см³ моющего буфера).

Для анализа вносят по 0,05 см³ подготовленного экстракта на лунку планшета. При расчете конечного результата учитывают фактор разбавления - 2,5.

При необходимости для получения результатов содержания антибиотика в границах диапазона определяемого содержания вводят дополнительное разведение подготовленного экстракта пробы в 33 раза (например, 0,1 см³ экстракта + 3,2 см³ моющего буфера).

9.5.7. Подготовка проб яиц (сырые, замороженные)

Экстракцию хлорамфеникола из исследуемого образца проводят следующим образом. Полностью гомогенизируют все количество представительной пробы в гомогенизаторе или вручную в фарфоровой ступке.

Навеску 2 г гомогенизированной пробы вносят в центрифужную пробирку объемом 15 см³, добавляют 8 см³ этилацетата и интенсивно встряхивают в течение 10 мин, используя встряхиватель с вертикальным вращением (переворотом), после чего центрифугируют 10 мин при 3 000 g при комнатной температуре (от плюс 20 до плюс 25 °C).

Супернатант 4 см³ (соответствует 1 г пробы) переносят в новую чистую стеклянную пробирку и испаряют экстракт досуха при 60 °C в токе азота или воздуха, используя устройство для испарения.

Сухой остаток растворяют в 1 см³ н-гексана, прибавляют 1 см³ 10 мМ моющего буфера (п. 9.4.1) и тщательно перемешивают на вортексе 1 мин. Центрифугируют 10 мин при 3 000 g при комнатной температуре (от плюс 20 до плюс 25 °C). Нижнюю водную фазу отбирают в чистую пробирку.

Для анализа используют 0,05 см³ нижней водной фазы на лунку планшета. При расчете конечного результата учитывают фактор разбавления - 1.

При необходимости для получения результатов содержания антибиотика в границах диапазона определяемого содержания вводят дополнительное разведение подготовленного экстракта пробы в 33 раза (например, 0,1 см³ экстракта + 3,2 см³ моющего буфера).

9.5.8. Подготовка проб меда

Экстракцию хлорамфеникола из исследуемого образца проводят следующим образом.

Навеску 2 г меда вносят в центрифужную пробирку вместимостью 15 см³, прибавляют 4 см³ дистиллированной воды, тщательно перемешивают встряхиванием до полного растворения меда, затем добавляют 4 см³ этилацетата и экстрагируют встряхиванием в течение 10 мин, используя встряхиватель с вертикальным вращением (переворотом), после чего центрифугируют 10 мин при 3 000 g при комнатной температуре (от плюс 20 до плюс 25 °C).

Супернатант 1 см³ переносят в новую чистую стеклянную пробирку и испаряют досуха при 60 °C в токе азота или воздуха, используя устройство для испарения.

Сухой остаток растворяют в 0,5 см³ 10 мМ моющего буфера (п. 9.4.1) и тщательно перемешивают на вортексе.

Для анализа используют 0,05 см³ нижней водной фазы на лунку планшета. При расчете конечного результата учитывают фактор разбавления - 1.

При необходимости для получения результатов содержания антибиотика в границах диапазона определяемого содержания вводят дополнительное разведение подготовленного экстракта пробы в 33 раза (например, 0,1 см³ экстракта + 3,2 см³ моющего буфера).

10.1. Раствор субстрата/хромогена светочувствителен, поэтому необходимо избегать попадания на него прямого света. При появлении окрашивания раствора субстрата/хромогена в голубоватый цвет реагент к работе непригоден.

Не допускается заменять реагенты в составе одного комплекта реагентами из другого комплекта с другим номером партии. Не допускается перекрестное использование реагентов из комплектов с разными номерами партий.

Каждая лунка стрипа при изменении оптической плотности выступает в роли оптической кюветы, поэтому необходимо избегать прикосновения и загрязнения нижней стороны лунок.

10.2. Подготовка тест-набора к исследованиям

10.2.1. Перед выполнением анализа из планшета следует извлечь необходимое количество стрипов (8 микролунок, скрепленных в одну полоску). Остальные стрипы следует тщательно упаковать в фольгированный пакет вместе с осушителем, закрыть застежку пакета и поместить в холодильник при температуре от плюс 2 до плюс 8 °C.

10.2.2. Перед использованием тест-набора доводят температуру всех реагентов до комнатной (от плюс 20 до плюс 25 °C) в течение 0,5 - 1 ч. Если в концентратах буфера и конъюгата образовались кристаллы, нужно растворить их путем встряхивания при комнатной температуре перед разведением этих реагентов.

10.2.3. Перед непосредственным использованием встряхивают каждый флакон с реагентами.

10.2.4. После использования реагенты тест-набора сразу убирают в холодильник.

10.2.5. На всех стадиях необходимо избегать воздействия прямого солнечного света.

10.2.6. Для каждого реактива и раствора используют отдельные съемные наконечники автоматических дозаторов. Внесение растворов в лунки проводят осторожно, не касаясь наконечниками их дна и стенок.

10.2.7. Для получения точных результатов на стадиях дозирования реактивов и промывания необходимо соблюдать высокую точность и аккуратность.

10.2.8. Каждый исследуемый раствор экстрактов испытуемых проб и градуировочных растворов анализируют в двух повторностях.

10.2.9. Оптимальные результаты будут получены только при строгом соблюдении приведенной методики.

10.3. Алгоритм проведения исследования

10.3.1. В рамку планшета вставляют необходимое количество микролунок, достаточное для всех растворов стандартов и растворов исследуемых проб при анализе в двух повторностях каждый. Записывают положение лунок со стандартами и исследуемыми растворами на бланке планшета.

10.3.2. Добавляют в выбранные пары лунок по 0,05 см³ каждой концентрации раствора стандарта, раствора подготовленной пробы продукта.

10.3.3. Затем в каждую лунку добавляют по 0,05 см³ конъюгата. Перемешивают, осторожно покачивая планшет рукой, и оставляют для инкубации при комнатной температуре (от плюс 20 до плюс 25 °C) в течение 0,5 часа в темном месте.

10.3.4. По окончании инкубации выливают жидкость из лунок, переворачивая рамку планшета, и тщательно выбивают капельки жидкости, оставшиеся в лунках, путем троекратного интенсивного постукивания рамкой с лунками по столу (максимально выбивая капли из лунок), накрытому фильтровальной бумагой.

10.3.5. Заполняют лунки буфером для промывки (PBS-буфер), приготовленным по п. 9.4.1, внося по 0,25 см³ в каждую лунку, используя восьмиканальный дозатор. После контакта выливают буфер для промывки из лунок и тщательно выбивают капельки жидкости. Процедура отмывки повторяется трижды.

Допускается для увеличения производительности использование автоматического устройства для отмывки иммунологических планшетов.

Примечание. Необходимо следовать рекомендованной процедуре промывки и не допускать высыхания микролунок в процессе выполнения анализа.

10.4. После отмывания добавляют по 0,1 см³ смеси субстрата/хромогена в каждую лунку. Перемешивают, осторожно покачивая планшет рукой, и оставляют для инкубации при комнатной температуре (от плюс 20 до плюс 25 °C) в течение 15 минут в темном месте.

10.5. По окончании инкубации добавляют в каждую лунку по 0,1 см³ стоп-реагента. Перемешивают, осторожно покачивая планшет рукой.

10.6. Далее измеряют оптическую плотность в каждой лунке при 450 нм с помощью микропланшетного иммуноферментного анализатора. Время от внесения стоп-реагента до измерения не должно превышать 30 минут.

11.1. Инструментальный учет реакции проводят путем измерения оптической плотности на микропланшетном иммуноферментном анализаторе (планшетный фотометр, ридер) при длине волны 450 нм против нулевого стандарта, значение которого принимается за 100%.

Величина оптической плотности, измеренной в лунке с нулевым стандартом, ниже 0,6 (A_450нм < 0,6) является признаком порчи реагентов. Окрашивание красноватого раствора субстрата/хромогена в голубой цвет перед постановкой анализа также является признаком порчи реагентов. Результаты анализа в таком случае не учитываются.

11.2. Для обработки результатов иммуноферментного анализа используется специальное программное обеспечение, рекомендованное изготовителем тест-набора. Пример стандартной калибровочной кривой дан в сертификате обеспечения качества на тест-набор.

Программное обеспечение выполняет построение градуировочной зависимости относительной оптической плотности B/B₀ от натурального логарифма концентрации антибиотика:

где B_i - оптическая плотность раствора антибиотика;

B₀ - оптическая плотность 1-го градуировочного раствора с концентрацией антибиотика 0,00 мкг/дм³;

C_i - концентрация антибиотика в i-ом градуировочном растворе, нг/дм³.

Расчет коэффициентов линейной регрессии a и b проводится с помощью метода наименьших квадратов на основании пар значений B_i/B₀, lnC_i, полученных для пяти градуировочных растворов, где (i = 2 ... 6), C_i - концентрация i-го градуировочного раствора, B_i - среднее значение оптической плотности, рассчитанное по двум значениям оптической плотности параллельных измерений i-го градуировочного раствора. Массовая концентрация антибиотика в пробе рассчитывается на основании результатов измерений оптической плотности раствора подготовленной пробы, коэффициентов линейной регрессии и фактора разбавления по формуле:

где X - концентрация антибиотика в пробе, нг/кг (нг/дм³);

B_x - оптическая плотность, полученная при измерении раствора пробы (экстракта);

F - фактор разбавления пробы.

Градуировочная зависимость считается приемлемой, если рассчитанное программным обеспечением значение коэффициента корреляции г² > 0,98.

11.3. Обработку результатов анализа без программного обеспечения проводят следующим образом.

Измеренные показатели оптической плотности переносят в таблицу и располагают в соответствии с номерами образцов.

Вычисляют средние значения оптической плотности стандартных и исследуемых растворов, полученные по 2 параллельным микролункам в результате двух параллельных определений.

Относительную оптическую плотность (A) вычисляют по формуле:

где A - значение относительной оптической плотности, выраженное в процентах от оптической плотности нулевого стандарта, % поглощения;

B_i - среднее значение оптической плотности пяти стандартных растворов антибиотика (i = 2 ... 6) (или исследуемых экстрактов испытуемых проб);

B₀ - среднее значение оптической плотности 1-го градуировочного раствора (нулевого стандарта).

11.4. По величинам значений относительной оптической плотности, вычисленным для стандартных растворов и соответствующим им значениям концентрации хлорамфеникола в нг/дм³, строят калибровочную кривую (градуировочный график) в полулогарифмической системе координат.

11.5. Концентрацию хлорамфеникола (x) в нг/дм³ в экстракте испытуемой пробы считывают по калибровочной кривой соответственно значениям оптической плотности (в пределах значений 2 - 6 градуировочных растворов), которые вычислены по формуле (3).

11.6. Массовую концентрацию (содержание) хлорамфеникола в испытуемой пробе (X) рассчитывают по формуле:

где X - массовая концентрация хлорамфеникола в испытуемой пробе, мг/кг (мг/дм³ - для жидких продуктов);

x - массовая концентрация антибиотика в экстракте испытуемой пробы, определяемая по градуировочному графику, нг/дм³;

F - фактор разбавления испытуемой пробы (табл. 3);

K - коэффициент пересчета нг/дм³ в мг/кг (мг/дм³ - для жидких проб), равный 1000 000.

При выполнении пробоподготовки и анализа в полном соответствии с приведенной методикой фактор разбавления F принимает следующие значения (табл. 11.1).

12.1. При расчете учитывают только результаты, удовлетворяющие условиям диапазона определяемых концентраций антибиотика в образце (значение равно или выше нижней границы/равно или ниже верхней границы) для соответствующего вида продукции, указанного в табл. 3.1 для каждой группы продуктов.

В случае обнаружения содержания антибиотика в подготовленном экстракте выше верхней границы градуировочного графика проводят дополнительное разведение подготовленного экстракта и в дальнейшем учитывают это разведение при обработке результата анализа.

За результат количественного анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:

где X₁, X₂ - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости (табл. 3.1), при этом .

При невыполнении условия выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

13.1. Результат анализа представляют в виде:

где - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

- граница абсолютной погрешности, мг/кг:

где - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 3.1), %.

Если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, с учетом границы абсолютной погрешности результат анализа представляют в виде: "Содержание хлорамфеникола в молоке < 0,00003 мг/кг".

14.1. Проверку приемлемости результатов измерений, полученных в условиях повторяемости (сходимости) и воспроизводимости, проводят с учетом ГОСТ ИСО 5725-6.

Различные модели центрифуг при одинаковых скоростях вращения ротора могут иметь отличающиеся факторы разделения, поэтому эффективность разделения в центробежном поле принято количественно оценивать как величину относительного центробежного ускорения (ОЦУ/RFS), выраженную в единицах g.

Эффективность разделения - фактор разделения F (ОЦУ/RFS) - зависит от частоты вращения и радиуса центрифугирования и рассчитывается по следующей формуле:

где n - скорость вращения ротора, об./мин;

r - средний радиус вращения столбика жидкости в центрифужной пробирке, см.

Радиус измеряется от оси вращения ротора до середины столбика жидкости в пробирке, когда держатель пробирки (при наличии подвижного держателя) находится в положении центрифугирования (под углом к оси вращения).

Если необходимо обеспечить заданный фактор разделения, то для расчета скорости центрифугирования используют следующую формулу:

Для облегчения расчета можно использовать номограмму, отражающую зависимость относительного ускорения центрифуги (ОЦУ/RFS) от скорости вращения ротора (n) и радиуса (r) - среднего радиуса вращения столбика жидкости в центрифужной пробирке.

Пример.

Необходимо определить скорость вращения центрифуги для достижения относительного центробежного ускорения (фактора разделения) 4000 g, если средний радиус вращения столбика жидкости в центрифужной пробирке равен 8 см.

Способ 1 - путем расчета по формуле (2):

Таким образом, для получения фактора разделения 4000 g необходимо установить скорость центрифугирования примерно 6700 об./мин.

Способ 2 - с использованием номограммы

На номограмме проводят прямую линию от точки 8 на шкале "Радиус центрифугирования" через точку 4000 на шкале "Фактор разделения RFS" до пересечения со шкалой "Скорость центрифугирования", точка пересечения с которой определяет скорость центрифугирования - примерно 6700 об./мин.

Примечание. Необходимо учитывать, что средний радиус определяется как расстояние от оси ротора до точки середины высоты столбика жидкости в центрифужной пробирке и будет меняться в зависимости от количества жидкости в центрифужной пробирке (высоты столбика жидкости).

1. Приказ Минтруда России от 19.04.2017 N 371н "Об утверждении Правил по охране труда при использовании отдельных видов химических веществ и материалов".

2. МУК 4.1.3534-18 "Подготовка проб для проведения исследований по определению остаточных количеств антибиотиков и антимикробных препаратов".

3. ГОСТ 1770 "Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия".

4. ГОСТ 29227 (ИСО 835-1) "Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования".

5. ГОСТ 6709 "Вода дистиллированная. Технические условия".

6. ГОСТ 4207 "Реактивы. Калий железистосинеродистый 3-водный. Технические условия".

7. ГОСТ 6995 "Реактивы. Метанол-яд. Технические условия".

8. ГОСТ 4172 "Реактивы. Натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный. Технические условия".

9. ГОСТ 245 "Реактивы. Натрий фосфорнокислый однозамещенный 2-водный. Технические условия".

10. ГОСТ 4233 "Реактивы. Натрий хлористый. Технические условия".

11. ГОСТ 4328 "Реактивы. Натрия гидроокись. Технические условия".

12. ГОСТ 4174 "Реактивы. Цинк сернокислый 7-водный. Технические условия".

13. ГОСТ 8981 "Эфиры этиловый и нормальный бутиловый уксусной кислоты технические. Технические условия".

14. ГОСТ 12026 "Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия".

15. ГОСТ 23932 "Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Общие технические условия".

16. ГОСТ 25336 "Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры".

17. ГОСТ 12.1.007 "Система стандартов безопасности труда (ССБТ). Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности".

18. ГОСТ 12.1.019 "Система стандартов безопасности труда (ССБТ). Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты".

19. ГОСТ 12.1.004 "Система стандартов безопасности труда (ССБТ). Пожарная безопасность. Общие требования".

20. ГОСТ 12.4.009 "Система стандартов безопасности труда (ССБТ). Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание".

21. ГОСТ 12.0.004 "Система стандартов безопасности труда (ССБТ). Организация обучения безопасности труда. Общие положения".

22. ГОСТ Р ИСО 5725-6 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике".