"Методические указания по обнаружению, идентификации и определению содержания дезоксиниваленола (вомитоксина) в зерне и зернопродуктах"
(утв. Минздравом СССР 10.10.1985 N 3940-85)

Методические указания предназначены для лабораторий санитарно-эпидемиологических станций и институтов гигиенического профиля при контроле за загрязнением зерна и зернопродуктов дезоксиниваленолом.

Разработаны в лаборатории энзимологии питания и лаборатории гигиенических исследований импортируемых пищевых продуктов Института питания АМН СССР.

Дезоксиниваленол (вомитоксин) - микотоксин, продуцируемый различными видами микроскопических грибов рода Fusarium. Наиболее распространенными продуцентами являются грибы F. graminearum и F. culmorum, вызывающие корневую гниль и ряд других микозов растений.

Дезоксиниваленол - один из наиболее часто обнаруживаемых микотоксинов из группы трихотеценовых, которые являются причиной тяжелых алиментарных токсикозов, характеризующихся геморрагическим синдромом, отказом от пищи, рвотой, поражением кроветворных и иммунокомпетентных органов. Загрязнение дезоксиниваленолом встречается в пораженных грибами Fusarium пшенице, кукурузе, ячмене и других зерновых.

В СССР установлена временная ПДК на содержание дезоксиниваленола в сильных и твердых сортах пшеницы на уровне 1,0 мг/кг, в остальной пшенице - 0,5 мг/кг.

В основе предлагаемого метода определения дезоксиниваленола лежит визуальная оценка интенсивности флуоресценции при тонкослойной хроматографии (ТСХ) после обработки пластинки спиртовым раствором хлористого алюминия.

Предел обнаружения метода 0,2 мг/кг, относительное стандартное отклонение 0,25 - 0,3. Степень извлечения добавленного к образцу стандарта дезоксиниваленола - 90%. Продолжительность анализа - 2 часа.

При использовании высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с УФ-детектором предел обнаружения составляет 0,05 мг/кг, относительное стандартное отклонение 0,05 - 0,09.

Метод включает следующие этапы:

- экстракцию образца смесью ацетонитрил-вода (84:16);

- очистку экстракта с помощью колоночной хроматографии (КХ) на активированном угле и окиси алюминия;

- разделение, идентификацию и определение содержания дезоксиниваленола с помощью одномерной ТСХ с визуальной оценкой интенсивности флуоресценции или с помощью ВЭЖХ на силикагеле с УФ-детектором при длине волны 224 нм (для быстрого выявления образцов, загрязненных дезоксиниваленолом на уровне, превышающем ПДК);

- подтверждение наличия и количественное определение дезоксиниваленола с помощью двумерной ТСХ с визуальной оценкой интенсивности флуоресценции.

Окончательное заключение о наличии и уровне загрязнения образца дезоксиниваленолом принимается только на основе данных двумерной ТСХ.

Методические указания предназначены для лабораторий санитарно-эпидемиологических станций и институтов гигиенического профиля при контроле за загрязнением зерна и зернопродуктов (мука, крупы) дезоксиниваленолом.

1. Аппарат для встряхивания проб типа АВУ-6С по ТУ 64-1-2451-78.

2. Ротационный испаритель с ловушкой ИР-1М или аналогичный.

3. Мельница лабораторная электрическая ЭМ-3А по ТУ 46-22-236-79.

4. Прибор для флуоресцентного анализа витаминов в растворе (модель 833) ТУ 64-1-1080-78 или диагностическая лампа ОЛД-41.

5. Жидкостной хроматограф "Алтекс", модель 336, или другой хроматограф с аналогичными параметрами; колонка и предколонка с силикагелем типа "Ультрасфера-Si" с размером частиц 5 мкм, длина колонки 25 см, предколонки - 4,5 см, внутренний диаметр - 0,46 см; ультрафиолетовый детектор "Кратос", модель SF-757 или другой детектор с аналогичными параметрами.

6. Микрошприц МШ-10 на 10 мкл.

7. Стеклянные камеры для ТСХ с притертыми крышками.

8. Пластинки для ТСХ "Силуфол" размером 15 х 15 см или 20 х 20 см, ЧССР.

9. Колбы плоскодонные конические на 250 мл с НШ 29, тип КнКШ 250-29/32 по ГОСТ 10394-74.

10. Цилиндры мерные на 100 мл с притертой пробкой, тип 2-100 по ГОСТ 1770-74.

11. Колбы грушевидные на 50 мл с НШ 14,5, тип ГрКШ-50-14/23 по ГОСТ 10394-74.

12. Распылитель стеклянный с грушей.

13. Стандартный раствор дезоксиниваленола в смеси бензол-ацетонитрил (5:1) с концентрацией 25 нг/мкл (по поводу получения стандартного раствора обращаться в Институт питания АМН СССР).

14. Ацетонитрил "ч" по ТУ 6-09-3534-74.

15. Ацетон "чда" по ГОСТ 2603-79.

16. Эфир диэтиловый "мед" по ГОСТ 6265-52.

17. Кислота уксусная "чда" по ГОСТ 61-75.

18. Бензол "чда" по ГОСТ 5955-75.

19. Гексан "ч" по ТУ 6-09-3375-78.

20. Изо-пропиловый спирт (пропанол-2) "хч" по ТУ 6-09-402-76.

21. Спирт этиловый - ректификат, ТУ 6-09-1710-77.

22. Хлороформ для наркоза или по ГОСТ 3610-51.

23. Алюминий окись нейтральная для хроматографии по Брокману П, "Реанал" номер по каталогу 01125 (Венгрия) или алюминий окись для хроматографии по ТУ 6-09-3916-75.

24. Уголь активированный Р.72.270.3.

25. Колонка стеклянная хроматографическая 220 х 15 мм.

26. Метанол "чда" по ГОСТ 6995-77.

При отборе пробы для анализа следует руководствоваться требованиями ГОСТа 12430-66 "Сельскохозяйственная продукция. Методы отбора образцов при карантинном досмотре и экспертизе". Отобранную пробу измельчают в течение 1 - 2 мин. в лабораторной мельнице или кофемолке. Навеску 25 г измельченного зерна или муки помещают в плоскодонную коническую колбу на 250 мл, добавляют 20 мл воды и затем 105 мл ацетонитрила. Встряхивают на аппарате для встряхивания проб в течение 30 минут. Полученную смесь фильтруют через бумажный складчатый фильтр в мерный цилиндр.

В стеклянную хроматографическую колонку на дно помещают кусочек ваты, насыпают 0,75 г окиси алюминия и сверху - слой 0,75 г активированного угля, предварительно растертого в ступке. Над слоем угля помещают кусочек ваты. Наливают в колонку 25 мл экстракта, соответствующие 5 г исходного образца (при анализе кукурузы наливают 15 мл экстракта, соответствующие 3 г исходного образца). Отбирают элюат и, не давая колонке просохнуть, добавляют еще 10 мл смеси ацетонитрил-вода (84:16). Соединенные элюаты фильтруют через бумажный складчатый фильтр в грушевидную колбу на 50 мл, бумажный фильтр промывают 5 - 10 мл изо-пропилового спирта в ту же колбу. Фильтрат упаривают на ротационном испарителе до объема 5 - 7 мл. Добавляют 20 мл изо-пропилового спирта и повторно упаривают на ротационном испарителе досуха. Остаток в колбе после упаривания не должен содержать капель воды. Остаток растворяют в 200 мкл смеси хлороформ-ацетонитрил (4:1) - раствор А.

На пластинке "Силуфол" проводят тонкую карандашную линию в 1,5 - 2 см от нижнего края пластинки. На эту линию на расстоянии 2 см друг от друга наносят с помощью микрошприца 2, 5, 10 и 20 мкл раствора А. Между пятнами экстракта на расстоянии 1 см от них на ту же линию наносят 2, 4, 6 мкл стандартного раствора дезоксиниваленола (50, 100 и 150 нг дезоксиниваленола соответственно). Пластинку помещают в камеру для ТСХ и развивают в системе хлороформ-ацетон-изопропиловый спирт (78:22:10) на расстояние 10 см. Пластинку извлекают, сушат на воздухе 3 - 4 мин. и опрыскивают 20-процентным раствором хлористого алюминия в этиловом спирте. Пластинку нагревают в сушильном шкафу в течение 5 - 7 мин. при 105 °С, затем рассматривают в длинноволновом УФ-свете. Дезоксиниваленол проявляется в виде пятен с синей флуоресценцией и хроматографической подвижностью (Rf) 0,4 - 0,5. Наличие в экстракте пятен, соответствующих по цвету флуоресценции и хроматографической подвижности стандарту дезоксиниваленола, свидетельствует о загрязнении образца дезоксиниваленолом.

Для количественного определения сравнивают интенсивность флуоресценции разных количеств стандарта дезоксиниваленола с интенсивностью флуоресценции его пятен в образце, приблизительно оценивая количество нг дезоксиниваленола в нанесенных на пластинку объемах раствора А.

Концентрацию дезоксиниваленола в образце рассчитывают по формуле:

Условия ВЭЖХ: подвижная фаза гексан-изопропиловый спирт-вода (75:25:1,5), скорость подвижной фазы 1,2 мл/мин. Рекомендуется использовать перегнанные растворители, фильтруя их через бумажный складчатый фильтр перед использованием. УФ-детектор устанавливается на длину волны 224 нм, шкала чувствительности 0,005. Входное напряжение самописца 10 мВ.

Для калибровки прибора в инжектор с помощью микрошприца вводят 2 и 4 мкл стандартного раствора, что соответствует 50 и 100 нг дезоксиниваленола. Для каждого количества стандарта определяют высоту пика на хроматограмме. При описанных выше условиях ВЭЖХ время выхода пика дезоксиниваленола составляет от 12 до 14 мин. в зависимости от изменений в составе подвижной фазы.

Расчет концентрации дезоксиниваленола в образце проводят по формуле:

Пластинку "Силуфол" размечают тонкими карандашными линиями, не повреждая слоя силикагеля, согласно рис. 1 (не приводится). В правом нижнем углу на расстоянии 1,5 см от краев пластинки наносят с помощью микрошприца 20 мкл раствора А. В правом верхнем и левом нижнем углах пластинки на расстоянии 1,5 см от краев наносят 2, 3, 4 и 5, 6 мкл стандартного раствора дезоксиниваленола соответственно. Пластинку помещают в камеру для ТСХ со смесью эфир-метанол-вода-бензол (90:3:0,5:3) и развивают пластинку в первом направлении до достижения фронтом растворителя тонкой карандашной линии, проведенной в 4 см от верхнего края пластинки. Пластинку извлекают и сушат на воздухе 5 мин. Затем проводят развитие пластинки во 2-ом направлении в системе хлороформ-ацетон-изопропиловый спирт-уксусная кислота (78:22:10:1:3). После достижения фронтом растворителя карандашной линии, проведенной в 4 см от верхнего края пластинки, ее извлекают из камеры и сушат на воздухе. Обнаружение и количественное определение дезоксиниваленола проводят аналогично п. 3.

По вопросам практического внедрения метода обнаружения, идентификации и определения содержания дезоксиниваленола в зерне и зернопродуктах следует обращаться в Институт питания АМН СССР (Москва, 109240, Устьинский проезд, 2/14, тел. 227-88-54).