"Методические указания по определению нитратов и нитритов в зерне и зернопродуктах"
(утв. Минздравом СССР 28.12.1990 N 5310-90)

Методические указания устанавливают фотометрический метод определения нитратов и нитритов и распространяются на все виды зерна и зернопродуктов (крупа, мука, макароны, хлеб, хлебобулочные изделия и др.).

Методические указания по определению нитратов и нитритов в зерне и зернопродуктах предназначены для учреждений и организаций Минздрава СССР, осуществляющих государственный санитарный надзор, и организаций агропромышленного комплекса, выполняющих контроль качества растительной продукции.

Методические указания по определению нитратов и нитритов в зерне и зернопродуктах разработаны:

Институтом питания АМН СССР; Московской ветеринарной академией им. Скрябина; Московским коммерческим институтом; НПО "Зернопродукт".

Результаты анализов содержания нитратов и нитритов в зерне и зернопродуктах необходимо направлять в Институт питания АМН СССР (лаборатория пищевой токсикологии) по адресу: 109240, Москва, Устьинский пр., д. 2/14. Это необходимо для обобщения и использования их при разработке гигиенических регламентов допустимого содержания нитратов и нитритов в зерне и зернопродуктах.

1.1. Сущность метода определения нитритов заключается в экстрагировании их водой, очистке экстракта и фотометрическом измерении интенсивности окраски азосоединения, образующегося при взаимодействии нитритов с ароматическими аминами.

1.2. Сущность метода определения нитратов заключается в экстрагировании их водой, очистке экстракта, восстановлении нитратов до нитритов на кадмиевой колонке с последующим фотометрическим измерением интенсивности окраски азосоединения, образующегося при взаимодействии нитритов с ароматическими аминами.

2.1. Отбор средней пробы проводят в соответствии с ГОСТами:

2.1.1. ГОСТ 13586.3-83 "Зерно. Правила приемки и методы отбора проб".

2.1.2. ГОСТ 26312.1-84 "Крупа. Правила приемки и методы отбора проб".

2.1.3. ГОСТ 2766-88 "Мука и отруби. Правила приемки и методы отбора проб".

2.1.4. ГОСТ 14849-90 (с июля 1990 г.) "Изделия макаронные. Правила приемки и методы определения качества".

2.1.5. ГОСТ 5667-65 "Хлебобулочные изделия. Правила отбора проб". При отборе средней пробы хлебобулочных изделий каждое изделие разрезают ножом на 4 части вдоль и поперек и отбирают 1/4 часть, тщательно измельчают на лабораторной мельнице типа ЛЖМ или ЭМ-3А. Полученную массу перемешивают, рассыпают ровным слоем на гладкую поверхность и из разных мест отбирают пробу для анализа.

2.2. Подготовка к анализу проб твердых продуктов (зерна, крупы, макарон, высушенного хлеба и др.) проводится следующим образом: пробу продукта, отобранную по п. 2.1, тщательно измельчают до однородной массы.

Весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104-80 с наибольшим пределом взвешивания до 200 г и пределом допустимой погрешности +/- 0,002 г;

Весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104-80 с наибольшим пределом взвешивания до 1000 г и пределом допустимой погрешности +/- 0,005 г;

Колориметр фотоэлектрический лабораторный с метрологическими характеристиками по ГОСТ 12083-78 с устройством для отсчитывания значений оптической плотности светофильтром с макс. - 540 +/- 20 нм (зеленый) или спектрофотометр для измерения в видимой области спектра;

Ионометр, в том числе pH-метр;

Лабораторная мельница типа ЛЖМ или ЭМ-3А или кофемолка;

Сушильный шкаф;

Бумага фильтровальная лабораторная по ГОСТ 12026, отмытая от нитратов и нитритов не менее 5 раз дистиллированной водой и высушенная при температуре 50 - 80 °С в сушильном шкафу в течение часа. Фильтры обеззоленные по ТУ 6-09-1678-77;

Бумага индикаторная универсальная pH 1 - 12 по ТУ 6-09-1181-76;

Баня водяная с терморегулятором;

Ареометры, тип АОН, по ГОСТ 18481;

Колонка для восстановления нитратов (см. рис. 1 - не приводится);

Пипетки или бюретки, дозаторы по ГОСТ 20292-74 вместимостью 1, 2, 5, 10, 20, 25 куб. см;

Цилиндры мерные по ГОСТ 1770-74 вместимостью 25, 50, 100, 250, 500, 1000 куб. см;

Колбы конические по ГОСТ 25336-82 вместимостью 50, 100, 250 куб. см;

Колбы мерные по ГОСТ 1770-74 вместимостью 50, 100, 200, 500 и 1000 куб. см;

Стаканы химические по ГОСТ 25336-82 вместимостью 50, 500 и 1000 куб. см;

Воронки стеклянные по ГОСТ 25336-82;

Палочки стеклянные;

Примечание: Все используемые реактивы должны быть квалификации "чда" или "хч".

Помещение, в котором проводится определение нитритов и нитратов, должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией.

Работу с кадмием, солями кадмия, 1-нафтиламином и НЭДА необходимо проводить в вытяжном шкафу лаборатории с использованием индивидуальных средств защиты.

5.1. Приготовление растворов.

5.1.1. Растворы для осаждения белков.

5.1.1.1. Раствор уксуснокислого цинка: 220 г уксуснокислого цинка растворяют в смеси воды и 30 куб. см ледяной уксусной кислоты и доводят объем раствора до 1000 куб. см дистиллированной водой.

5.1.1.2. Раствор железистосинеродистого калия: 106 г железистосинеродистого калия растворяют в воде и доводят объем раствора до 1000 куб. см дистиллированной водой.

5.1.2. Раствор гидроксида натрия: 30,0 г гидроксида натрия растворяют в воде и доводят объем раствора дистиллированной водой до 100 куб. см.

5.1.3. Буферный раствор pH 9,6 - 9,7: в мерную колбу вместимостью 1000 куб. см вносят около 600 куб. см воды, 50 куб. см концентрированной соляной кислоты, встряхивают и добавляют 135 куб. см аммиака водного (плотность 0,88 г/куб. см). Перемешивают, проверяют pH раствора потенциометрически и доводят при необходимости до pH 9,6 - 9,7. Объем раствора доводят до метки дистиллированной водой.

5.1.4. Раствор сульфата кадмия: 80,0 г сульфата кадмия растворяют в воде и доводят объем раствора до 1000 куб. см водой.

5.1.5. Раствор меди сернокислой: 20,0 г меди сернокислой растворяют в воде и доводят объем до 1000 куб. см.

5.1.6. Раствор трилона Б: 33,5 г динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты растворяют в дистиллированной воде и доводят объем до 1000 куб. см.

5.1.7. Раствор для обработки кадмиевой колонки: смешивают 50 куб. см раствора трилона Б (п. 5.1.6), 20 куб. см раствора соляной кислоты C(HCl) = 0,1 моль/куб. дм и доводят объем раствора до 1000 куб. см.

5.1.8. Стандартные растворы нитрата калия:

1,630 г калия азотнокислого, перекристаллизованного из воды и высушенного до постоянной массы при 105 - 110 °С, вносят в мерную колбу вместимостью 1000 куб. см, растворяют в дистиллированной воде и доводят объем раствора до метки.

Раствор хранят в холодильнике 6 месяцев.

Пипеткой вносят 10 куб. см основного стандартного раствора (п. 5.1.8.1) в мерную колбу вместимостью 1000 куб. см, добавляют 20 куб. см буфера (п. 5.1.3) и доводят объем раствора до метки дистиллированной водой.

Раствор готовят в день проведения анализа.

5.1.9. Стандартные растворы нитрита натрия:

0,150 г нитрита натрия, перекристаллизованного из воды и высушенного до постоянной массы при 105 - 110 °С, вносят в мерную колбу вместимостью 500 куб. см и доводят объем раствора до метки дистиллированной водой.

Раствор хранят в холодильнике не более недели.

Пипеткой вносят 10 куб. см основного раствора (п. 5.1.9.1) в мерную колбу вместимостью 1000 куб. см, добавляют 20 куб. см буфера (п. 5.1.3) и доводят объем до метки дистиллированной водой. Раствор готовят в день проведения анализа.

5.1.10. Растворы для проведения цветной реакции:

5.1.10.1. Раствор 1: 1,0 г сульфаниламида растворяют в 20 куб. см воды, добавляют 10 куб. см концентрированной соляной кислоты, доводят до 200 куб. см дистиллированной водой.

5.1.10.2. Раствор 2: 0,100 г N-(1-нафтил)этилендиамин дигидрохлорида (НЭДА) растворяют в воде в мерной колбе вместимостью 50 куб. см, доводят дистиллированной водой до метки.

Оба раствора хранят в холодильнике в склянках из темного стекла не более 2 недель.

5.1.10.3. Приготовление реактива Грисса:

Растворяют 2,10 г сульфаниловой кислоты в 200 куб. см горячей дистиллированной воды и после охлаждения добавляют 50 куб. см ледяной уксусной кислоты.

Растворяют 0,521 г 1-нафтиламин гидрохлорида в 50 куб. см ледяной уксусной кислоты в мерной колбе вместимостью 200 куб. см и доводят объем до метки дистиллированной водой.

Хранят в холодильнике и используют в течение двух недель.

Объединяют оба раствора в мерной колбе вместимостью 500 куб. см и доводят до метки ледяной уксусной кислотой, перемешивают и, если необходимо, фильтруют (реактив Грисса). Раствор готовят за день до использования.

5.1.11. Раствор соляной кислоты C(HCl) = 2 моль/куб. дм:

160 куб. см соляной кислоты (плотность 1,19 г/куб. см) растворяют в мерной колбе вместимостью 1 куб. дм в дистиллированной воде и доводят объем раствора до метки.

5.1.12. Раствор соляной кислоты C(HCl) = 0,1 моль/куб. дм:

50 куб. см раствора соляной кислоты (п. 5.1.11) растворяют в дистиллированной воде в мерной колбе вместимостью 1 куб. дм и доводят объем до метки.

5.1.13. Раствор соляной кислоты:

445 куб. см соляной кислоты (плотность 1,19 г/куб. см) растворяют в мерной колбе вместимостью 1 куб. дм в дистиллированной воде и доводят объем раствора до метки.

5.1.14. Раствор азотнокислого серебра:

5.2. Приготовление пористого кадмия.

Гранулы цинка (250 - 300 шт.) распределяют по дну кристаллизатора и заливают 1000 куб. см раствора сернокислого кадмия (п. 5.1.4). Через 24 часа остаток цинка отделяют от кадмия пинцетом, кадмий промывают водой декантацией 2 - 3 раза. Кадмий переносят с помощью 0,1 М раствора HCl (п. 5.1.12) в гомогенизатор и измельчают до получения частиц размером 0,3 - 0,8 мм.

5.3. Подготовка кадмиевой колонки.

Собирают систему согласно рис. 1. На дно стеклянной колонки помещают тонкий слой стеклянной ваты, колонку заполняют водой и вносят суспензию кадмия фарфоровой ложкой на высоту 15 - 17 см. При заполнении колонки дают воде периодически стекать, чтобы уровень воды не опускался ниже поверхности слоя кадмия. Слой кадмия во время заполнения периодически перемешивают стеклянной палочкой, чтобы в колонке не оставалось пузырьков газа.

Колонку, заполненную свежеприготовленным омедненным пористым кадмием, обрабатывают следующим образом: пропускают через слой кадмия смесь, состоящую из 750 куб. см дистиллированной воды, 225 куб. см рабочего раствора нитрата калия (п. 5.1.8.2), 25 куб. см буферного раствора (п. 5.1.3) и 20 куб. см раствора трилона Б (п. 5.1.6) со скоростью 3 - 4 куб. см/мин., после чего промывают кадмиевую колонку 250 - 450 куб. см дистиллированной воды до полного удаления нитритов. Кадмий в колонке хранят под слоем воды.

5.4. Проверка восстановительной способности кадмиевой колонки.

Восстановительную способность кадмиевой колонки проверяют перед началом и концом анализа ежедневно.

5.4.1. В резервуар колонки пипеткой вносят 20 куб. см рабочего стандартного раствора нитрата калия (п. 5.1.8.2) и 5 куб. см буферного раствора (п. 5.1.3). Устанавливают скорость элюции 3 - 4 куб. см/мин. и собирают элюат в мерную колбу вместимостью 100 куб. см. Когда резервуар опустеет, стенки его дважды смывают дистиллированной водой порциями по 15 куб. см и пропускают воду через слой кадмия. После того, как соберут около 100 куб. см элюата, удаляют колбу из-под колонки, доводят объем до метки дистиллированной водой и перемешивают.

5.4.2. Проводят контрольное определение, повторяя операцию, как указано в п. 5.4.1, используя вместо стандартного раствора 20 куб. см воды.

5.5. Регенерирование кадмиевой колонки.

Регенерацию колонки следует проводить в том случае, если контроль колонки показывает снижение ее эффективности.

При регенерации колонку промывают последовательно 100 куб. см раствора по п. 5.1.7, 25 куб. см раствора соляной кислоты (п. 5.1.12), 50 куб. см дистиллированной воды и 25 куб. см буфера (п. 5.1.3), разбавленного 1:9, со скоростью 6 куб. см/мин. Если эффективность колонки и после этого окажется неудовлетворительной, то кадмий переносят из колонки в химический стакан, заливают на ночь раствором соляной кислоты C(HCl) = 2,0 моль/куб. дм (п. 5.1.11). Затем промывают дистиллированной водой до отсутствия хлорид-ионов, а затем раствором сульфата меди (п. 5.1.5) и снова заполняют колонку, как указано в п. 5.3. Пропускают через колонку смесь 750 куб. см дистиллированной воды, 100 куб. см рабочего стандартного раствора нитратов (п. 5.1.8.2), 20 куб. см буферного раствора (п. 5.1.3) и 2 куб. см раствора трилона Б (п. 5.1.6) со скоростью 6 куб. см/мин. Затем промывают колонку водой до полного удаления нитритов и снова проверяют восстановительную способность кадмиевой колонки.

5.6. Построение градуировочного графика для определения нитритов.

Для получения окраски используют реактив НЭДА и сульфаниламид либо реактив Грисса.

5.6.1.1. Проведение реакции с реактивом НЭДА.

В каждую колбу добавляют дистиллированной воды до 30 куб. см, пипеткой вносят 5 куб. см раствора 1 (п. 5.1.10.1) и 1 куб. см раствора соляной кислоты (п. 5.1.13), перемешивают и оставляют при комнатной температуре в темноте на 5 мин. Затем добавляют пипеткой 1 куб. см раствора 2 (п. 5.1.10.2), доводят до метки дистиллированной водой, перемешивают, оставляют в темноте при комнатной температуре на 10 мин., перемешивают.

Измеряют оптическую плотность растворов на спектрофотометре при длине волны 538 нм в кюветах с рабочей длиной 10 - 20 мм или на фотоэлектроколориметре с зеленым светофильтром в кюветах с рабочей длиной 10 - 20 мм. Контролем служит раствор, не содержащий нитритов. Измерение следует провести в течение получаса со времени выдержки.

5.6.1.2. Проведение реакции с реактивом Грисса.

В каждую колбу вносят пипеткой 10 куб. см реактива Грисса (п. 5.1.10.3), доводят до метки дистиллированной водой, перемешивают и оставляют в темноте на 60 мин. Измеряют оптическую плотность раствора на спектрофотометре при длине волны 522 нм в кюветах с рабочей длиной 10 - 20 мм или на фотоэлектроколориметре с зеленым светофильтром. Контролем служит раствор, не содержащий нитритов. Измерение следует провести в течение получаса со времени выдержки.

6.1. К навеске исследуемого продукта (п. 2), взятой в коническую калибровочную колбу вместимостью 250 куб. см, добавляют 100 куб. см теплой (50 - 60 °С) дистиллированной воды, 20 куб. см буферного раствора (п. 5.1.3), перемешивают, затем добавляют последовательно по 5 куб. см растворов 5.1.1.1 и 5.1.1.2, встряхивая после каждого добавления. Выдерживают 15 мин. на водяной бане при температуре 50 - 60 °С. Охлаждают до 20 +/- 2 °С, доводят объем раствора до 250 куб. см дистиллированной водой, фильтруют.

При получении мутного раствора экстракцию необходимо повторить, при этом целесообразно использовать большее количество осадителей или добавить дополнительно 2 - 5 куб. см раствора гидроксида натрия (п. 5.1.2) до pH 9.

Фильтрат используют для определения нитратов и нитритов.

Для внесения поправки на чистоту используемых реактивов готовят контрольный раствор, как указано выше, без добавления пробы продукта.

6.2. Определение нитритов.

В мерную колбу вместимостью 50 куб. см вносят 20 куб. см фильтрата (п. 6.1) и проводят цветную реакцию аналогично п. 5.6.1.1 с реактивом НЭДА либо по п. 5.6.1.2 с реактивом Грисса.

Контролем служит раствор, в котором вместо фильтрата использован соответствующий объем дистиллированной воды.

Примечание: Если фильтраты используемых продуктов окрашены, то в качестве контрольного раствора используется смесь, полученная по приведенной выше (п. 6.2) прописи без добавления НЭДА.

По полученному значению оптической плотности с помощью градуировочного графика находят массовую концентрацию нитрит-иона.

6.3. Определение нитратов.

Перед началом работы и после анализа каждой пробы кадмиевую колонку промывают последовательно 25 куб. см 0,1 М раствора соляной кислоты (п. 5.1.12), 50 куб. см дистиллированной воды и 25 куб. см разбавленного (1:9) аммиачного буфера (п. 5.1.3).

6.3.1. В химический стаканчик вносят 20 куб. см фильтрата (п. 6.1) и 5 куб. см буферного раствора (п. 5.1.3), раствор переносят в резервуар колонки и пропускают через слой кадмия со скоростью 3 - 4 куб. см/мин. Элюат из колонки собирают в мерную колбу вместимостью 100 куб. см. Стаканчик и резервуар дважды смывают порциями дистиллированной воды по 15 куб. см и смыв также пропускают через слой кадмия. Затем заполняют резервуар водой и продолжают элюирование. После накопления около 80 куб. см элюата колбу удаляют. К полученному элюату добавляют 10 куб. см раствора 1 (п. 5.1.10.1) и 2 куб. см раствора соляной кислоты (п. 5.1.13), перемешивают и оставляют при комнатной температуре в темноте на 5 мин. Затем добавляют пипеткой 2 куб. см раствора 2 (п. 5.1.10.2), доводят до метки дистиллированной водой, перемешивают, оставляют в темноте при комнатной температуре на 10 мин., перемешивают. Измерение оптической плотности полученного раствора проводят в сравнении с контрольной пробой, используя при этом 20 куб. см элюата, полученного при пропускании дистиллированной воды через колонку.

7.1. Массовую концентрацию нитритов (X) в мг/кг продукта (в расчете на нитрит-ион) вычисляют по формуле:

Вычисления проводятся с точностью, соответствующей пределу обнаружения. За окончательный результат определения, выполненного в одной лаборатории, принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений.

Допустимое расхождение между двумя параллельными определениями, выполненными в двух разных лабораториях, зависит от уровня концентраций и при P = 0,95 не должно превышать значений сходимости (r), указанных в таблице 1.

Допустимое расхождение между результатами испытаний, выполненных в двух разных лабораториях, зависит от уровня концентраций и при P = 0,95 не должно превышать значений воспроизводимости (R), указанных в таблице 1.

При сравнении аналитических результатов с величиной ПДК или сертификата используется значение CrD. Если разница обнаруженной концентрации и величины ПДК (сертификата) не превышает значения CrD, представленного в таблице 1, можно принять, что при доверительной вероятности P = 0,95 определяемая концентрация сопоставима с ПДК, если полученная разница превышает CrD, обнаруженную концентрацию нитратов и нитритов в продукте следует считать не соответствующей уровню ПДК (сертификата).

Для получения величин r, R, CrD для концентраций нитратов, отличных от указанных в таблице 1, можно использовать уравнения:

По вопросам практического внедрения методов, оказания методической помощи, консультаций, проведения межлабораторных испытаний и арбитражных анализов следует обращаться в ТОО "Продэкспертиза" (Москва, 109240, Устьинский проезд, д. 2/14, тел. 297-77-95).