"МУК 4.1.032-95. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение аманитинов и фаллоидина в сырых грибах и продуктах их переработки. Методические указания"
(утв. Госкомсанэпиднадзором России 24.07.1995)

1. Разработаны: Институтом питания РАМН (Тутельян В.А., Хотимченко С.А., Бессонов В.В.); Российским Республиканским информационно-аналитическим центром Госкомсанэпиднадзора России (Агеев В.П.); Госкомсанэпиднадзором России (Петухов А.И.).

2. Утверждены и введены в действие Председателем Госкомсанэпиднадзора России - Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Е.Н. Беляевым 24 июля 1995 г.

3. Введены впервые.

Настоящие Методические указания устанавливают ТСХ и ВЭЖХ/УФ-спектрофотометрические методы определения аманитинов и фаллоидина в сырых грибах и продуктах их переработки.

Метод ТСХ предназначается для проведения рутинных и скрининговых исследований, а метод ВЭЖХ предназначается для проведения арбитражных анализов и подтверждения результатов определений, полученных методом ТСХ.

Методические указания предназначены для учреждений госсанэпиднадзора и других ведомств, осуществляющих контроль качества и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов.

Анализ включает в себя пробоподготовку методом жидкостно-жидкостной экстракции метанолом, разделения токсинов хроматографией в тонком слое сорбента, детектировании зон абсорбции и количественное определение содержания токсинов визуальным методом либо с применением денситометра (отражательного спектрофотометра).

Идентификацию токсинов осуществляют сравнением подвижностей обнаруженных в условиях ТСХ веществ с подвижностью соответствующего стандарта.

Нижний предел определения аманитинов и фаллоидина - 0,03 мг/кг продукта.

Навеска массой 50 - 150 г отбирается из средней пробы, подготовленной в соответствии с действующими ГОСТами на конкретный вид продукции. Отобранные образцы можно хранить в морозильной камере при температуре -8 °С до 10 суток, при температуре -18 °С - до 3-х месяцев.

Весы технические по ГОСТу 19491-74 и весы аналитические по ГОСТу 24104-80.

Шкаф сушильный, нагревательные приборы (электронагреватель по ГОСТу 13268-83, колбонагреватель или электроплитка по ГОСТу 14919-83).

Ротационный испаритель с ловушкой по ТУ 25-11-917-76.

Насос водоструйный по ГОСТу 10696-75.

Денситометр фирмы "Shimadzu" или подобный.

Контактные термометры по ГОСТу 9871-75.

Весы лабораторные общего назначения по ГОСТу 24104-80 с наибольшим пределом взвешивания до 500 г с пределом допустимой погрешности +/- 0,038 г.

Микрошприц МШ-10 на 10 мкл или калиброванные стеклянные капилляры.

Аппарат Сокслета.

Воронка Бюхнера по ГОСТу 9147-80.

Мясорубка или гомогенизатор по ГОСТу 15906-79.

Бумажные фильтры обеззоленные марки ФОМ по ТУ 6-09-1678-77.

Цилиндры мерные на 25, 50, 100, 200 мл по ГОСТу 1770-74.

Колбы мерные или пробирки мерные 2, 5, 25, 50 мл по ГОСТу 1770-74.

Колбы круглодонные на 1000, 500, 250, 100 и 50 мл по ТУ 48-52.

Диэтиловый эфир по ГОСТу 842006-82.

Спирт метиловый по ГОСТу 6995-77.

Хлороводородная кислота по ГОСТу 14261-77.

Уксусная кислота по ГОСТу 61-75.

Хлороформ по ГОСТу 20015-74.

Коричный альдегид.

Вода дистиллированная по ГОСТу 6709-72.

Пластинки для ТСХ.

Стандартные и рабочие растворы:

альфа-аманитин, бета-аманитин, фаллоидин - раствор в метаноле концентрации 1 мг/мл.

Помещение, в котором производится определение токсинов, обязательно должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией.

Работу с образцами, стандартами, другими химическими соединениями и растворителями проводить в вытяжном шкафу с использованием индивидуальных средств защиты (очки, перчатки и др.).

В лаборатории, где проводится работа с высокотоксичными токсинами, необходимо всегда иметь достаточное количество этилового спирта для детоксикации, при попадании его на рабочие места и пол.

Транспортировка и хранение токсинов осуществляется в стеклянных запаянных ампулах, обернутых в бумагу и упакованных в металлическую тару.

1.5.1. Приготовление стандартных растворов.

Стандартные растворы токсинов с концентрацией 1 мг/мл используются при анализе в качестве калибровочного стандарта, готовятся из 1 мг сухого стандарта токсина с чистотой 90%, растворив его в 1 мл метанола для хроматографии. Срок хранения стандартного раствора - 3 месяца при -3 °С.

1.5.2. Подготовка хроматографической пластинки.

Хроматографическую пластинку непосредственно перед анализом промывают диэтиловым эфиром и активируют в сушильном шкафу в течение 1 часа при температуре 110 °С.

1.5.3. Подготовка системы для ТСХ.

Разделение токсинов проводят в системе растворителей:

хлороформ - 5%-ный раствор коричного альдегида в метаноле - уксусная кислота - вода в соотношении 77:33:5:7,5.

Систему помещают в камеру для ТСХ для предварительного ее насыщения парами растворителей в течение 1 часа.

Навеску 50 - 80 г измельченных в мясорубке или гомогенизаторе грибов помещают в аппарат Сокслета, добавляют 100 мл метанола и регулируют нагрев таким образом, чтобы один цикл экстракции завершался за 15 минут.

После прохождения 6 циклов метанольный экстракт сливают, отфильтровывают, помещают в круглодонную колбу и упаривают на ротационном испарителе при температуре не выше 60 °С досуха. Сухой остаток перерастворяют в 2 мл метанола.

На линию старта хроматографической пластинки, подготовленной по п. 1.5.2, микрошприцами наносят: 50 мкл полученного метанольного экстракта, растворы стандартных образцов, соответствующих 50 мкг (50 мкл стандартного раствора), 25 мкг (25 мкл стандартного раствора) и 75 мкг токсина в пятне.

Помещают хроматографическую пластинку в камеру с системой для ТСХ, предварительно насыщенную парами растворителей, как указано в п. 1.5.3.

По достижении линией фронта верхнего края пластинки, пластинку вынимают, высушивают на воздухе и помещают в эксикатор, на дно которого налита концентрированная хлороводородная кислота. При этом зоны абсорбции визуализуются: аманитины окрашиваются в фиолетовый цвет, фаллоидины - в розовый, сопутствующие вещества - в желтый.

Порядок элюирования токсинов - бета-аманитин, альфа-аманитин, фаллоидин.

Токсины считаются надежно идентифицированными, если разница величин Rf исследуемого пятна и пятна стандартного образца не превышает 0,04.

Количественное определение проводится визуальным методом, сравнивая величину и интенсивность пятен исследуемого вещества и стандартного образца или с использованием денситометра (отражательного спектрофотометра). Условия денситометрии: длина волны 550 нм, скорость сканирования 0,5 см/сек. При использовании денситометра необходимо проведение предварительной калибровки прибора по стандартным образцам токсинов.

Метод определения аманитинов и фаллоидина в сырых грибах и продуктах их переработки основан на выделении фракции, содержащей токсины, путем экстракции метанолом и очистки экстракта на силикагеле; концентрировании экстракта; разделении и количественном определении содержащихся в концентрате веществ, поглощающих в УФ-области.

Идентификацию токсинов осуществляют сравнением времен выхода в условиях ВЭЖХ веществ, поглощающих в УФ-области с временем выхода соответствующего стандарта.

Нижний предел определения токсинов - 0,001 мг/кг продукта.

См. раздел 1.2.

Весы аналитические по ГОСТу 24104-80.

Шкаф сушильный, нагревательные приборы (электронагреватель по ГОСТу 13268-83, колбонагреватель или электроплитка по ГОСТу 14919-83).

Ротационный испаритель с ловушкой по ТУ 25-11-917-76.

Насос водоструйный по ГОСТу 10696-75.

Контактные термометры по ГОСТу 9871-75.

Жидкостной хроматограф "Shimadzu LC-10A" с УФ-детектором с переменной длиной волны или подобный; колонка и предколонка с силикагелем, химически связанным с октадецилсиланом, размер частиц 5 мкм, длина колонки 25 см, предколонки - 4,5 см, внутренний диаметр - 4,6 мм, объем вводимой пробы 20 мкл.

Шприц для ввода образцов для жидкостного хроматографа.

Весы лабораторные общего назначения по ГОСТу 24104-80 с наибольшим пределом взвешивания до 500 г с пределом допустимой погрешности +/- 0,038 г.

Воронка Бюхнера по ГОСТу 9147-80.

Бумажные фильтры обеззоленные марки ФОМ по ТУ 6-09-1678-77.

Аппарат Сокслета.

Мясорубка или гомогенизатор по ГОСТу 15906-79.

Силикагель с размером частиц 40 - 100 меш.

Цилиндры мерные на 50, 100, 200 мл по ГОСТу 1770-74.

Колбы мерные или пробирки мерные 2, 5, 25, 50 мл по ГОСТу 1770-74.

Холодильник обратный по ГОСТу 23932-79 и 25336-82.

Колбы круглодонные на 1000, 500, 250, 100 и 50 мл по ТУ 48-52.

Ацетонитрил по ТУ 6-09-3534-74.

Вода дистиллированная по ГОСТу 6709-72.

Спирт метиловый по ГОСТу 6995-77.

Стандартные и рабочие растворы:

альфа-аманитин, бета-аманитин, фаллоидин - растворы в метаноле концентрации С1 = 0,01 мг/мл.

См. раздел 1.4.

2.5.1. Приготовление стандартных растворов.

2.5.1.1. Содержимое ампулы стандартного раствора токсина (1 мг) растворяют в 100 мл метанола и получают стандартный образец концентрации 0,01 мг/мл, плотно закрывают и хранят в холодильнике при температуре -3 °С не более 3 месяцев.

2.5.1.2. Стандартный раствор токсина с концентрацией 1 мкг/мл, используемый при анализе в качестве калибровочного стандарта, готовят из 1 мл стандартного раствора токсина с концентрацией С = 0,01 мг/мл, перенеся его в мерную колбу на 10 мл и доведя метанолом до метки.

Стандартные растворы хранят в темном месте в холодильнике в посуде с пришлифованной пробкой не более 3 месяцев.

2.5.1.3. Подготовка к анализу растворителей и реактивов, контроль их чистоты.

Метанол - перегнанный в стекле.

Ацетонитрил - перегнанный в стекле.

Контроль чистоты реактивов:

По 10 - 20 мл ацетонитрила и метанола раздельно упаривают до объема приблизительно 1 мл и анализируют концентрат на наличие посторонних примесей, поглощающих при 303 нм УФ-области. При отсутствии поглощения - реагенты используются в работе, при наличии поглощения - подвергаются дополнительной очистке путем перегонки на ректификационной насадочной колонне или заменяются на новую партию.

2.5.2. Подготовка подвижной фазы для ВЭЖХ.

Отмеряют 200 мл ацетонитрила, прозрачного при 303 нм, переносят в мерную колбу на 1000 мл, доводят до метки дистиллированной водой, фильтруют, дегазируют.

Навеску 50 - 80 г измельченных в мясорубке или гомогенизаторе грибов помещают в аппарат Сокслета, заливают 100 мл метанола и регулируют нагрев таким образом, чтобы один цикл экстракции завершался за 15 мин. После прохождения 6 циклов метанольный экстракт сливают, отфильтровывают на бумажном фильтре, на воронке Бюхнера. На фильтр предварительно наносят слой силикагеля в виде суспензии в метаноле с таким расчетом, чтобы получить слой силикагеля толщиной около 5 мм. По окончании фильтрации промывают фильтр 100 мл метанола. Полученный маточный раствор после фильтрации переносят в мерную колбу на 500 мл, доводят до метки метанолом и используют для анализа.

2.7.1. Условия ВЭЖХ.

Скорость подвижной фазы 1 мл/мин. Детектирование проводится при длине волны 303 нм при 0,0025 ед. AUFS.

Примечание. При приведенных условиях хроматографирования время выхода пика стандартных растворов:

бета-аманитин (время выхода около 2 мин.),

альфа-аманитин (время выхода 4 - 5 мин.),

фаллоидин (8,5 - 9,5 мин.).

2.7.2. Калибровка.

2.7.2.1. Вводят в петлю инжектора 20 мкл стандартного раствора аманитина с концентрацией 1 мкг/мл, измеряют площадь полученного пика стандартного раствора.

2.7.2.2. Повторяют по п. 2.7.2.1 дважды, последовательно введя в хроматограф 10 мкл и 5 мкл стандартного образца.

В диапазоне концентраций 5 - 20 мкг/мл зависимость площади пика от массы введенного токсина линейна. Строят градуировочный график.

2.7.3. Измерение концентрации токсинов в образце.

2.7.3.1. Отбирают 20 мкл от полученного по п. 2.6 экстракта (доведенного до 500 мл). Вводят его в хроматограф и определяют площадь пика, совпадающего по времени выхода с пиком стандартного раствора.

2.7.3.2. При отсутствии в введенном образце пика, совпадающего по времени выхода с временем выхода стандартного раствора какого-либо токсина (альфа-аманитина, бета-аманитина, фаллоидина), от 500 мл образца отбирают аликвоту 50 мл, упаривают ее в ротационном испарителе (не досуха) при нагреве не выше 60 °С, остаток растворителя удаляют в слабом токе азота. Остаток растворяют в 0,5 мл метанола, отбирают из него 20 мкл и вводят в хроматограф.

2.7.3.3. При отсутствии пиков токсинов в упаренной аликвоте, считается, что токсин отсутствует в образце в пределах чувствительности метода.

2.7.4. Подтверждение наличия токсина в анализируемом образце.

2.7.4.1. При наличии пика токсина в анализируемом образце, смешивают в шприце 10 мкл образца и 10 мкл стандартного раствора токсина с той концентрацией (10 или 100 мкг/мл), площадь пика которой при калибровке более близка к площади пика токсина в образце. Вводят смешанную пробу в хроматограф. Наличие какого-либо из токсинов в образце считается подтвержденным, если полученный в результате совместного ввода пик аманитина не разделяется на два пика, имеет правильную симметричную форму.

Измеряют площадь пика токсина в образце (N), и проводят расчет по приведенной формуле:

Статистическая обработка результатов анализа грибов и продуктов их переработки показала, что относительное стандартное отклонение колеблется от 20 до 30% (при n = 5, Р = 0,89).