"Методические указания по хроматографическому измерению содержания фосфамида на коже"
(утв. Минздравом СССР 28.09.1989 N 5137-89)

0,0-Диметил-S-(N-метилкарбамоилметил) дитиофосфат.

Товарное название: фосфамид, диметоат, рогор, БИ-58.

Методика основана на экстракции фосфамида из пробы органическим растворителем, очистке и последующем определении методами газожидкостной или тонкослойной хроматографии.

В качестве смывающей жидкости используется дистиллированная вода.

Диапазон измеряемого содержания - 0,008 - 0,4 мг/кв. см.

Определению не мешают диазинон, циклоат, эптам, метоксихлор, линдан.

Граница суммарной погрешности не превышает +/- 20%.

ПДУ фосфамида на коже 0,02 мг/кв. см.

Фосфамид, х.ч.

Стандартный раствор N 1 с содержанием 1 мг/мл готовят растворением 100 мг фосфамида в мерной колбе на 100 мл. Соответствующим разведением в гексане готовят стандартный раствор N 2 с содержанием фосфамида 0,1 мг/мл. Растворы устойчивы 1 месяц.

Азот, водород в баллонах с редукторами.

Азот ОСЧ, ГОСТ 9293-74, содержание кислорода не более 0,003% (для работы на ЭЗД или ДПР).

Насадка хроматографической колонки:

Для ТИД хроматон N-AW-DMCS с 5% SE-30, для ЭЗД (или ДПР) хроматон N-AW-DMCS с 5% ХЕ-60, зернение носителей 0,16 - 0,2 мм.

Ацетон, х.ч., ГОСТ 2603-79.

Гексан, ч., ТУ 6-09-3375-78.

Хлороформ, х.ч., ТУ 6-09-4263-76.

Лимонная кислота, х.ч., ГОСТ 3652-69, 2-процентный раствор.

Соляная кислота, х.ч., ГОСТ 3118-77,0,1 н раствор.

Бромфеноловый синий, чда, ТУ 6-09-1058-76.

Гидроксид натрия, х.ч., ГОСТ 4328-77, 20-процентный раствор.

Натрий сернокислый безводный, чда, ГОСТ 4166-76.

Серебро азотнокислое, х.ч., ГОСТ 1277-75, 0,5-процентный водноацетоновый раствор (1 часть воды + 3 части ацетона).

Хлористый палладий, ч., МРТУ 6-09-1964-72.

Проявляющие реагенты:

ПР N 1 - бромфеноловый синий. Взвешивают 50 мг бромфенолового синего, растворяют в 10 мл ацетона и затем разбавляют до 100 мл раствором азотнокислого серебра. Срок хранения в холодильнике до 1 месяца.

ПР N 2 - хлористый палладий. Взвешивают 0,2 г хлористого палладия, вносят в колбочку вместимостью 100 мл, приливают 2 капли концентрированной соляной кислоты, помещают колбу в водяную баню при 60 - 70 °C на 10 - 15 мин. Периодически встряхивают до полного растворения содержимого колбы. Доводят объем раствора до 100 мл водой. Срок хранения в холодильнике до 1 месяца.

ПР N 3 - 2,6-дибром-N-хлорхинонимин, х.ч., 0,5-процентный раствор в гексане.

ПР N 4 - азотнокислое серебро. Взвешивают 1 г азотнокислого серебра и растворяют в 99 мл воды. Опрыскивают пластинки после гидролиза 20-процентным раствором гидроксида натрия. Хранят реактив в холодильнике до 2 недель.

Подвижная фаза: хлороформ-ацетон-гексан (3:1:1), гексан-ацетон (3:2) и хлороформ.

Натрий хлористый, х. ч., ГОСТ 4233-77, 10-процентный раствор.

Вата гигроскопическая, обезжиренная кипячением в дистиллированной воде в течение 30 мин. и высушенная.

Алюминия оксид, II степени активности для хроматографии, ТУ 6-09-3916-75.

Кальций сернокислый безводный, чда, ГОСТ 3210-74.

Хроматографические пластинки "Силуфол", 15 х 15 см.

Газовый хроматограф с термоионным (ТИД) или электроннозахватным (ЭЗД) (или детектором постоянной скорости рекомбинации (ДПР)) детектором.

Ротационный вакуумный испаритель ИР-IM с набором колб, ТУ 2811-917-74, или аналогичный аппарат для отгонки растворителей.

Аппарат для встряхивания.

Термостат.

Колбы мерные, цилиндры, ГОСТ 1770-74.

Пипетки, микропипетки, ГОСТ 20292-74.

Склянки химические вместимостью 50 - 100 мл, ГОСТ 13394-72.

Воронки химические, ГОСТ 8613-75.

Воронки делительные, ГОСТ 8613-75.

Колбы грушевидные (для отгонки растворителей), ГОСТ 10394-72.

Хроматографическая камера, ГОСТ 10565-75.

Камера для опрыскивания пластинок, ГОСТ 10565-75.

Пульверизатор стеклянный, ГОСТ 10391-74.

Баня водяная, ТУ 64-12350-76.

Стеклянные капилляры для нанесения проб на хроматографические пластинки.

Стеклянные пластинки, размер 9 x 12 или 12 х 15 см.

Микрошприц МШ-10.

Колонки стеклянные хроматографические длиной 1 м и внутренним диаметром 3 мм.

Секундомер.

Лупа измерительная.

Смыв с кожных покровов (5 x 5) см проводят способом обмыва. Для этого в фарфоровую чашку наливают 20 мл воды. Ватным тампоном 0,3 г, смоченным в воде, обмывают участок поверхности кожи (5 x 5) см сверху вниз. При этом тампон несколько раз опускают в чашку с водой. Одновременно проводят смыв с кожи у рабочих, не контактирующих с фосфамидом.

Ватный тампон тщательно отжимают стеклянной палочкой, переносят на воронку с фильтром и промывают дважды по 20 мл дистиллированной водой. Растворы объединяют, фильтруют, подкисляют 0,1 и раствором HCl до pH 4 - 5, раствор перемешивают, приливают 30 мл 10% раствора хлористого натрия и дважды экстрагируют в делительной воронке 20 мл хлороформа в течение 30 - 40 мин. Хлороформ отделяют. Хлороформные экстракты объединяют, пропускают через безводный сернокислый натрий, фильтруют. Отгоняют растворитель примерно до 0,2 - 0,5 мл. Остаток испаряют при комнатной температуре досуха. К сухому остатку приливают 1 мл гексана.

Определение фосфамида проводят с использованием термоионного детектора или детектора постоянной скорости рекомбинации. В случае применения термоионного детектора стеклянную хроматографическую колонку заполняют хроматоном N-AW-DMCS с 5% жидкой фазы SE-30. При анализе фосфамида с использованием детектора постоянной скорости рекомбинации применяют хроматон N-AW-DMCS с 5% ХЕ-60.

Кондиционирование колонки проводят в течение 12 часов при температуре термостата 200 °C при отключенном детекторе.

Для анализа берут 1 - 2 мкл пробы. Для количественного определения используют метод абсолютной калибровки. Для этого готовят градуировочные растворы с содержанием 0,2 мкг/мл, 0,4 мкг/мл, 0,8 мкг/мл, 2 мкг/мл, 10 мкг/мл фосфамида соответствующим разведением стандартного раствора N 2. Срок хранения градуировочных растворов 2 дня.

На основании полученных данных строят градуировочный график зависимости площади пика от заданной концентрации. Площадь пика измеряют умножением высоты на ширину, измеренную на половине высоты, полученной из пяти параллельных определений.

Условия калибровки и анализа должны быть идентичны.

Готовят хроматографические пластинки с оксидом алюминия. Взвешивают 50 г оксида алюминия, просеянного через сито 100 меш., прибавляют 5 г безводного сернокислого кальция и 75 мл воды. Встряхивают в колбе до образования однородной массы. Наливают тонким слоем на 10 стеклянных пластинок размером (9 x 12) см или 8 пластинок (12 x 15) см. Сушат на воздухе около 10 - 12 ч. Хранят в эксикаторе. 0,1 мл анализируемой пробы наносят на хроматографическую пластинку на линию старта. Из стандартного раствора N 2 готовят градуировочные растворы с содержанием фосфамида 5 мкг/мл, 10 мкг/мл, 20 мкг/мл, 40 мкг/мл, 80 мкг/мл, 100 мкг/мл. Слева и справа от пробы наносят 0,1 мл градуировочных растворов, что соответствует содержанию 0,5 мкг, 1 мкг, 2 мкг, 4 мкг, 8 мкг, 10 мкг фосфамида. Диаметр пятна не должен превышать 5 мм. Пластинку помещают в хроматографическую камеру, куда предварительно за 15 - 20 мин. наливают одну из подвижных фаз хлороформ-ацетон-гексан (3:1:1), гексан-ацетон (3:2), хлороформ. После поднятия фронта растворителя на высоту 10 - 12 см пластинку извлекают из камеры, оставляют до улетучивания растворителей, а затем применяют один из проявляющих реагентов.

Для количественной оценки с помощью промасленной миллиметровой бумаги измеряют размеры и вычисляют площадь пятна фосфамида на хроматограмме пробы и стандарта, наиболее близкого по размерам к пятну пробы.

Концентрацию фосфамида в мг/кв. см (C) рассчитывают по формуле:

где Q - количество фосфамида во всей пробе, мг;

S - площадь исследуемой части тела, кв. см.