"МУК 4.1.256-96. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Спектрофотометрическое определение концентраций стрептодеказы в воздухе рабочей зоны. Методические указания"
(утв. Госкомсанэпиднадзором России 08.06.1996)

1. Методические указания по измерению концентрации вредных веществ в воздухе рабочей зоны (выпуск 30) разработаны с целью обеспечения контроля соответствия фактических концентраций вредных веществ их предельно допустимым концентрациям (ПДК) и ориентировочно безопасным уровням воздействия (ОБУВ) - санитарно-гигиеническим нормативам и являются обязательными при осуществлении санитарного контроля.

2. Методические указания по измерению концентраций вредных веществ в воздухе рабочей зоны утверждены и.о. Председателя Госкомсанэпиднадзора России - заместителем Главного государственного санитарного врача Российской Федерации 8 июня 1996 г.

3. Введены впервые.

4. Методические указания по контролю вредных веществ в воздухе рабочей зоны разработаны и подготовлены в соответствии с требованиями ГОСТа 12.1.005-88. ССБТ "Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические требования", ГОСТа 12.1.016-79. ССБТ "Воздух рабочей зоны. Требования к методикам измерения концентраций вредных веществ" и ГОСТа Р 1.5-92, п. 7.3.

Методические указания одобрены на совместном заседании группы Главного эксперта Федеральной комиссии по санитарно-гигиеническому нормированию "Лабораторно-инструментальное дело и метрологическое обеспечение" и методбюро п/секции "Промышленно-санитарная химия" Проблемной комиссии "Научные основы гигиены труда и профпатологии".

Ответственные исполнители: Г.А. Дьякова, С.И. Муравьева.

Исполнители: Г.А. Дьякова, Н.С. Горячев, Л.Г. Макеева, Г.В. Муравьева, Е.М. Малинина, Е.В. Грыжина, Е.Н. Грицун.

Стрептодеказа

М. м. 70000 - 130000.

Структурная формула (не приводится).

Белый или с желтоватым оттенком лиофилизированный порошок или пористая масса, уплотненная в таблетку. Легко растворим в воде, растворе натрия хлорида 0,9% изотонического (ГФ, х, стр. 756).

В воздухе находится в виде аэрозоля.

Проявляет сенсибилизирующие и аллергические свойства.

ПДК в воздухе - 1 мг/куб. м.

Методика основана на использовании высокоспецифических антител к стрептодеказе, проведении реакции антиген-антитело с антителами, меченными ферментом-маркером пероксидазой, и спектрофотометрическом тестировании активности пероксидазы при длине волны 492 нм.

Отбор проб проводят с концентрированием на фильтр.

Нижний предел измерения концентрации в анализируемом растворе - 0,03 мкг.

Диапазон изменяемых концентраций - от 0,12 до 1,2 мг/куб. м.

Нижний предел измерения в воздухе - 0,12 мг/куб. м (при отборе 50 л воздуха).

Измерению не мешают белки (бычий сывороточный альбумин, яичный альбумин), ферменты (липаза Pen. solitum, L - аспарагиназа Е. coli).

Суммарная погрешность не превышает +/- 25%.

Время выполнения измерений, включая отбор проб - 4 ч.

Приготовление 0,1 моль/л фосфатного буферного раствора рН 7,2 +/- 0,1. 35,5 г натрия фосфорнокислого двузамещенного растворяют в 1000 мл дистиллированной воды в мерной колбе вместимостью 1000 мл.

4 г натрия фосфорнокислого однозамещенного растворяют 250 мл воды в мерной колбе вместимостью 250 мл.

1000 мл раствора натрия фосфорнокислого двузамещенного и 250 мл раствора натрия фосфорнокислого однозамещенного смешивают в стакане вместимостью 2000 мл.

Раствор хранится в течение 2 месяцев в холодильнике.

Приготовление буфера "А". 1000 мл фосфатного буферного раствора рН 7,2 смешивают с 8,47 г хлористого натрия. Раствор хранят в холодильнике в течение 2 месяцев.

Твин-20 "Серва", ФРГ.

Приготовление буфера "В". К 1000 мл раствора фосфатного буфера рН 7,2 +/- 0,1 прибавляют 29,2 г хлористого натрия и 1 мл твина-20. Раствор хранят в холодильнике в течение 2 месяцев.

Приготовление 0,1 моль/л фосфатноцитратного буферного раствора рН 5,0 +/- 0,1. В мерную колбу вместимостью 1000 мл вносят 7,3 г лимонной кислоты (моногидрат) и 9,47 г натрия фосфорнокислого однозамещенного безводного и доводят раствор до метки дистиллированной водой при перемешивании. Раствор хранят при температуре -10 °С в течение 6 месяцев.

Приготовление 0,04% раствора о-фенилендиамина. Навеску 10 г о-фенилендиамина растворяют в 24 мл фосфатноцитратного буфера в стакане вместимостью 50 мл. Раствор готовят непосредственно перед измерением.

Приготовление раствора субстратной смеси. К 24 мл раствора о-фенилендиамина прибавляют дозатором вместимостью 20 мкл 14 мкл концентрированной перекиси водорода. Смесь готовят непосредственно перед измерениями.

Приготовление основного раствора стрептодеказы с концентрацией 0,6 мкг/мл. Точную навеску 25 мг (7,2% белка) стрептодеказы растворяют в 6 мл дистиллированной воды. Массовая концентрация стрептодеказы в полученном растворе составляет 0,30 мг/мл. Из полученного раствора отбирают 1 мл дозатором на 1 мл и вносят в мерную колбу, вместимостью 500 мл. Объем доводят до метки дистиллированной водой.

Используют свежеприготовленный раствор.

Приготовление раствора стрептодеказы с концентрацией 0,12 мкг/мл. 5 мл основного раствора стрептодеказы пипеткой вместимостью 5 мл переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл. Объем доводят до метки буфером "А". Используют свежеприготовленный раствор.

Приготовление 4 М раствора серной кислоты. К 8,5 дистиллированной воды, используя пипетку вместимостью 1 мл, добавляют 0,5 мл концентрированной серной кислоты. Раствор хранят при комнатной температуре.

Приготовление раствора антисыворотки. Содержимое флакона с лиофилизированной антисывороткой к стрептодеказе растворяют в 5 мл буфера "В", используя пипетку вместимостью 5 мл.

Далее из полученного раствора отбирают 0,5 мл дозатором на 1 мл и переносят в мерную колбу вместимостью 500 мл, доводят объем до метки буфером "В". Раствор готовят непосредственно перед употреблением.

Подготовка сенсибилизированного планшета. Раствор стрептодеказы с концентрацией 0,12 мкг/мл заливают дозатором вместимостью 0,2 мл по 0,2 мл во все лунки (кроме А1) полистиролового планшета для ИФА. Планшет закрывают крышкой и выдерживают 18 часов в холодильнике. Из лунок выливают раствор стрептодеказы и промывают 4 раза буфером "В" с помощью полуавтоматической промывалки.

Сенсибилизированный таким образом планшет используют в анализе или запаивают в полиэтиленовый мешок и хранят в холодильнике в течение 3 месяцев.

Антитела диагностические против иммуноглобулинов кролика, меченные пероксидазой, ВФС 42-8-ВС-85 (антивидовой конъюгат).

Приготовление раствора антивидового конъюгата. Содержимое ампулы с антивидовым конъюгатом растворяют в 20 мл буфера "В", используя пипетку вместимостью 10 мл. Раствор готовят непосредственно перед употреблением.

Воздух с объемным расходом 10 л/мин. аспирируют через фильтр АФА-ВП-20, закрепленный в фильтродержателе. Для измерения 1/2 ПДК достаточно отобрать 50 л воздуха. Пробы хранят менее суток.

Градуировочные растворы готовят согласно таблице. Хранят в холодильнике не более 3 суток.

1. Во все промытые, не содержащие раствор лунки (кроме А1) предварительно сенсибилизированного планшета заливают с помощью дозатора на 0,1 мл по 0,1 мл раствора антисыворотки, затем в лунки В1, С1 заливают по 0,1 мл буфера "В", в лунки 2 - 7 рядов А, В, С - по 0,1 мл градуировочных растворов. Для каждого стандартного раствора отводят по 3 лунки. Во всех лунках общий объем составляет 0,2 мл, лунка А1 остается пустой.

Планшет закрывают крышкой и инкубируют 1,5 ч при температуре 37 °С.

2. Выливают содержимое планшета и промывают его 4 раза буфером "В".

3. Во все лунки (кроме А1) вносят по 0,2 мл раствора антивидового конъюгата, закрывают планшет крышкой и инкубируют 1,5 ч при температуре 37 °С.

4. Четырехкратная промывка по п. 2.

5. Проведение ферментативной реакции.

В каждую лунку вносят дозатором на 0,1 мл по 0,1 мл раствора с субстратной смесью. Инкубируют по секундомеру 10 мин. Затем в той же последовательности в лунки вносят дозатором на 0,2 мл по 0,075 мл раствора 4 М серной кислоты для остановки реакции.

6. Для измерения оптической плотности растворов в лунках планшет помещают в рамку считывателя АКИ.Ц.0,1. Измерение проводят при длине волны 492 нм, причем в качестве раствора сравнения используют раствор субстратной смеси в лунке А1.

Строят градуировочный график. На масштабно-координатной бумаге по оси абсцисс откладывают концентрацию стрептодеказы в градуировочных растворах в единицах концентрации (мкг/мл), а по оси ординат - значения оптической плотности при длине волны 492 нм. Градуировочный график строят одновременно с проведением измерений в пробах.

После отбора пробы воздуха фильтры АФА-ВП-20 помещают в стаканы вместимостью 50 мл и приливают 20 мл буфера "А", периодически встряхивая, выдерживают в течение 10 мин. Затем с помощью дозатора на 1 мл отбирают 1 мл раствора и переносят в мерную колбу вместимостью 50 мл, объем доводят до метки буфером "В".

Анализ проводят аналогично процедуре при построении калибровочной зависимости.

Растворы могут храниться до проведения анализа в течение 2 суток в холодильнике.

По градуировочному графику на основании измерения значений оптической плотности в растворах проб определяют соответствующие концентрации стрептодеказы в пробах (мкг/мл).

Концентрацию стрептодеказы (С) в воздухе (мг/куб. м) вычисляют по формуле:

где:

а - концентрация стрептодеказы в анализируемом растворе, мкг;

в - общий объем анализируемого раствора, мл;

V - объем воздуха, отобранного для анализа и приведенного к стандартным условиям, л (см. Приложение 1).

К - коэффициент десорбции вещества с фильтра, равный 0,85.

Методические указания разработаны ВНИИТИАФ, г. С.-Петербург.

Приведение объема воздуха к стандартным условиям проводят по формуле: