"Методические указания по определению оксадиксила в картофеле, огурцах, томатах, сахарной свекле, винограде, почве и воде методами газожидкостной и тонкослойной хроматографии"
(утв. Минздравом СССР 27.07.1991 N 6270-91)

Разработчики: ВНИИХСЗР. Ф.Р. Мельцер, К.Ф. Новикова.

1. Вводная часть.

Сандофан, 25% с.п.

ф. "Сандоз", Швейцария.

Оксадиксил 2-метокси-N-(2-оксо-1,3-оксазолидин-3-ил)ацет-2,6-ксилидин (ИЮПАК).

C₁₄H₁₈N₂O₄

М.м. 278,3

В чистом виде белые кристаллы с Tпл. 104 - 105 °C. Растворимость в % при 25 °C: в воде - 0,34, ацетоне - 34,4, диэтиловом эфире - 0,6, диметилсульфоксиде - 39, этаноле - 5, ксилоле - 1,7.

Сандофан - фунгицид, эффективный против грибковых заболеваний фруктовых и овощных культур. ЛД₅₀ для крыс 1860 - 3480 мг/кг. МДУ оксадиксила в картофеле, свекле сахарной - 1 мг/кг, в яблоках, томатах, винограде - 0,5 мг/кг. ОБУВ в воде санитарно-бытового водопользования - 0,05 мг/л. ОДК в почве - 0,5 мг/кг. ДСД - 0,017 мг/кг веса человека в сутки.

2. Методика определения.

2.1. Основные положения.

2.1.1. Принцип метода.

Метод основан на извлечении оксадиксила из анализируемого объекта этилацетатом, очистке экстракта на колонке с оксидом алюминия и определении газожидкостной хроматографией. При определении методом ТСХ дополнительно проводится очистка микросублимацией в вакууме.

2.1.2. Избирательность метода.

Метод селективен, фосфорорганические пестициды, симм-триазиновые гербициды, байлетон, байтан, ридомил определению не мешают. Селективность обеспечивается сочетанием метода ГЖХ и ТСХ.

2.1.3. Метрологическая характеристика метода

Метрологическая характеристика метода представлена в таблице 1.

2.2. Реактивы и растворы.

Гексан, хч., ТУ 6-09-3375-78.

Ацетон, хч., ГОСТ 2603-79.

Этилацетат, хч., МРТУ 6-09-6515.

Хлороформ, чда., ГОСТ 20015-74.

Оксид алюминия 2 степени активности по Брокману, нейтральный, производства ВНР, Реанал или отечественный, для хроматографии. МРТУ 6-09-5296-68.

Хроматон N-AW-HMDS (0,20 - 0,25 мм). ЧССР. Хемапол.

Карбовакс 20М, полиэтиленгликоль 20000.

Сульфат натрия, хч., ТУ 6-09-3675-74, безводный.

Азот газообразный из баллона с редуктором. ГОСТ 9293-74.

Водород из баллона с редуктором, ГОСТ 3022-80, или получаемый из генератора водорода.

Воздух из баллона с редуктором, ГОСТ 11882-73, или нагнетаемый компрессором.

о-Толидин, ТУ 6-09-2232-75.

Хлороводородная кислота, HCl, ч., ГОСТ 3118-77, концентрированная.

Перманганат калия, ч., ГОСТ 20490-75.

Уксусная кислота, ч., ГОСТ 18270-72, ледяная.

Йодид калия, KI, ч., ГОСТ 4232-74.

2.3. Приборы и посуда.

Хроматограф "Цвет-106" или аналогичный прибор с термоионным детектором.

Хроматографическая колонка стеклянная, длиной 65 см, внутренним диаметром 3 мм.

Хроматографическая камера с пришлифованной крышкой, ГОСТ 25336-82.

Хроматографическая колонка с краном и оттянутым носиком, длиной 10 см, внутренним диаметром 1 см.

Микросублиматор, рис. 1.

Аппарат для встряхивания, ТУ 64-1-1081-73 или аналогичный.

Пульверизатор, ГОСТ 25336-82.

Лампа УФ-света, ТУ 16-535-280-74, или аналогичная.

Эксикатор, ГОСТ 25336-82.

Чашка Петри, ГОСТ 25336-82.

Градуированные пробирки, ГОСТ 1770-74, с пробками на шлифах, вместимостью 10 и 5 мл.

Микрошприц на 100 мкл или микропипетка, ГОСТ 20292-74, на 0,1 мл.

Делительные воронки, ГОСТ 25336-82, вместимостью 1 л.

Колбы мерные, ГОСТ 1770-74, вместимостью 100 мл.

Колбы плоскодонные, ГОСТ 9737-70, вместимостью 500 и 250 мл.

Цилиндры мерные, ГОСТ 1770-74, вместимостью 100 мл.

Колбы грушевидные, ГОСТ 9737-70, вместимостью 50 мл.

Воронки химические, ГОСТ 25336-82.

Пластинки хроматографические "Silufol" или "Sorbfil", ТУ 26-11-17-89, производство ПКБ Пластмаш, ИВС АН СССР, г. Краснодар.

2.4. Отбор, хранение и подготовка проб.

2.4.1. Отбор проб.

Отбор проб для анализа проводят в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов", утвержденными Минздравом СССР 21 августа 1979 г. N 2051-79.

2.4.2. Подготовка проб к анализу.

Для анализа картофеля, томатов, огурцов, сахарной свеклы из отдельных клубней или плодов ножом вырезают сектора толщиной 2 - 3 мм и измельчают их на мелкие дольки. Для анализа винограда отбирают 2 - 3 ягоды из каждой грозди и также измельчают ножом.

Подготавливают по 3 - 5 параллельных навесок анализируемых образцов, массой 50 г. Почву просеивают через почвенное сито и отбирают навески массой 10 г.

2.5. Подготовка к определению.

2.5.1. Приготовление стандартных растворов.

Стандартный раствор оксадиксила из очищенного препарата с содержанием действующего вещества не менее 95,0% - в ацетоне с концентрацией 100 (раствор N 1) и 10 (раствор N 2) мкг/мл. Стандартные растворы стабильны при хранении в темном месте при температуре 22 - 24 °C в течение 6 месяцев.

2.5.2. Приготовление проявляющих реагентов.

Проявляющий реагент. Растворяют 0,16 г о-толидина в 30 мл ледяной уксусной кислоты, доводят до 500 мл дистиллированной воды и прибавляют 1 г йодида калия. Раствор хранят в темной склянке. Годен к употреблению в течение длительного времени.

2.5.3. Подготовка газохроматографической колонки.

Для приготовления насадки колонки для хроматографического анализа жидкую фазу карбовакс 20 М в количестве 2% от веса хроматона помещают в круглодонную колбу и растворяют в хлороформе. Объем хлороформа должен быть в два раза больше насыпного объема сорбента и должен занимать не более 1/3 объема круглодонной колбы.

В полученный раствор при постоянном перемешивании насыпают хроматон. Колбу подсоединяют к ротационному вакуумному испарителю и перемешивают содержимое колбы без подогрева в течение нескольких минут. Затем колбу помещают в горячую водяную баню и отгоняют растворитель полностью с подсоединением слабого вакуума. Сорбент с нанесенной фазой высыпают в фарфоровую чашку и нагревают в сушильном шкафу при 80 - 100 °C в течение 30 мин, охлаждают на воздухе, перемешивая стеклянной палочкой. Подготовленный таким образом носитель хранят в стеклянной склянке с притертой пробкой.

Хроматографическую колонку заполняют насадкой с подсоединением слабого вакуума. Колонку кондиционируют при скорости азота 70 - 80 мл/мин в режиме программирования температуры от 50 до 240 °C, со скоростью нагрева 2 °C в мин, а затем в изотермическом режиме при 240 °C в течение 6 - 8 час без подсоединения колонки к детектору.

2.5.4. Приготовление колонки с оксидом алюминия

В стеклянную хроматографическую колонку помещают ватный тампон, затем суспензию 4 г оксида алюминия в 15 мл хлороформа (при открытом кране колонки). Когда сорбент заполнит всю колонку, дают возможность стечь избытку растворителя, оставляя маленький слой его (0,2 - 0,3 см) на поверхности оксида алюминия. Кран закрывают.

2.5.5. Подготовка хроматографических камер.

Хроматографическую камеру за один час до начала хроматографирования заполняют смесью подвижных растворителей: хлороформ и гексан:ацетон (3:2) для насыщения камеры парами подвижного растворителя. Объем подвижного растворителя в камере должен по высоте находиться не выше, чем на 0,7 - 1,0 см от уровня дна камеры.

2.5.6. Подготовка хлорирующей камеры

Камеру для хлорирования готовят следующим образом: на дно эксикатора помещают чашку Петри с 5 г KMnO₄, а затем к ее содержимому осторожно приливают 15 мл концентрированной HCl. Эксикатор закрывают пришлифованной крышкой. Камера может быть использована через 10 - 15 мин.

2.6. Описание определения

2.6.1. Экстракция и очистка экстрактов

2.6.1.1. Картофель, томаты, огурцы, виноград, сахарная свекла.

Навеску анализируемой пробы (50 г) помещают в плоскодонную колбу, вместимостью 500 мл, заливают 100 мл этилацетата и проводят экстракцию оксадиксила при помощи механического встряхивания колбы в течение 30 мин. Экстракт фильтруют в круглодонную колбу вместимостью 500 мл. Экстракцию оксадиксила повторяют еще дважды тем же количеством растворителя. Этилацетат удаляют с помощью ротационного вакуумного испарителя полностью. Сухой остаток с помощью 2 - 3 мл хлороформа количественно переносят на колонку с оксидом алюминия.

Каждый раз дают возможность раствору впитаться в сорбент, открывая кран колонки, но не допуская ее осушения. Во всех случаях над сорбентом должен оставаться небольшой стой растворителя (2 - 3 мм). Оксадиксил элюируют с колонки 10 мл хлороформа, собирая элюат в круглодонную колбу. Элюирование проводят со скоростью 1 кап/сек. Равномерность потока растворителя обеспечивается вакуумом, регулируемым водоструйным насосом.

Из приемной колбы вместимостью 20 - 25 мл с помощью ротационного вакуумного испарителя полностью отгоняют растворитель. К сухому остатку пипеткой добавляют 2 мл ацетона. Колбочку закрывают пришлифованной пробкой и ее стенки тщательно обмывают растворителем. В хроматограф вводят 3 мкл полученного раствора.

При определении методом ТСХ очистки экстракта на колонке с оксидом алюминия, как правило, недостаточно. Для этого дополнительно вводится очистка микросублимацией в вакууме. Для этого из колбы, после отгона растворителя с помощью ацетона оксадиксил количественно переносится в патрон сублиматора и растворитель при нагревании патрона сублиматора на горячей водяной бане полностью удаляется. Необходимо следить, чтобы остаток равномерно распределялся по дну патрона. В патрон сублиматора вставляют "палец" сублиматора, подсоединяют водяное охлаждение и сублимируют оксадиксил при 0,3 мм рт. ст. на кипящей водяной бане в течение 40 мин.

После охлаждения сублиматора и снятия вакуума, "палец" вынимают из патрона и смывают оксадиксил с "пальца" в градуированную пробирку вместимостью 5 мл ацетона. В пробирку вставляют заплавленный в верхней части стеклянный капилляр и концентрируют ее содержимое на горячей водяной бане до объема 1 мл. На хроматографическую пластинку наносят 0,1 мл полученного раствора.

2.6.1.2. Почва. К 10 г почвы, растертой в фарфоровой ступке, добавляют 2 мл дистиллированной воды. Почву тщательно увлажняют. Экстракцию оксадиксила проводят этилацетатом три раза порциями по 50 мл при механическом встряхивании колбы в течение 30 мин. Дальнейшее определение проводят согласно разделу 2.6.1.1.

2.6.1.3. Вода. 500 мл воды помещают в делительную воронку вместимостью 1 л, добавляют около 5 г хлорида натрия и 50 мл хлороформа. Смесь в течение нескольких минут энергично встряхивают. После разделения слоев нижний хлороформный слой сливают в плоскодонную колбу вместимостью 250 мл. Экстракцию оксадиксила повторяют еще дважды тем же количеством растворителя. Объединенный экстракт сушат над безводным сульфатом натрия (-10 - 12 г).

Раствор сливают через бумажный фильтр порциями в грушевидную колбочку вместимостью 50 мл. Концентрируют каждую порцию с помощью ротационного вакуумного испарителя до объема 2 мл. Последнюю порцию растворителя отгоняют полностью. К сухому остатку пипеткой добавляют 2 мл ацетона, колбочку закрывают пробкой на шлифе и ее стенки тщательно обмывают растворителем. В хроматограф вводят 3 мкл. На хроматографическую пластинку наносят 0,1 мл полученного раствора.

2.6.2. Условия хроматографирования.

2.6.2.1. ГЖХ.

Хроматограф Цвет 106 с ТИД.

Насадка колонки 2% карбовакса 20 М на хроматоне N-AW-HMДS (0,20 - 0,25).

Длина и внутренний диаметр колонки 65 см x 3,0 мм.

Скорость потока газа - носителя азота 100 мл/мин.

Скорость потока водорода 20 мл/мин.

Скорость потока воздуха 300 мл/мин.

Температура термостата колонки 240 °C.

Температура испарителя 240 °C.

Рабочая шкала электрометра 5·10^-10 а.

Скорость протяжки ленты самописца 240 мм/час.

Объем вводимой пробы 3 мкл.

Время удерживания оксадиксила 3 мин. 38 с.

Линейный диапазон определения 3 - 180 нг.

2.6.2.2. ТСХ.

На хроматографические пластинки с помощью микрошприца 100 мкл или микропипетки на 0,1 мл наносят аликвотную часть полученного по п. 2.!. раствора. Справа и слева таким же способом наносят серию стандартных растворов оксадиксила с содержанием 0,2; 0,3; 0,4; 0,5 ........ 1,0 мкг. Градуировочные растворы готовят в градуированных пробирках вместимостью 10 мл с пробками на шлифах согласно таблице 2.

Хроматограмму развивают в системе сначала хлороформ, а затем после высушивания хроматограммы - гексан:ацетон (3:2). После развития высушенную хроматограмму помещают под лампу УФ-света на 10 мин, а затем на 10 мин в свежеприготовленную хлорирующую камеру. После удаления избытка хлора пластинку обрабатывают из пульверизатора проявляющим реагентом. Оксадиксил проявляется в виде темных пятен на белом фоне с Rf 0,30 = 0,05. Линейный диапазон определения 0,2 - 1,0 мкг. Пятна стабильны в течение длительного времени.

2.6.3. Обработка результатов анализа.

2.6.3.1. ГЖХ.

Количественное определение проводят методом соотношения со стандартом, по высоте пика. Стандартный раствор с содержанием 10 мкг/мл оксадиксила вводят до и после введения рабочей пробы.

Содержание оксадиксила в анализируемой пробе (X) в мг/кг или мг/л вычисляют по формуле:

C - количество стандарта, введенного в хроматограф, нг;

Hпр - высота пика рабочей пробы, мм:

Hст - высота пика стандарта, мм;

V - общий объем рабочего раствора, мл;

Vа - объем аликвоты, вводимой в хроматограф, мкл;

P - навеска анализируемого образца в г или объем пробы воды в мл.

Если при введении в хроматограф получаются слишком большие пики или происходит "зашкаливание" к рабочему раствору пипеткой добавляют замеренное количество ацетона и анализируют более разбавленный раствор.

2.6.3.2. ТСХ.

Количественное определение оксадиксила проводят путем сравнения площади и интенсивности окраски пятен рабочей пробы и серии стандартов.

Содержание оксадиксила в анализируемой пробе (X) мг/кг (мг/мл) вычисляют по формуле:

C - содержание оксадиксила, найденное в хроматографируемой пробе, мкг.

V - общий объем раствора, мл;

V_а - объем аликвоты, нанесенной на пластинку, мл;

P - навеска или объем анализируемой пробы в г или мл.

3. Требования техники безопасности.

При работе соблюдать требования безопасности, принятые для работы с легковоспламеняющимися жидкостями и пестицидами.