"Методические указания по определению остаточных количеств антибиотиков в продуктах животноводства"
(утв. Минздравом СССР 29.06.1984 N 3049-84)

В целях дальнейшей интенсификации животноводства и птицеводства, повышения производства мяса и других продуктов животного происхождения в сельском хозяйстве нашей страны применяются антибиотики для стимуляции роста, повышения эффективности откорма скота и птицы, а также в качестве лечебно-профилактических средств. Среди них препараты, содержащие тетрациклин, пенициллин, стрептомицин, немедицинские антибиотики: гризин, цинкбацитрацин и прочие.

Условия применения антибиотиков для выращивания, откорма и лечения сельскохозяйственных животных и птицы регламентированы Инструкцией, утвержденной МСХ СССР в 1980 г., и Методическими указаниями по применению антибиотиков в ветеринарии (М., 1973), соблюдение которых должно гарантировать безопасность для здоровья населения продуктов, полученных от леченных или стимулированных антибиотиками животных. Однако в силу различных причин в пищевых продуктах, полученных от этих животных, в ряде случаев содержатся остатки антибиотиков.

Антибиотики тетрациклинового ряда могут попадать в продукты питания в результате неправильного использования их в качестве лечебных средств. Наличие в молоке стрептомицина, пенициллина и др. обусловлено чаще всего использованием для лечения маститов коров препаратов длительного действия на масляной основе. Присутствие немедицинских антибиотиков (гризина и пр.) отмечено при включении в корма в экспериментальных условиях в превышенных количествах этих препаратов. Материалы научных исследований свидетельствуют о наличии остаточных количеств антибиотиков в мясных, молочных продуктах, яйцах. Вместе с тем длительное использование в пищу продуктов, содержащих остаточные количества антибиотиков, может вызвать неблагоприятные для здоровья человека последствия - аллергические реакции, дисбактериоз, образование и передачу резистентных форм микробов. Экспериментально установленные при этом уровни неблагоприятного действия антибиотиков на организм позволили обосновать величины максимально допустимого суточного поступления их в организм человека с продуктами питания и сделать вывод, что при санитарном контроле продуктов питания остаточные количества антибиотиков в них не должны допускаться при использовании предлагаемых ниже утвержденных методов исследования в пределах их чувствительности (для хлортетрациклина, пенициллина - 0,01, стрептомицина - 0,5, гризина и цинкбацитрина - 0,1 и 0,002 ЕД на г/мл продукта).

Повышение эффективности санитарного надзора по предупреждению попадания в продукты питания антибиотиков должно осуществляться путем периодического отбора на мясокомбинатах, молочных заводах, в животноводческих и птицеводческих хозяйствах, торговой сети проб молока, молочных продуктов, мяса, субпродуктов, яиц для определения в них антибиотиков. Необходимо выявлять хозяйства, поставляющие пищевые продукты, загрязненные антибиотиками, выявлять причины попадания в них антибиотиков и принимать меры для устранения этих нарушений, не допускать снабжения пищевыми продуктами, содержащими остаточные количества антибиотиков, детских учреждений, больниц и т.п.

Реализация молока с наличием остаточных количеств антибиотиков решается в каждом конкретном случае представителями Государственного санитарного и ветеринарного надзора.

Молоко, содержащее остаточные количества любых антибиотиков, может использоваться в качестве дополнительного кормового средства при откорме молодняка сельскохозяйственных животных.

Творог, сметану, яйца, содержащие остаточные количества антибиотиков тетрациклинового ряда, пенициллина, следует направлять на изготовление хлебобулочных и кондитерских изделий с расчетом, чтобы соотношение "загрязненных продуктов" с другими компонентами изделий было не меньшим, чем 1:4 (при содержании остаточных количеств антибиотиков до 0,05 ЕД/г), 1:10 и 1:100 - при содержании остаточных количеств антибиотиков до 0,1 ЕД/г и до 1,0 ЕД/г и более, соответственно.

Мясо и субпродукты, содержащие остаточные количества антибиотиков, не следует в необработанном виде реализовывать населению. Такое мясо должно направляться на изготовление мясных, мясо-растительных консервов, за исключением консервов для детского питания, концентратов I и II блюд, вареных и варено-копченых колбас при условии обязательной подсортировки к мясу или компонентам блюд, не содержащих остаточных количеств антибиотиков. Среднерасчетная кратность разведения "загрязненного" антибиотиками мяса незагрязненным должна составлять 17 (по данным Института питания АМН СССР). В каждом конкретном случае вопрос о реализации и использовании мяса с наличием остаточных количеств антибиотиков решается представителями Государственного санитарного и ветеринарного надзора с условием, что при подсортировке кратность соотношения "загрязненных" и незагрязненных продуктов должна зависеть от выявленной концентрации антибиотика, с тем, чтобы в конечном итоге содержание остаточного количества антибиотика было ниже уровня чувствительности утвержденных методов исследования.

Например, в образцах мышечной ткани от говяжьей туши N "__", поступившей на забой из с-х "...-ский", выявлено содержание хлортетрациклина на уровне 0,2 ЕД/г. Следовательно, чтобы содержание антибиотика в продукте снизилось до менее 0,01 ЕД/г, мясо от этой туши должно быть направлено на приготовление колбас при условии введения в фарш в размере не более 5% к общей массе продукта. В совхоз должно быть направлено предписание о нарушении инструкций по применению антибиотиков в ветеринарии или при откорме животных, а к руководителю хозяйства приняты административные меры.

При реализации продуктов питания, содержащих остаточные количества стрептомицина, гризина, цинкбацитрацина, должен использоваться такой же подход подсортировки к незагрязненному антибиотиками сырью с учетом выявленной концентрации антибиотика и соответствующей кратностью разведения.

Обеспечить полную безопасность продуктов, содержащих остаточные количества антибиотиков, для потребителей может только четкая организация проведения гигиенических мероприятий, строгий контроль за применением антибиотиков в животноводстве и ветеринарии и выявление их в продуктах питания животного происхождения с помощью чувствительных методов.

В целях систематического контроля в стране за загрязнением продуктов животноводства антибиотиками предлагаются данные "Методические указания по определению остаточных количеств антибиотиков в продуктах животноводства". Наиболее широкое применение как в научных исследованиях, так и в практических учреждениях, нашли микробиологические методы, позволяющие определять минимальные концентрации антибиотиков в исследуемом материале. Они основаны на непосредственном биологическом действии антибиотиков на чувствительные штаммы микроорганизмов и поэтому наиболее специфичны и объективны. Ниже рекомендуются методы определения некоторых антибиотиков:

а) тетрациклиновой группы - в молоке, молочных продуктах, яйцах, мясе, мясных продуктах, в т.ч. мясе и субпродуктах птицы;

б) стрептомицина - в молоке и молочных продуктах, яйцах;

в) пенициллина - в молоке и молочных продуктах;

г) гризина - в мясе;

д) цинкбацитрацина - в мясе.

Содержание антибиотиков выявляют микробиологическим методом диффузии в агар по величине торможения роста следующих тест-культур, внесенных в питательные среды:

- для тетрациклиновых антибиотиков - Bac. cereus АТСС 11778 (чувствительность - 0,01 ЕД/г/мл);

- для стрептомицина - Bac. mycoidis 537 (чувст. 0,5 ЕД/г/мл);

- для пенициллина - S. lutea АТСС 9341 (чувст. 0,01 ЕД/г/мл);

- для гризина - Bac. cubtilis АТСС 6633 (чувст. 0,5 ЕД/г/мл);

- для цинкбацитрацина - M. flavus АТСС 10240 (чувст. 0,02 ЕД/г/мл).

Молоко рекомендуется исследовать на присутствие остаточных количеств антибиотиков в том случае, когда при предварительном исследовании по ГОСТ 23454-79 в нем обнаружены ингибирующие вещества и исключено наличие химических веществ.

Отбор проб молока и молочных продуктов производится по ГОСТ 13928-68 и 9225-68, но не более 50 мл каждой пробы; мяса и мясных продуктов - по ГОСТ 7269-79, но не более 50 г каждой пробы; яйца отбирают в пределах 0,5 - 1% (в зависимости от объема партии).

Санитарный контроль за содержанием антибиотиков в молочных, мясных продуктах, яйцах следует проводить не реже 1 раза в квартал. Количество проб для анализа и перечень антибиотиков определяют в зависимости от состояния вопроса в каждой местности. Органы ветнадзора должны информировать санитарно-эпидемиологическую службу о применяемых в данном районе, области в животноводческих хозяйствах антибиотиках в качестве кормовых или лечебных препаратов.

В случае обнаружения антибиотиков в пищевых продуктах необходимо применять административные меры к руководителям хозяйств за нарушение Инструкций по применению антибиотиков в ветеринарии и при выращивании скота. Врачам по гигиене питания, специалистам ведомственной санитарной службы, ветнадзора следует проводить разъяснительную работу о недопустимости загрязнения пищевых продуктов остаточными количествами антибиотиков.

Материалы по результатам исследований продуктов животноводства на загрязнение антибиотиками в целом по району, области, республике должны ежегодно обобщаться и анализироваться в целях принятия конкретных профилактических мер.

1. Автоклав (стерилизатор паровой), ГОСТ 19569-74.

2. Бумага масштабно-координатная марки ПЛН, ГОСТ 334-73 (полулогарифмическая сетка для расчета активности растворов антибиотиков).

3. Весы лабораторные равноплечие ВЛР-200 г, ТУ 25.06.1131-75.

5. Водяная баня лабораторная (аппарат для инактивирования сыворотки крови МРТУ 42.1091-63).

6. Горелка газовая или спиртовая по ГОСТу 10090-74.

7. Ионометр универсальный (pH-метр) ЭВ-74.

8. Колбы стеклянные конические вместимостью 50, 100, 200, 1000 куб. см по ГОСТу 10394-72.

9. Линейка по ГОСТу 17435-72.

10. Матрацы стеклянные лабораторные вместимостью 1000 куб. см.

11. Мерные колбы и стаканы стеклянные лабораторные на 50, 100, 500 и 1000 куб. см по ГОСТу 23932-79.

12. Микроскоп МБИ или МБР по ГОСТу 8284-78.

13. Микроразмельчитель тканей типа РТ-2, МРТУ 04.1.1505-63 (или фарфоровая ступка с пестиком по ГОСТу 9147-73 и кварцевый песок).

14. Ножницы по ГОСТу 21239-77; скальпель, ГОСТ 21240-77; пинцеты по ГОСТу 31241-77.

15. Палочки стеклянные.

16. Петля бактериологическая.

17. Пробочное сверло 9 мм.

18. Пипетки измерительные градуированные вместимостью 1,0, 2,0, 5,0, 10,0 куб. см по ГОСТу 20292-74.

19. Пробирки стеклянные химические 16 мм по ГОСТу 23932-79.

20. Пробирки центрифужные емкостью 10 куб. см.

21. Стеклянный стандарт мутности для оптической стандартизации бактерийных взвесей.

22. Сушильный шкаф круглый по ТУ 64-1-1411.

23. Термостаты электрические с водяной рубашкой по МРТУ 421878-60.

24. Трафарет для вырезания лунок.

25. Уровень для установления горизонтальной поверхности.

26. Холодильник бытовой по ГОСТу 16317-70.

27. Центрифуга лабораторная стационарная ЦЛС-31М по ГОСТу 51107-71; центрифуга настольная ЦЛН-2, МРТУ 421742-63.

28. Цилиндры мерные на 50, 100, 250, 1000 куб. см по ГОСТу 1770-74.

29. Чашки биологические стеклянные тип Петри по ГОСТу 23932-79, а также чашки из полимерных материалов.

30. Штативы для пробирок на 20 - 40 гнезд по ТУ 64-1-2669-78.

1. Агар-агар микроскопический по ГОСТу 17206-71.

2. Мясо-пептонный бульон по ГОСТу 20730-75.

3. Дрожжевой экстракт (экстракт кормовых дрожжей сухой, производство МНИИВС).

4. Мясная вода по ГОСТу 20729-75.

5. Панкреатический гидролизат казеина.

6. Пепсин медицинский.

7. Пептон сухой ферментативный, ГОСТ 13805-76.

8. Бульоны Хоттингера с содержанием аминного азота 33 мг%, 100 мг%, 130 - 140 мг% по ГОСТу 10444.1-75.

1. Глюкоза кристаллическая ХЧ по ГОСТу 975-75.

2. Вода дистиллированная, ГОСТ 6709-72.

3. Натрия гидрат окиси (натр едкий), ГОСТ 4328-66, 10% р-р.

4. Натрий лимоннокислый, х.ч., ГОСТ 22280-76.

5. Калия фосфат однозамещенный, х.ч., ГОСТ 4198-65.

6. Калия фосфат двухзамещенный, х.ч., ГОСТ 2493-65.

7. Натрия фосфат двухзамещенный, х.ч., ГОСТ 11773-66.

8. Спирт этиловый, ректификованный по ГОСТ 5262-67.

9. Кислота соляная, х.ч., уд. вес 1,18 - 1,19.

10. Натрий хлористый, х.ч. по ГОСТу 4233-77.

11. Стандарты антибиотиков производства ГИСК им. Л.А. Тарасевича.

Тест-культурами служат специально отобранные, образующие и необразующие споры, непатогенные или условно патогенные штаммы микроорганизмов, обладающие высокой чувствительностью к антибиотикам. Они должны хорошо расти на применяемых средах, образуя сплошной газон и четко очерченные зоны задержки роста в местах диффузии антибиотиков в агар.

Культуру высевают в пробирки со скошенным агаром (2% МПА, pH 7,1 +/- 0,1) и выращивают при 29,0 +/- 1,0 град. C в течение 20,0 +/- 2,0 часов. Эту культуру смывают со скошенного агара 8,0 +/- 2,0 мл стерильной дистиллированной воды. Весь объем образовавшейся суспензии вносят в матрацы с 200 +/- 1,0 мл 2% МПА и выращивают в течение 7 дней при температуре 30 град. C. Через 7 суток из культуры готовят мазки, окрашивают по Граму и, если в поле зрения содержится 80 - 90% спор, культуру смывают 50 мл стерильной дистиллированной воды. Взвесь спор прогревают на водяной бане при 65 - 70 град. C в течение 30,0 +/- 1,0 мин., трижды центрифугируют при 3 тыс. оборотов в минуту в течение 10 мин., каждый раз промывая осадок стерильной дистиллированной водой до получения прозрачной надосадочной жидкости. Промытую взвесь спор прогревают вновь на водяной бане 30,0 +/- 1,0 мин. при 65 - 70 град. C. Полученную взвесь спор стерильно разливают в пробирки или ампулы, запаивают и хранят при температуре не выше 4 град. C и используют до тех пор, пока споры образуют хороший газон и четко очерченные края зон.

Культуру пересевают на скошенный агар (2% МПА, среда N 2, pH 7,9 +/- 0,1) и выращивают при 37 град. C в течение 20 +/- 2,0 часа. В мазках культуры должны быть обнаружены грамположительные палочки с закругленными концами, располагающиеся отдельно или цепочками. Затем эту культуру со скошенного агара смывают 7 +/- 2,0 мл стерильной дистиллированной воды. Образовавшуюся суспензию вносят в матрацы с 2% агаризированной средой, приготовленной на бульоне Хоттингера с содержанием 33 мг% аминного азота, pH 6,1 +/- 0,1 (среда N 4). Засеянные матрацы выдерживают при 37 град. C в течение 7 дней, после чего готовят мазки и, если в мазках, окрашенных по Граму, имеется в поле зрения 85 +/- 5,0% спор, культуру смывают стерильной дистиллированной водой.

Полученную взвесь спор прогревают при 65 - 70 град. C в течение 30 мин., а затем поступают так же, как и при получении спор Bac. cereus АТСС 11778, п. 6.1.

В стандартную пробирку с 5 мл стерильной дистиллированной воды добавляют 0,1 - 0,2 мл взвеси спор Bac. mycoidis 537 и по стандарту мутности на 10 ед. разводят споры до 1 млрд. микробных тел в 1 мл. Взвесь спор вносят в охлажденную до 60 град. C питательную среду из расчета 20 млн. спор в 1 мл среды, т.е. 2 мл 1 млрд. взвеси в 100 мл среды.

Культуру выращивают в течение 20 +/- 2,0 час. в пробирках со средой N 7, после чего ее смывают стерильным физиологическим раствором и хранят при 4 град. C. Микробную взвесь суточной культуры разводят до 1 млрд. микробных тел так же, как и Bac. mycoidis 537. Готовую взвесь засевают в расплавленную и остывшую до 50 град. C питательную среду N 7 из расчета 30 млн. микробных тел на 1 мл среды, т.е. 3 мл 1 млрд. взвеси на 100 мл среды.

Культуру высевают в пробирки со скошенным агаром (2% МПА, pH 6,5 +/- 0,1) и выращивают при 37 град. C в течение 18 - 20 часов. Затем эту культуру со скошенного агара смывают 7 +/- 2,0 мл стерильной дистиллированной воды и засевают матрацы с 2% агаризированной средой, приготовленной на бульоне Хоттингера с содержанием 33 мг% аминного азота, pH 7,9 +/- 0,1 (среда N 5). Выращивают при 37 град. C в течение 7 суток, а затем поступают так же, как при получении спор Bac. cereus АТСС 11778.

Культуру выращивают в пробирках со скошенным МПА с pH 6,5 +/- 0,1 (среда N 6). Используется суточная культура тест-микроба, выращенная на скошенном МПА pH 6,5 +/- 0,1 при 37 град. C в течение 19 +/- 1,0 час. Выращенную культуру смывают физиологическим раствором, разводят до 1 млрд. микробных тел по стандарту мутности на 10 ед. Готовую взвесь засевают в расплавленную и остывшую до 50 град. C питательную среду из расчета 1 мл 1 млрд. взвеси на 100 мл среды.

При определении остаточных количеств антибиотиков для приготовления контрольных концентраций используют стандарты антибиотиков, т.е. очищенные образцы препарата, содержащие строго определенное количество единиц действия в 1 мг.

Произвольную навеску хлортетрациклина (5 - 15 мг) растворяют в 0,1 н соляной кислоте в соотношении 1:1 (1 мг антибиотика растворяют в 1 мл кислоты) и получают основной раствор. Далее по схеме N 1 на буфере N 2 готовят контрольное разведение антибиотика. Пример. Стандарт ХТЦ содержит 930 ед./мг. Навеску в 10 +/- 0,0001 мг растворяют в 10 +/- 0,0001 мл 0,1 н HCl. Основной раствор содержит 930 ед./мл. Из основного раствора готовят контрольное разведение, равное 0,05 ед./мл.

Основной раствор хранится в холодильнике 30 суток.

Навеску стандарта растворяют в фосфатном буфере pH 6,0 (N 4) в соотношении 1:1 (1 мг антибиотика растворяют в 1 мл буфера). Этот раствор является основным и хранится в холодильнике до 30 дн. Из основного раствора на фосфатном буфере pH 7,9 +/- 0,1 (буф. N 6) готовят рабочую концентрацию стрептомицина, равную 2 ед./мл.

Основной раствор хранится в холодильнике 30 суток.

Навеску пенициллина растворяют в фосфатном буфере pH 6,0 (буф. N 4) в соотношении 1:1, т.е. 1 мг антибиотика в 1 мл буфера. Этот раствор является основным и хранится в холодильнике 7 дней. Из него на том буфере готовят контрольную концентрацию пенициллина - 0,05 ед./мл.

Для приготовления основного раствора берут произвольную навеску стандарта гризина (5 - 15 мг) и растворяют ее в 0,01 н HCl из расчета 1 мг или 1000 ед./мг.

Основной раствор хранится в течение 30 дней. Дальнейшие разведения делают на буфере N 7 (pH 3,2) по схеме N 4.

Для приготовления основного раствора стандарта бацитрацина берут произвольную навеску стандарта бацитрацина (10 - 20 мг) и растворяют ее в фосфатном буфере pH 6,0 (буфер N 4) до получения концентрации 100 ед./мл.

Основной раствор стандарта бацитрацина можно хранить в течение 30 дней. Из основного раствора готовят (рабочее) контрольное разведение, равное 0,2 ед./мл по схеме N 5.

Колбы с агаром помещают в кипящую водяную баню. Для определения тетрациклинов используется среда N 3, стрептомицина - N 4, пенициллина - N 7, гризина - N 8, цинкбацитрацина - N 6. Расплавленный агар охлаждают до определенной температуры и вносят в него необходимое количество взвеси тест-культуры: аспорогенные культуры (Sar lutea, M. flavus) засевают при температуре среды не выше 48 град. C +/- 2 град. C, а споровые (Bac. cereus, Bac. cubtilis, Bac. mycoidis) при 58 град. +/- 2,0 град. C. Среду перемешивают круговыми движениями и разливают в чашки Петри по 10,0 +/- 0,1 мл, установленные строго на горизонтальном столе.

После застывания сред под дно чашек подкладывают трафарет (рис. 1 <*>) и пробочным сверлом N 3 (9 мм) вырезают 6 лунок, вырезанные блоки вынимают скальпелем.

--------------------------------

<*> Рисунки не приводятся.

Пробы молока и жидких молочных продуктов по 10,0 +/- 0,1 мл, творога по 10,0 +/- 0,1 г вносят в колбочки емкостью 50 мл и добавляют 10,0 +/- 0,1 мл буферного раствора соответственно определяемому антибиотику, т.е. при определении тетрациклинов - буфер N 3; для стрептомицина - буфер N 6; пенициллина - буфер N 5 (см. раздел 5. Буферные растворы для экстрагирования антибиотиков). Таким образом, получается разведение 1:2.

Яйца, предназначенные для исследования, предварительно прогревают на водяной бане при 65,0 +/- 5,0 град. C в течение 10 +/- 0,1 мин. Яйца освобождают от скорлупы, затем отвешивают по 10,0 +/- 0,1 г смешанного содержимого каждого яйца в колбочки и приливают 10,0 +/- 0,1 мл буфера соответственно определяемому антибиотику, т.е. при определении тетрациклинов - буфер N 3, стрептомицина - буфер N 6.

Подготовленные пробы помещают в термостат для экстракции антибиотиков на 90,0 +/- 1 мин. при 37 град. C +/- 0,1 град. C, периодически встряхивая содержимое колбочек, после чего смесь прогревают на водяной бане при температуре 60,0 +/- 1,0 град. C в течение 20,0 +/- 0,1 мин.

Пробы переносят в центрифужные пробирки и центрифугируют при 3000 +/- 100 об./мин. в течение 10,0 +/- 0,1 мин. Надосадочная жидкость является первым разведение (1:2) и готова для внесения в лунки. Второе разведение (1:4) готовят в химических пробирках: 1,0 +/- 0,1 мл надосадочной жидкости приливают к 1,0 +/- 0,1 мл буфера соответственно определяемому антибиотику (без пепсина).

В подготовленные для исследований на соответствующий антибиотик чашки Петри, в три заранее отмеченные стеклографом лунки, вносят контрольное разведение стандарта, соответствующего определяемому антибиотику, по 0,05 +/- 0,01 мл, а в три другие вносят такое же количество одного из разведений испытуемых растворов. Для каждого антибиотика на одну пробу необходимо 2 - 4 чашки Петри, т.е. на каждое разведение по 1 - 2 чашки.

После внесения в лунки экстрактов и стандарта антибиотика с определяемой концентрацией чашки помещают в термостат на 20 +/- 2 часа при температуре 29 +/- 1,0 град. C (при определении тетрациклинов и пенициллина) или при 37 +/- 1,0 град. C (при определении стрептомицина).

На следующий день замеряют зоны задержки роста тест-культуры и производят расчет содержания антибиотиков в исследуемых продуктах (п. 10.1).

Навески по 10,0 +/- 0,1 г мышечной ткани, почки, печени, легкого и др. органов, вырезанные из средней части образца, измельчают режущим инструментом с последующим растиранием в ступке с кварцевым песком (предварительно простерилизованным), приливая 20,0 +/- 0,1 мл буфера соответственно определяемому антибиотику, т.е. при определении тетрациклинов - буфер N 3, цинкбацитрацина - N 4, гризина - физиологический раствор (0,85% NaCl). При наличии микроразмельчителя тканей к измельченной ножницами пробе добавляют 20,0 +/- 0,1 мл буфера, тщательно перемешивают, переносят в стакан от микроразмельчителя и гомогенизируют образец при максимальной скорости оборотов в течение 3 мин.

Экстракцию антибиотиков проводят в течение 1,5 +/- 0,5 час.

При исследовании на гризин и цинкбацитрацин гомогенат прогревают на водяной бане при 65 +/- 5 град. C 30 мин. для инактивации возможных ингибиторных веществ и лучшей десорбции антибиотика.

Центрифугируют пробы при 3000 об./мин. в течение 20 +/- 1 мин.

Затем поступают либо соответственно ходу определения, описанному в предыдущем п. 9.1 (когда надосадочную жидкость, являющуюся разведением 1:3, и приготовленное из нее разведение 1:6 вносят в лунки зараженной тест-микробом среде, далее - по тексту п. 9.1), либо следующим образом:

Надосадочную жидкость в количестве 0,05 +/- 0,001 мл от каждого исследуемого образца вносят в 2 - 3 лунки на 2 параллельные чашки Петри. При определении гризина чашки ставят на 3 часа в холодильник при +4 град. C для преддиффузии.

Засеянные чашки с внесенной в лунки надосадочной жидкостью инкубируют в течение 18 +/- 0,5 час. при 29 +/- 1 град. C (определение тетрациклинов) либо при 37 +/- 0,1 град. C (определение гризина и цинкбацитрацина), после чего измеряют диаметры зон задержки роста тест-культуры и производят расчет активности остаточных количеств антибиотиков в исследуемых субстратах (п. п. 10.1, 10.2).

Измеряют зоны задержки роста тест-культур и производят расчет содержания антибиотиков в исследуемых продуктах либо по таблицам, составленным В.С. Дмитриевой и С.М. Семеновым (Дмитриева В.С., Семенов С.М. "Микробиологический контроль активности антибиотических препаратов", М., 1965) (п. 10.1), или по стандартным кривым (п. 10.2).

В среднее зон стандарта каждой чашки вносят поправку по постоянной зоне таблиц, которая равна 17 мм, что соответствует контрольной концентрации стандарта 0,05 ед./мл, а затем поправку вносят в величину зон испытуемого препарата.

Определяют разность диаметров зон подавления роста при двух разведениях испытуемого препарата:

20,2 - 17,3 = 2,9 мм.

По таблице, соответствующей этой разности диаметров зон, находят значение активностей соответствующих диаметров зон подавления роста после поправки. В вертикальном столбце находят целые числа, в горизонтальном - десятые доли. Полученные значения умножают на соответствующие показатели разведения (2 и 4; 3 и 6).

2,15 ед./мл x 3 = 6,45 ед./мл (зона 20,2)

1,08 ед./мл x 6 = 6,48 ед./мл (зона 17,3)

-----------------------------------------

среднее 12,93 : 2 = 6,465 ед./мл

Пример расчета. Если контрольная концентрация больше или меньше 1 ед./мл, то надо соответственно умножить или разделить на кратность этого числа 1 (К = 0,05 ед./мл, кратность = 20).

6,465 : 20 = 0,323, соответствует 6,465 x 0,05;

К = 2 ед./мл - 6,465 x 2 = 12,93 ед./мл.

Для построения стандартной кривой используются рабочие растворы с концентрациями: 0,4; 0,2; 0,1; 0,05; 0,025; 0,01 ед./мл приготовленные по схеме N 6.

В несколько проб (по 5 г) измельченной мышечной ткани или субпродуктов, не обработанных антибиотиками, вносят раствор антибиотика с вышеперечисленными концентрациями в количестве 5 мл. Перемешивают и оставляют на 18 +/- 1 час. при температуре +4 град. C. Затем центрифугируют при 3500 +/- 500 об./мин. в течение 25 мин. Надосадочная жидкость служит стандартом определенной концентрации антибиотика при построении кривой на полулогарифмической сетке (рис. 2). Надосадочную жидкость соответственно 5 - 6 рабочим концентрациям стандартного антибиотика вносят в количестве 0,05 +/- 0,001 мл в 2 - 3 лунки на 2 параллельных чашках Петри с засеянной тест-микробом средой. Инкубируют чашки, как указано в п. 9.2.

Рассчитывают среднеарифметическое значение диаметров зон задержки роста тест-микробов для каждой концентрации рабочего раствора стандарта из двух параллельных чашек и наносят их в виде точек на оси абсцисс. Из этих точек, а также из точек на оси ординат, соответствующих концентрациям рабочих растворов 0,4; 0,2; 0,1; 0,05; 0,025; 0,01 ед./мл, проводят вертикальные и горизонтальные прямые. Линия, соединяющая точки пересечения указанных прямых, - стандартная кривая <*>. Стандартную кривую строят для каждой партии питательной среды.

--------------------------------

<*> При отсутствии образцов мышечной ткани и субпродуктов, не обработанных антибиотиками, для построения стандартной кривой можно пользоваться рабочими растворами стандартного хлортетрациклина, приготовленными на буфере N 2 (р-ры 5, 6, 7, 8, 9), непосредственно внося их в лунки на чашке Петри.

Для построения стандартной кривой при определении гризина используются растворы с концентрациями: 1,6; 1,2; 0,8; 0,6; 0,4; 0,3; 0,2, после их контакта с мышечной тканью или субпродуктами. Указанные концентрации гризина делаются на физрастворе (0,85% NaCl) по схеме N 7.

Далее поступают согласно методу, описанному в п. 10.2.1 настоящего раздела, с учетом того, что на оси ординат откладывают значение концентраций контрольных растворов гризина, указанных выше.

Для построения стандартной кривой при определении цинкбацитрацина из основного раствора по схеме N 8 с использованием буфера N 4 готовят рабочие растворы с концентрациями: 0,8; 0,4; 0,2; 0,1; 0,06; 0,03; 0,02 ед./мл.

Приготовление рабочих концентраций антибиотика и построение стандартной кривой производят согласно методу, описанному в п. 10.2.1 данного раздела, с учетом того, что на оси ординат откладывают значения концентраций контрольных растворов цинкбацитрацина, указанных выше.

Для экстракта (или его значения) исследуемой пробы рассчитывают среднеарифметическое значение диаметров зон задержки роста тест-микроба двух параллельных чашек и наносят его в виде точки на оси абсцисс полулогарифмической сетки. Из этой точки восстанавливают перпендикуляр и проводят его до пересечения со стандартной кривой. Через точку пересечения перпендикуляра со стандартной, параллельно оси абсцисс, проводят прямую до пересечения с осью ординат. Точка пересечения параллельной прямой с осью ординат указывает на активность антибиотика в экстракте исследуемой пробы - "С". Если исследовалось разведение экстракта, то полученный показатель его активности умножают на показатель разведения экстракта.

Расчет содержания остаточных количеств антибиотиков в 1 г исследованного продукта (в том случае, когда стандартная кривая построена с использованием стандартных растворов, внесенных в гомогенаты мышечной ткани или субпродуктов) ведется по формуле:

где: X - активность антибиотика в 1 г продукта;

C - активность антибиотика в 1 мл экстракта исследуемой пробы;

1,5 - степень разведения пробы буфером, отличная от разведения стандартного гомогената.

В случае, когда для построения стандартной кривой использовались чистые растворы стандартного антибиотика, расчет ведут по той же формуле, изменив лишь степень разведения пробы буфером на 3, а именно: X = C x 3. В данном случае в ответе указывают, что стандартная кривая построена с использованием чистых растворов антибиотиков.

Примечания. 1. Для каждой новой партии питательной среды необходимо проверять зоны контрольного разведения стандартного раствора антибиотика.

2. Для внесения в лунки берется то рабочее (контрольное) разведение антибиотика, которое дает диаметр задержки роста тест-культуры, приблизительно 17 мм (16 - 18 мм).

3. Для внесения в лунки испытуемых разведений одной пробы можно пользоваться одной пипеткой, при этом надо начинать с большего разведения (1:4 или 1:6).

4. Каждая партия стандарта пенициллина и стрептомицина отличается своей активностью, и поэтому дается примерная схема приготовления рабочего разведения.

5. Стандарты антибиотиков и стандарты мутности можно выписать по следующим адресам:

а) г. Москва, 121002,

Сивцев Вражек, д. 41,

Государственный Институт стандартизации и контроля медицинских и биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича;

б) г. Москва,

Звенигородское шоссе, д. 5,

Гос. Научно-контрольный институт ветпрепаратов.