"МУК 4.1.3801-22. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств тиаметоксама и его метаболита клотианидина в орехах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 01.12.2022)

1. Разработаны ФБУН "Федеральный научный центр гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана" Роспотребнадзора (С.В. Кузьмин, В.Н. Ракитский, Н.Е. Федорова, М.С. Гречина); ФГБОУ ДПО "Российская медицинская академия непрерывного профессионального образования" (И.З. Мустафина).

2. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 1 декабря 2022 г.

3. Введены впервые.

1.1. Настоящие методические указания (далее - МУК) устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (далее - ВЭЖХ) с масс-спектрометрическим детектированием для определения в орехах массовой концентрации тиаметоксама и его метаболита клотианидина в диапазонах 0,01 - 0,1 мг/кг без разбавления и 0,01 - 5,0 мг/кг при разбавлении в 50 раз.

1.2. МУК предназначены для органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, осуществляющих контроль качества и безопасности продовольственного (пищевого) сырья и пищевой продукции, а также могут быть использованы организациями, аккредитованными в установленном порядке на проведение исследований продовольственного (пищевого) сырья, пищевой продукции.

1.3. МУК носят рекомендательный характер.

2.1. Тиаметоксам. 3-(2-хлор-1,3-тиазол-5-илметил)-5-метил[1,3,5]оксадиа-зинан-4-илиден-N-нитроамин <1>. Брутто-формула C₈H₁₀ClN₅O₃S. Молекулярная масса 291,7. Белый кристаллический порошок без запаха. Температура плавления плюс 139,1 °C. Давление паров 6,6·10^-6 мПа (при плюс 25 °C). Коэффициент распределения н-октанол/вода K_ow log P = -0,13. Растворимость в органических растворителях при плюс 25 °C (в г/дм³): ацетонитрил - 78; ацетон - 42,5; дихлорметан - 43; метанол - 10,2; этилацетат - 5,7; толуол - 0,6. Растворимость в воде при плюс 20 °C 4,1 г/дм³.

--------------------------------

<1> В соответствии с Международным союзом теоретической и прикладной химии (ИЮПАК, англ. International Union of Pure and Applied Chemistry, IUPAC).

2.2. Краткая токсикологическая характеристика: острая пероральная токсичность (LD₅₀) для крыс > 1563 мг/кг; острая дермальная токсичность (LD₅₀) для крыс > 2000 мг/кг.

2.3. Тиаметоксам - инсектицид системного и контактно-кишечного действия с трансламинарной активностью (всасывается в сосудистую систему растений и распространяется по ней, делая их ядовитыми для насекомых), подавляет колюще-сосущих и грызущих насекомых - сельскохозяйственных вредителей, в том числе скрытно-живущих и питающихся на нижней части листа.

2.4. Клотианидин. N-(2-хлор-тиазол-5-илметил)-N-метил-N-нитро-гуанидин. Брутто-формула C₆H₈ClN₅O₂S. Молекулярная масса 249,7. Светло-кремовый порошок без запаха. Температура плавления плюс 176,8 °C. Давление паров 2,8·10^-8 мПа (при плюс 25 °C). Коэффициент распределения н-октанол/вода: K_ow log P = 0,905. Растворимость в органических растворителях при плюс 25 °C (в г/дм³): ацетон - 15,2; этилацетат - 2,03; ксилол - 0,0128. Растворимость в воде при плюс 20 °C 0,34 г/дм³. Стабильный к гидролизу DT₅₀ при температуре плюс 20 °C и pH 7.

2.5. Клотианидин - инсектицид контактного, кишечного и системного действия, эффективен против сосущих насекомых, в том числе из семейств жесткокрылых, равнокрылых и двукрылых. Применяется для протравливания семян, а также для обработки почвы и зеленой массы.

3.1. При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 3.1, для соответствующих диапазонов концентраций.

Примечание. Диапазон определяемых концентраций, указанный в табл. 3.1, приведен с учетом разбавления образца в 50 раз.

4.1. Методика основана на определении веществ с помощью ВЭЖХ на обращенной фазе с тройным квадрупольным масс-спектрометрическим детектором.

4.2. Экстракцию веществ из анализируемых проб растительной продукции выполняют ацетонитрилом с использованием смеси солей для экстракции (смесь сульфата магния, хлорида натрия, цитрата натрия и натрия лимоннокислого двузамещенного, 1,5-водного), очистку экстрактов проводят методом дисперсионной твердофазной экстракции с применением смеси сорбентов на основе первичных-вторичных аминов, графитизированной сажи и октадецилсилана.

4.3. Нижний предел измерения тиаметоксама и клотианидина в анализируемом объеме пробы - 0,01 нг.

5.1. При выполнении измерений и подготовке проб применяют средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы, приведенные в табл. 5.1 - 5.3.

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.

Примечание. Допускается использование вспомогательных устройств и материалов с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

6.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать технику безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостной хроматограф.

6.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004.

6.3. При работе с газами, находящимися в баллонах под давлением до 15 МПа (150 кгс/см²), необходимо соблюдать правила <2>. Запрещается открывать вентиль баллона, не установив в нем понижающий редуктор.

--------------------------------

<2> Правила промышленной безопасности при использовании оборудования, работающего под избыточным давлением, утвержденные приказом Ростехнадзора от 15.12.2020 N 536 (зарегистрировано Минюстом России 31.12.2020, регистрационный N 61998).

6.4. Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист, имеющий опыт работы на жидкостном хроматографе с тройным квадрупольным масс-спектрометрическим детектором, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений.

7.1. При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха плюс 15 - 30 °C и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией на прибор.

8.1. Очистка растворителей. Ацетонитрил кипятят с обратным холодильником над пентоксидом фосфора (на 1 дм³ ацетонитрила 20 г пентоксида фосфора) не менее 1 часа, после чего перегоняют. Непосредственно перед употреблением ацетонитрил повторно перегоняют над прокаленным карбонатом калия (на 1 дм³ ацетонитрила 10 г карбоната калия). Хранят в емкости из темного стекла.

8.2. Подготовка подвижной фазы для ВЭЖХ.

8.2.1. Компонент А: мерную колбу вместимостью 1000 см³ помещают (0,50 +/- 0,01) г формиата аммония, растворяют в 300 - 400 см³ бидистиллированной воды, вносят 0,1 см³ муравьиной кислоты, доводят водой до метки, перемешивают и дегазируют.

8.2.2. Компонент Б: в мерную колбу вместимостью 1000 см³ помещают 300 - 400 см³ метанола, вносят 0,1 см³ муравьиной кислоты, доводят метанолом до метки, перемешивают и дегазируют.

Каждый компонент подвижной фазы хранят в темном месте (в емкости из темного стекла) не более 14 дней.

8.3. Кондиционирование хроматографической колонки для ВЭЖХ.

Промывают колонку подвижной фазой (смесь компонентов А и Б, приготовленных по п. 8.2, в соотношении 1:1) при скорости подачи растворителя 0,3 см³/мин до установления стабильной базовой линии.

8.4. Приготовление раствора уксусной кислоты в ацетонитриле с объемной долей 1% (1%-й раствор).

В мерную колбу вместимостью 1000 см³ помещают 300 - 400 см³ ацетонитрила, вносят 10 см³ ледяной уксусной кислоты, перемешивают, доводят ацетонитрилом до метки, вновь перемешивают. Раствор хранят в темном месте (в емкости из темного стекла) не более 14 дней.

8.5. Приготовление смеси солей для экстракции.

Для приготовления одного набора смеси солей для экстракции смешивают (4,00 +/- 0,01) г магния сернокислого, (1,00 +/- 0,01) г натрия хлористого, (1,00 +/- 0,01) г натрия лимоннокислого трехзамещенного и (0,50 +/- 0,01) г натрия лимоннокислого двузамещенного 1,5-водного. До использования хранят в герметичной упаковке (не более 6 месяцев).

Примечание. Возможно использование наборов солей для экстракции проб фруктов и овощей массой 10 г.

8.6. Приготовление смеси сорбентов для очистки экстрактов.

Для приготовления одного набора смеси сорбентов для очистки экстрактов в центрифужную полипропиленовую пробирку вместимостью 2 см³ помещают (50 +/- 4) мг сорбента для твердофазной экстракции на основе смеси первичных и вторичных аминов, (150 +/- 4) мг магния сернокислого, (50 +/- 4) мг твердофазного сорбента на основе октадецилсилана и (50 +/- 4) мг графитизированной сажи, закрывают герметично крышкой, встряхивают для перемешивания, хранят не более 6 месяцев.

Примечание. Возможно использование дисперсионных наборов для фруктов и овощей с маслом и пигментами, помещенных в полипропиленовые пробирки вместимостью 2 см³.

8.7. Приготовление градуировочных растворов.

8.7.1. Исходный раствор тиаметоксама для градуировки (концентрация 100 мкг/см³).

В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают (0,0100 +/- 0,0005) г тиаметоксама, добавляют 50 - 70 см³ ацетонитрила, перемешивают, доводят ацетонитрилом до метки, вновь перемешивают. Раствор хранят в холодильнике при температуре плюс (2 - 6) °C не более 6 месяцев.

8.7.2. Исходный раствор клотианидина для градуировки (концентрация 100 мкг/см³).

В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают (0,0100 +/- 0,0005) г клотианидина, добавляют 50 - 70 см³ ацетонитрила, перемешивают, доводят ацетонитрилом до метки, вновь перемешивают. Раствор хранят в холодильнике при температуре плюс (2 - 6) °C не более 6 месяцев.

Растворы N 1 - 7 готовят объемным методом путем последовательного разбавления исходных растворов для градуировки.

8.7.3. Раствор N 1 тиаметоксама и клотианидина для градуировки и внесения (концентрация 10 мкг/см³).

В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 10 см³ исходного раствора тиаметоксама (п. 8.7.1) и клотианидина (п. 8.7.2) с концентрациями 100 мкг/см³, доводят до метки ацетонитрилом, тщательно перемешивают, получают рабочий раствор N 1 с концентрацией тиаметоксама и клотианидина 10 мкг/см³. Раствор N 1 хранят в холодильнике при температуре плюс (2 - 6) °C не более 3 месяцев.

8.7.4. Раствор N 2 тиаметоксама и клотианидина для градуировки и внесения (концентрация 1 мкг/см³).

В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 10 см³ раствора N 1 с концентрациями тиаметоксама и клотианидина 10 мкг/см³, доводят до метки ацетонитрилом, тщательно перемешивают, получают рабочий раствор N 2 с концентрацией тиаметоксама и клотианидина 1 мкг/см³. Раствор N 2 хранят в холодильнике при температуре плюс (2 - 6) °C не более месяца.

Эти растворы используют для приготовления проб с внесением при оценке полноты извлечения действующих веществ методом "внесено-найдено" и контроля качества результатов измерений методом добавок.

8.7.5. Рабочие растворы N 3 - 7 тиаметоксама и клотианидина для градуировки (концентрации 0,005 - 0,1 мкг/см³).

В 5 мерных колб вместимостью 100 см³ помещают 10,0; 5,0; 2,0; 1,0 и 0,5 см³ градуировочного раствора N 2 с концентрацией тиаметоксама и клотианидина 1 мкг/см³ (п. 8.7.4), доводят до метки раствором, приготовленным по п. 8.4, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы N 3 - 7 с концентрациями тиаметоксама и клотианидина 0,1; 0,05; 0,02; 0,01 и 0,005 мкг/см³ соответственно. Растворы хранят в холодильнике при температуре плюс (2 - 6) °C не более одной недели.

8.8. Установление градуировочных характеристик.

Градуировочные характеристики, выражающие зависимость площади пика (I) от концентрации тиаметоксама и клотианидина в растворе (мкг/см³), устанавливают методом абсолютной калибровки по 5 растворам для градуировки N 3 - 7.

В инжектор хроматографа вводят по 2 мм³ каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования, указанных в п. 10.3. Осуществляют не менее 3 параллельных измерений.

8.9. Контроль стабильности градуировочной характеристики.

Контроль стабильности градуировочных характеристик проводят в начале и по окончании каждой серии анализов.

При контроле стабильности градуировочной характеристики проводят измерение не менее двух образцов концентраций для градуировки, содержание тиаметоксама и клотианидина в которых должно охватывать весь диапазон концентраций от 0,005 до 0,1 мкг/см³.

Градуировочная характеристика считается стабильной, если для каждого используемого для контроля градуировочного раствора сохраняется соотношение (A):

где A - величина расхождения, %;

X - концентрация тиаметоксама или клотианидина в пробе при контрольном измерении, мкг/см³;

C - известная концентрация градуировочного раствора, взятая для контроля стабильности градуировочной характеристики, мкг/см³;

B - норматив контроля стабильности градуировочной характеристики, % (равен 20% при P = 0,95).

9.1. Отбор проб осуществлен в соответствии с методическими документами <3>.

--------------------------------

<3> Унифицированные правила отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов, утвержденные заместителем Главного государственного санитарного врача СССР 21.08.1979 N 2051-79; ГОСТ 32874 "Межгосударственный стандарт. Орехи грецкие. Технические условия"; ГОСТ 31784 "Межгосударственный стандарт. Арахис. Технические условия".

9.2. Растительные пробы хранят при температуре плюс 2 - 6 °C не более недели. Для длительного хранения образцы замораживают и хранят при температуре не выше минус 18 °C. Перед анализом образцы измельчают.

10.1. Экстракция.

Измельченный образец орехов массой 5 г помещают в центрифужную полипропиленовую пробирку вместимостью 50 см³. Вносят 5 см³ бидистиллированной воды для увлажнения и выдерживают 5 - 10 минут. Затем вносят 10 см³ ацетонитрила и перемешивают. В пробирку помещают керамический гомогенизатор, закрывают крышку и интенсивно встряхивают вручную в течение 2 мин, добавляют в пробирку смесь солей для экстракции (приготовленную по п. 8.5), закрывают крышкой и интенсивно встряхивают (вручную) в течение 1 мин. Затем пробу центрифугируют 5 мин при скорости вращения 4000 об/мин.

Пробирку с экстрактом помещают в морозильную камеру на 2 - 2,5 часа при температуре не выше минус 18 °C. Полученный холодный образец центрифугируют 2 мин при скорости вращения 4000 об/мин.

10.2. Очистка экстракта.

Часть экстракта (верхний слой в пробирке после центрифугирования) объемом 1 - 1,5 см³ с помощью пипетки переносят в пропиленовую центрифужную пробирку вместимостью 2 см³, содержащую смесь сорбентов, приготовленную по п. 8.6. Закрывают крышку и интенсивно встряхивают вручную в течение 30 сек. Центрифугируют 5 мин при скорости вращения 4000 об/мин. Отбирают с помощью медицинского шприца очищенный экстракт и фильтруют через мембранный фильтр (размер пор 0,20 мкм) в виалу вместимостью 2 см³ с фторопластовой прокладкой и навинчивающейся крышкой. Помещают в автосамплер хроматографа для анализа в условиях хроматографирования по п. 10.3.

10.3. Измерения выполняют на жидкостном хроматографе с тандемным масс-спектрометрическим детектором: тройной квадруполь с источником ионизации, оснащенным соосной подачей горячего азота для эффективной десольвации ионов при следующих режимных параметрах:

- источник ионизации - электростатическое распыление;

- режим работы - регистрация дочерних положительных ионов после разрушения материнских ионов (регистрация "перехода").

Параметры масс-спектрометрического детектора для тиаметоксама:

- материнский ион (масса/заряд): 292,2;

- дочерние ионы (масса/заряд): 211 (количественный расчет), 181;

- напряжение на фрагментаторе, В: 85;

- энергия разрушения (соударения), В: 4 , 16 .

Параметры масс-спектрометрического детектора для клотианидина:

- материнский ион (масса/заряд): 250;

- дочерние ионы (масса/заряд): 169,1 (количественный расчет), 132,1;

- напряжение на фрагментаторе, В: 90;

- энергия разрушения (соударения), В: 7 , 15 .

Скорость сканирования: 200 мс.

Давление на распылителе: 35 psi.

Скорость распыляющего газа 1 (азот): 10 дм³/мин.

Температура газа 1: плюс 250 °C.

Скорость осушающего газа 2 (азот): 11 дм³/мин.

Температура газа 2: плюс 340 °C.

Температура квадруполей (1 и 3): плюс 100 °C.

Условия хроматографирования:

- хроматографическая колонка стальная длиной 150 мм, внутренним диаметром 2,1 мм, заполненная обращенно-фазным сорбентом с привитыми монофункциональными полярными группами C18, зернением 1,8 мкм;

- температура колонки: плюс 45 °C;

- скорость потока элюента: 0,3 см³/мин;

- объем вводимой пробы: 2 мм³;

- подвижная фаза: компонент А - раствор 0,05%-й (вес/объем) формиата аммония + 0,01%-й раствор муравьиной кислоты (по объему) в воде; компонент Б - раствор 0,01%-й (по объему) муравьиной кислоты в метаноле.

Режим элюирования градиентный (табл. 10.1), общее время анализа 8 мин, включая промывку колонки после анализа, 2 мин.

Линейный диапазон детектирования 0,01 - 0,2 нг.

Образцы, дающие пики, большие, чем градуировочный раствор с концентрацией 0,1 мкг/см³, разбавляют подвижной фазой (не более чем в 50 раз).

11.1. Содержание тиаметоксама и его метаболита клотианидина в пробах орехов (X, мг/кг) рассчитывают по формуле:

где C - концентрация тиаметоксама или клотианидина, найденная по градуировочному графику в соответствии с величиной площади хроматографического пика, мкг/см³;

V_кон - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, см³;

m - масса анализируемого образца, г;

Кр - коэффициент разбавления (если экстракт подвергался разбавлению).

11.2. Проверка приемлемости результатов параллельных определений.

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:

где X₁, X₂ - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости (табл. 3.1), при этом .

При невыполнении условия выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

12.1. Результат анализа представляют в виде:

где - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

- граница абсолютной погрешности, мг/кг;

где - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 3.1), %.

Если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде: "Содержание тиаметоксама или клотианидина в пробах орехов менее 0,01 мг/кг" <4>.

--------------------------------

<4> 0,01 мг/кг - нижний предел количественного определения тиаметоксама и клотианидина.

13.1. Контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725(1 - 6).

Периодичность и формы контроля определяются руководством по качеству.

1. Федеральный закон от 30.03.1999 N 52-ФЗ "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения".

2. Приказ Ростехнадзора от 15.12.2020 N 536 "Об утверждении федеральных норм и правил в области промышленной безопасности "Правила промышленной безопасности при использовании оборудования, работающего под избыточным давлением" (зарегистрирован Минюстом России 31.12.2020, регистрационный N 61998).

3. Унифицированные правила отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов, утвержденные заместителем Главного государственного санитарного врача СССР 21.08.1979 N 2051-79.

4. ГОСТ Р ИСО 5725(1 - 6) "Государственный стандарт Российской Федерации. Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

5. ГОСТ Р 53228 "Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания".

6. ГОСТ OIML R 111-1 "Межгосударственный стандарт. Государственная система обеспечения единства измерений (ГСИ). Гири классов E(1), E(2), F(1), F(2), M(1), M(1-2), M(2), M(2-3) и M(3). Часть 1. Метрологические и технические требования".

7. ГОСТ 1770 "Межгосударственный стандарт. Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия".

8. ГОСТ 29227 "Межгосударственный стандарт. Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования".

9. ГОСТ 25336 "Межгосударственный стандарт. Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры".

10. ГОСТ 9293 (ИСО 2435) "Межгосударственный стандарт. Азот газообразный и жидкий. Технические условия".

11. ГОСТ 5848 "Государственный стандарт союза ССР. Реактивы. Кислота муравьиная. Технические условия".

12. ГОСТ 61 "Межгосударственный стандарт. Реактивы. Кислота уксусная. Технические условия".

13. ГОСТ 6995 "Государственный стандарт союза ССР. Реактивы. Метанол-яд. Технические условия".

14. ГОСТ 4221 "Государственный стандарт союза ССР. Калий углекислый. Технические условия".

15. ГОСТ 4233 "Межгосударственный стандарт. Реактивы. Натрий хлористый. Технические условия".

16. ГОСТ 22280 "Межгосударственный стандарт. Реактивы. Натрий лимоннокислый 5,5-водный. Технические условия".

17. ГОСТ Р 52501 "Вода для лабораторного анализа. Технические условия".

18. ГОСТ ISO 7886-1 "Межгосударственный стандарт. Шприцы инъекционные однократного применения стерильные. Часть 1. Шприцы для ручного использования".

19. ГОСТ 12.1.004 "Межгосударственный стандарт. Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования".

20. ГОСТ 12.1.007 "Межгосударственный стандарт. Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности".

21. ГОСТ 12.1.019 "Межгосударственный стандарт. Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты".

22. ГОСТ 12.0.004 "Межгосударственный стандарт. Система стандартов безопасности труда. Организация обучения безопасности труда. Общие положения".

23. ГОСТ 12.4.009 "Межгосударственный стандарт. Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание".

24. ГОСТ 32874 "Межгосударственный стандарт. Орехи грецкие. Технические условия".

25. ГОСТ 31784 "Межгосударственный стандарт. Арахис. Технические условия".