"МУК 4.1.3625-20. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств фенпропидина в воде и почве методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 05.08.2020)

1. Разработаны ФБУН "Федеральный научный центр гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана" Роспотребнадзора (В.Н. Ракитский, Н.Е. Федорова, Л.Г. Бондарева).

2. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 05 августа 2020 г.

3. Введены впервые.

1.1. Настоящие методические указания (далее - МУК) устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (далее - ВЭЖХ) для определения в воде и почве массовой концентрации фенпропидина в диапазоне 0,0005 - 0,0100 мг/дм³ и 0,01 - 0,20 мкг/кг соответственно.

1.2. МУК предназначены для органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, а также могут быть использованы организациями, осуществляющими исследования в области безопасности окружающей среды.

1.3. Методические указания носят рекомендательный характер.

2.1. Фенпропидин. RS-1-[4-третбутилфенил)-2-метилпропил]пиперидин <1>. Брутто формула C₁₉H₃₁N. Молекулярная масса 273,5.

--------------------------------

<1> В соответствии с Международным союзом теоретической и прикладной химии (ИЮПАК, англ. International Union of Pure and Applied Chemistry, IUPAC).

2.2. Физические и химические свойства: химически чистое вещество представляет собой бледно-желтую слегка вязкую жидкость без запаха. Давление пара (25 °C) 17 Па. Растворимость в воде (25 °C, мг/дм³): 530 (pH 7), 6,2 (pH 9). Легко смешивается с ацетоном, этанолом, толуолом, н-октаном и гексаном (25 °C). Стабилен при хранении в закрытом контейнере при комнатной температуре по крайней мере в течение 3 месяцев. Водные растворы устойчивы к воздействию УФ-света и гидролизу при 80 °C (pH 4,7 и 10). pK_a 10,1 (сильное основание). Коэффициент распределения в системе н-октанол-вода - K_owlog = 2,9 (pH 7,25 °C).

2.3. Фенпропидин является фунгицидом химического класса пиперидинов системного и профилактического действия. Механизм его действия заключается в ингибировании биосинтеза стиролов. Он особенно эффективен против таких болезнетворных микроорганизмов, как Erysiphe graminis, Rhynchosporium secalis и Puccinia.

3.1. При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 3.1, для соответствующих диапазонов концентраций (в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1 - 6).

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для всего диапазона измерений (n = 20) приведены в табл. 3.2.

4.1. Методика основана на определении вещества с помощью ВЭЖХ с ультрафиолетовым (диодно-матричным) детектором.

4.2. Уровень фенпропидина в пробах воды определяют после очистки и концентрирования на картридже, заполненном пористым сорбентом на основе сополимера N-винилпирролидона и дивинилбензола. Элюирование фенпропидина проводят ацетонитрилом.

Экстракцию фенпропидина из анализируемых проб почвы выполняют смесью ацетонитрила и воды с добавлением 1 см³ ледяной уксусной кислоты, с последующей очисткой экстракта на картридже, заполненном пористым сорбентом на основе сополимера N-винилпирролидона и дивинилбензола.

4.3. Нижний предел измерения фенпропидина в анализируемом объеме пробы - 1 нг.

4.4. Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.

5.1. При выполнении измерений и подготовке проб применяют средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы, приведенные в табл. 5.1 - 5.3.

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.

Примечание. Допускается использование вспомогательных средств измерений, устройств и материалов с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

6.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

6.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004.

6.3. Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист, имеющий опыт работы на жидкостном хроматографе, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений.

7.1. При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

8.1. Очистка растворителей.

8.1.1. Ацетонитрил. Ацетонитрил кипятят с обратным холодильником над пентоксидом фосфора (на 1 дм³ ацетонитрила 20 г пентоксида фосфора) не менее 1 часа, после чего перегоняют. Непосредственно перед употреблением ацетонитрил повторно перегоняют над прокаленным карбонатом калия (на 1 дм³ ацетонитрила 10 г карбоната калия). Хранят в емкости из темного стекла.

8.2. Подготовка подвижной фазы для ВЭЖХ.

8.2.1. Приготовление раствора ортофосфорной кислоты с массовой долей 0,2% (0,2%-й раствор). В мерную колбу вместимостью 1000 см³ помещают 500 см³ бидистиллированной или деионизованной воды, 2 см³ ортофосфорной кислоты, перемешивают, доводят до метки бидистиллированной или деионизованной водой и еще раз тщательно перемешивают.

8.2.2. Приготовление подвижной фазы. В мерную колбу вместимостью 1000 см³ помещают 600 см³ ацетонитрила и 400 см³ 0,2%-го раствора ортофосфорной кислоты, перемешивают, фильтруют и дегазируют.

Подвижную фазу хранят в темном месте (в емкости из темного стекла) не более 14 дней.

8.3. Кондиционирование хроматографической колонки для ВЭЖХ.

Промывают колонку подвижной фазой (п. 8.2.2) при скорости подачи растворителя 0,5 см³/мин до установления стабильной базовой линии.

8.4. Приготовление градуировочных растворов и растворов внесения.

8.4.1. Исходный раствор фенпропидина для градуировки (концентрация 100 мкг/см³). В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 0,0100 +/- 0,0005 г фенпропидина, растворяют в 50 - 60 см³ ацетонитрила, доводят ацетонитрилом до метки, тщательно перемешивают.

Раствор хранят в холодильнике при температуре 4 - 6 °C не более месяца.

8.4.2. Рабочий раствор N 1 фенпропидина для градуировки и внесения (концентрация 10,0 мкг/см³). В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 10,0 см³ исходного градуировочного раствора с концентрацией 100,0 мкг/см³ (пп. 8.4.1), доводят до метки ацетонитрилом, тщательно перемешивают, получают рабочий раствор N 1 с концентрацией фенпропидина 10,0 мкг/см³.

Раствор хранят в холодильнике при температуре 4 - 6 °C не более месяца.

Этот раствор используют для приготовления проб с внесением при оценке полноты извлечения действующего вещества методом "внесено-найдено" и контроля качества результатов измерений методом добавок.

8.4.3. Рабочие растворы N 2 - 6 фенпропидина для градуировки (концентрация 0,1 - 1,0 мкг/см³). В 5 мерных колб вместимостью 100 см³ помещают 0,5; 1,0; 2,5; 5,0; 10,0 см³ рабочего раствора N 1 с концентрациями 10,0 мкг/см³ (п. 8.4.2), доводят до метки подвижной фазой, приготовленной по п. 8.2.2, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы N 2 - 6 с концентрациями фенпропидина 0,05; 0,1; 0,25; 0,5; 1,0 мкг/см³.

Растворы хранят в холодильнике при температуре 4 - 6 °C не более суток.

8.5. Приготовление смесей органических растворителей для экстракции.

8.5.1. Смесь ацетонитрил-вода = 8:2 (по объему).

В мерную колбу на 500 см³ вносят 400 см³ ацетонитрила и 100 см³ бидистиллированной воды. Тщательно перемешивают.

8.5.2. Смесь ацетонитрил-вода = 2:8 (по объему).

В мерную колбу на 500 см³ вносят 100 см³ ацетонитрила и 400 см³ бидистиллированной воды. Тщательно перемешивают.

8.6. Подготовка картриджа для очистки и концентрирования.

Картридж устанавливают на аллонж с прямым отводом для вакуума. Промывают картридж последовательно 1 см³ метанола, 1 см³ ацетонитрила, затем три раза по 1 см³ смесью ацетонитрил-вода в соотношении 2:8 по объему, приготовленной по п. 8.5.2. Процедуру проводят с использованием вакуума. Скорость элюирования - 15 - 20 капель в минуту. Не допускать высыхания верхнего слоя сорбента в картридже.

8.7. Установление градуировочной характеристики.

Градуировочную характеристику, выражающую линейную зависимость площади пика от концентрации фенпропидина в растворе, устанавливают методом абсолютной калибровки по 5 растворам для градуировки.

В инжектор хроматографа вводят по 20 мм³ каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования, указанных в п. 10.3. Осуществляют не менее 3 параллельных измерений. Устанавливают площади пиков фенпропидина, на основании которых строят градуировочную зависимость.

Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят в начале и по окончании каждой серии анализов.

При контроле стабильности градуировочной характеристики проводят измерения не менее двух градуировочных растворов, содержание фенпропидина в которых должно входить в диапазон линейности градуировочной характеристики от 0,05 до 1,0 мкг/см³.

Градуировочная характеристика считается стабильной, если для каждого используемого для контроля градуировочного раствора сохраняется соотношение:

где X - концентрация фенпропидина в пробе при контрольном измерении, мкг/см³;

C - известная концентрация градуировочного раствора фенпропидина, взятая для контроля стабильности градуировочной характеристики, мкг/см³;

B - норматив контроля погрешности градуировочной характеристики, % (B = 10% при P = 0,95).

9.1. Отбор проб осуществляется в соответствии с действующими методическими документами <2>.

--------------------------------

<2> Унифицированные правила отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов от 21.08.1979 N 2051-79.

9.2. Пробы воды отбирают и хранят в бутылях из полиэтилена (полипропилена) при температуре 4 +/- 2 °C не более недели.

9.3. Пробы почвы подсушивают и хранят при комнатной температуре не более 2 недель. Для длительного хранения образцы замораживают и хранят при температуре не выше -18 °C.

10.1. Вода.

Образец воды объемом 200 см³ отмеряют мерным цилиндром, переносят в коническую колбу на 250 см³. Добавляют 1 см³ метанола, тщательно перемешивают в течение 5 минут. После чего подготовленную пробу воды пропускают через подготовленный в соответствии с п. 8.6 картридж со скоростью 15 - 20 капель в минуту. Процедуру выполняют с использованием вакуума. После пропускания пробы картридж четыре раза по 1 см³ промывают смесью ацетонитрил-вода в соотношении 2:8, приготовленной в соответствии с п. 8.5.2. Фенпропидин элюируют с картриджа ацетонитрилом 2 раза по 1 см³. Элюат собирают в круглодонную колбу объемом 50 см³. Упаривают на роторном испарителе при температуре не выше 30 °C до влажного остатка. Остаток в круглодонной колбе растворяют в 2 см³ смеси ацетонитрил-вода в соотношении 8:2, приготовленной в соответствии с п. 8.5.1. Фильтруют через мембранный фильтр.

10.2. Почва.

Навеску почвы массой 10 г помещают в коническую колбу объемом 250 см³. Добавляют 50 см³ смеси ацетонитрил-вода, в соотношении 8:2, приготовленной согласно п. 8.5.1. Перемешивают и оставляют в покое на 15 мин. Через 15 мин добавляют 1 см³ ледяной уксусной кислоты и помещают на встряхиватель на 30 минут. После чего смеси дают отстояться. Раствор осторожно (для предотвращения взмучивания) фильтруется через неплотный бумажный фильтр. Осадок в колбе заливают 30 см³ смесью ацетонитрил-вода (8:2), приготовленной согласно п. 8.5.1. Экстрагируется в течение 15 минут на встряхивателе. После отстаивания раствор фильтруют через неплотный бумажный фильтр. Фильтраты объединяются и переносятся в круглодонную колбу объемом 250 см³. Упаривают на ротационном вакуумном испарителе, при температуре не выше 30 °C до водного остатка. Водный остаток пропускают через подготовленный в соответствии с п. 8.6 картридж со скоростью 15 - 20 капель в минуту. После пропускания пробы картридж четыре раза по 1 см³ промывают смесью ацетонитрил-вода в соотношении 2:8, приготовленной в соответствии с п. 8.5.2. Фенпропидин элюируют с картриджа ацетонитрилом 2 раза по 1 см³. Элюат собирают в круглодонную колбу объемом 50 см³. Упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C до влажного остатка. Остаток в круглодонной колбе растворяют в 2 см³ смеси ацетонитрил-вода в соотношении 8:2, приготовленной в соответствии с п. 8.5.1.

10.3. Условия хроматографирования.

Измерения выполняют при следующих режимных параметрах:

- жидкостный хроматограф с быстросканирующим ультрафиолетовым детектором, снабженный дегазатором и термостатом колонки;

- хроматографическая колонка стальная длиной 250 мм, внутренним диаметром 4,6 мм, заполненная обращенно-фазным сорбентом с привитыми алкильными группами (C-18 или C-8) для удерживания гидрофильных соединений, зернением 5 мкм;

- рабочая длина волны 220 нм;

- температура колонки 30 °C;

- подвижная фаза: ацетонитрил - 0,2% ортофосфорная кислота (60:40, по объему);

- скорость потока элюента 0,5 см³/мин;

- объем вводимой пробы 20 мм³;

- линейный диапазон детектирования 1 - 20 нг.

11.1. Содержание фенпропидина в пробах воды, почвы (X, мг/дм³, мг/кг) рассчитывают по формуле:

где C - концентрация фенпропидина, полученная по градуировочному графику в соответствии с площадью хроматографического пика, мкг/см³;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, см³;

m - масса (объем) анализируемого образца, г, см³;

f - полнота извлечения (табл. 3.2), %;

100 - коэффициент перевода полноты извлечения в относительные единицы.

12.1. За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

где X₁, X₂ - результаты параллельных определений, мг/дм³, мг/кг;

r - значение предела повторяемости (табл. 1), при этом .

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

13.1. Результат анализа представляют в виде:

где - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг, мг/дм³;

- граница абсолютной погрешности, мг/дм³, мг/кг;

где - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 3.1), %.

Если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде: "Содержание фенпропидина в пробе воды - менее 0,0005 мг/дм³; в пробе почвы - менее 0,0100 мг/кг" <3>.

--------------------------------

<3> 0,0005 мг/дм³; 0,0100 мг/кг - пределы обнаружения фенпропидина в воде, почве соответственно.

14.1. Организация контроля качества результатов определения осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-(1 - 6).

14.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.

Величина добавки C_д должна удовлетворять условию:

где - характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно), мг/кг, при этом:

где - граница абсолютной погрешности, мг/кг, мг/дм³.

где - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, таблица 3.1), %.

Результат контроля процедуры K_к рассчитывают по формуле:

где , , C_д - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми в главе XII) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки соответственно, мг/кг, мг/дм³.

Норматив контроля K рассчитывают по формуле:

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (K_к) с нормативом контроля (K).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию:

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (1) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (1) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

14.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости. Расхождение между результатами измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), не должно превышать предела воспроизводимости (R):

где X₁, X₂ - результаты измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), мг/кг;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 3.1), %.

1. ГОСТ Р ИСО 5725 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

2. ГОСТ Р 53228 "Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания".

3. ГОСТ OIML R 111-1 "Государственная система обеспечения единства измерений (ГСИ). Гири классов E(1), E(2), F(1), F(2), M(1), M(1-2), M(2), M(2-3) и M(3). Часть 1. Метрологические и технические требования".

4. ГОСТ 29227 "Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования".

5. ГОСТ 2603 "Реактивы. Ацетон. Технические условия".

6. ГОСТ 12026-76 "Бумага фильтровальная лабораторная".

7. ГОСТ 20490 "Реактивы. Калий марганцовокислый. Технические условия".

8. ГОСТ Р 52501 "Вода для лабораторного анализа. Технические условия".

9. ГОСТ 4221 "Реактивы. Калий углекислый. Технические условия".

10. ГОСТ 61 "Реактивы. Кислота уксусная. Технические условия".

11. ГОСТ 6995 "Реактивы. Метанол-яд. Технические условия".

12. ГОСТ 25336 "Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры".

13. ГОСТ 12026 "Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия".

14. ГОСТ 1770 "Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия".

15. ГОСТ 12.1.004 "Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования".

16. ГОСТ 12.1.007 "Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности".

17. ГОСТ 12.1.018 "Система стандартов безопасности труда. Пожаровзрывобезопасность статического электричества. Общие требования".

18. ГОСТ 12.1.019 "Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты".

19. ГОСТ 17.2.3.01 "Охрана природы. Атмосфера. Правила контроля качества воздуха населенных пунктов".

20. ГОСТ 12.4.009 "Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание".

21. ГОСТ 12.0.004 "Система стандартов безопасности труда (ССБТ). Организация обучения безопасности труда. Общие положения".

22. ГОСТ 28498 "Термометры жидкостные стеклянные. Общие технические требования. Методы испытаний".

23. Унифицированные правила отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов от 21.08.1979 N 2051-79.