"МУК 4.1.3350-16. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств ципродинила в зерне и соломе зерновых культур методом капиллярной газожидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 10.03.2016)

1. Разработаны сотрудниками ФБУН "Федеральный научный центр гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана" Роспотребнадзора (В.Н. Ракитский, Т.В. Юдина, О.Е. Егорченкова, С.К. Рогачева).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 17 декабря 2015 г. N 2).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 10 марта 2016 г.

4. Введены впервые.

Свидетельство об аттестации МВИ N РОСС RU.0001.310430/0234.10.06.15.

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода капиллярной газожидкостной хроматографии для измерения концентраций ципродинила в зерне в диапазоне 0,01 - 0,1 мг/кг, в соломе зерновых культур в диапазоне 0,05 - 0,5 мг/кг.

Методические указания носят рекомендательный характер.

Ципродинил

4-циклопропил-6-метил-N-фенилпиридин-2-амин (ИЮПАК)

C₁₄H₁₅N₃

Молекулярная масса 225,3.

Представляет собой бежевый порошок со слабым запахом. Температура плавления: 75,9 °C. Давление паров: 5,1·10^-1 МПа (25 °C; кристаллическая модификация A); 4,7·10^-1 МПа (25 °C; кристаллическая модификация B). Растворимость (мг/дм³) в воде при 25 °C: 20 (pH 5); 13 (pH 7); 15 (pH 9). Растворимость в органических растворителях (г/дм³) при 25 °C: гексан - 30; ацетон - 610; этанол - 160; толуол - 460; октанол - 140. Стабильность в водных растворах: ДТ₅₀ при pH 4 - 9 и 25 °C - более года; плотность при 20 °C: 1,21 г/см³.

Краткая токсикологическая характеристика. Острая пероральная токсичность (LD₅₀) для крыс, мышей > 2 000 мг/кг; острая дермальная токсичность (LD₅₀) для крыс > 2 000 мг/кг; острая ингаляционная токсичность (LC₅₀, 4 ч) для крыс > 1 200 мг/дм³.

Область применения. Ципродинил - системный фунгицид, хорошо проникающий в растение через листья и передвигающийся преимущественно по ксилеме. Эффективно подавляет рост мицелия различных патогенов (мучнистая роса, плодовая гниль и парша плодовых культур). Ингибирует рост мицелия в тканях растений, предотвращает спорообразование.

При соблюдении всех регламентируемых условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерения при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для всего диапазона измерений (n = 20) приведены в табл. 2.

Метод основан на определении ципродинила с использованием капиллярной газожидкостной хроматографии (ГЖХ) с масс-селективным детектором (МСД) после извлечения вещества из анализируемых образцов смесью ацетонитрил-вода (80:20, по объему), очистки экстрактов перераспределением в системе несмешивающихся растворителей и на колонке с флорисилом.

Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующей дополнительной очистки растворителей.

Примечание. Допускается применение оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ Р 12.1.019-09, а также требования, изложенные в технической документации на газовый хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и ГН 2.2.5.2308-07. Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004-90.

4.3. При работе с газами, находящимися в баллонах под давлением до 15 МПа (150 кгс/см²), необходимо соблюдать "Правила устройства и безопасной эксплуатации стационарных компрессорных установок, воздухопроводов и газопроводов под давлением", ПБ-03-576-03. Запрещается открывать вентиль баллона, не установив на нем понижающий редуктор.

К выполнению измерений допускают специалистов, прошедших обучение, освоивших методику, владеющих техникой, имеющих опыт работы на газовом хроматографе и подтвердивших соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности по п. 13.

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на газовом хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Выполнению измерений предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), приготовление градуировочных растворов, раствора внесения, установление градуировочной характеристики, приготовление смесей растворителей для экстракции и очистки экстрактов, подготовка колонки с флорисилом, проверка поведения ципродинила на колонке с флорисилом.

7.1.1. Ацетон перегоняют над небольшим количеством перманганата калия и прокаленным карбонатом калия или подвергают ректификационной перегонке на колонне с числом теоретических тарелок не менее 30.

7.1.2. Ацетонитрил кипятят с обратным холодильником над пентоксидом фосфора (на 1 дм³ ацетонитрила 20 г пентоксида фосфора) не менее 1 часа, после чего перегоняют, непосредственно перед употреблением ацетонитрил повторно перегоняют над прокаленным карбонатом калия (на 1 дм³ ацетонитрила 10 г карбоната калия).

7.1.3. н-Гексан, хлористый метилен. Растворитель последовательно промывают порциями концентрированной серной кислоты до тех пор, пока она не перестанет окрашиваться в желтый цвет, затем водой до нейтральной реакции промывных вод, перегоняют над прокаленным карбонатом калия.

7.2.1. Исходный раствор ципродинила для градуировки (концентрация 100 мкг/см³). В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 0,01 г ципродинила, растворяют в 50 - 60 см³ ацетона, доводят ацетоном до метки, тщательно перемешивают.

Раствор хранят в холодильнике при температуре 4 - 6 °C в течение 6 месяцев.

7.2.2. Рабочий раствор N 1 ципродинила для градуировки и внесения (концентрация 2,0 мкг/см³). В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 2,0 см³ исходного градуировочного раствора с концентрацией 100,0 мкг/см³ (п. 7.2.1), доводят до метки ацетоном, тщательно перемешивают, получают рабочий раствор N 1 с концентрацией ципродинила 2,0 мкг/см³.

Раствор хранят в холодильнике при температуре 4 - 6 °C в течение 1 месяца. Этот раствор используют для приготовления проб с внесением при оценке полноты извлечения действующего вещества методом "внесено-найдено" и контроля качества результатов измерений методом добавок.

7.2.3. Рабочие растворы N 2 - 5 ципродинила для градуировки (концентрация 0,02 - 0,2 мкг/см³). В 4 мерные колбы вместимостью 100 см³ помещают 1,0; 2,5; 5,0 и 10,0 см³ рабочего раствора N 1 с концентрацией 2,0 мкг/см³ (п. 7.2.2), доводят до метки ацетоном, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы N 2 - 5 с концентрациями ципродинила 0,02; 0,05, 0,1 и 0,2 мкг/см³.

Растворы хранят в холодильнике при температуре 4 - 6 °C в течение 7 дней.

Градуировочную характеристику, выражающую линейную (с угловым коэффициентом) зависимость площади пика от концентрации ципродинила в растворе, устанавливают методом абсолютной калибровки по 4 растворам для градуировки.

В испаритель хроматографа вводят по 1 мм³ каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.4. Осуществляют не менее 5 параллельных измерений. Устанавливают площади пика ципродинила, на основании которых строят градуировочную зависимость. Градуировочный график проверяют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов. Если значения площадей отличаются более, чем на 10% от параметров градуировочной характеристики, ее строят заново, используя свежеприготовленные рабочие растворы для градуировки.

В мерную колбу вместимостью 1 000 см³ помещают 20 г безводного хлорида натрия, растворяют в 600 - 700 см³ деионизованной воды, доводят водой до метки, перемешивают до полного растворения соли.

7.5.1. Смесь ацетонитрил-вода (объемное соотношение 8:2). В мерную колбу вместимостью 1 000 см³ помещают 800 см³ ацетонитрила и 200 см³ воды, перемешивают.

7.6.1. Смесь гексан-ацетон (объемное соотношение 9:1). В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 90 см³ гексана и 10 см³ ацетона, перемешивают.

Нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см, внутренним диаметром 10 - 12 мм уплотняют тампоном из стекловаты, выливают в колонку (при открытом кране) суспензию 5 г флорисила в 20 см³ гексана. Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента и помещают на него слой безводного сульфата натрия массой 1 г. Колонку промывают 15 см³ гексана, скорость прохождения растворителя 1 - 2 капли в секунду. Колонка готова к работе.

В круглодонную колбу вместимостью 10 см³ помещают 0,1 см³ раствора N 1 ципродинила для внесения с концентрацией 2,0 мкг/см³ (п. 7.2.2), упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре водяной бани не выше 35 °C. Сухой остаток растворяют в 4 см³ гексана, помещают на ультразвуковую баню на 30 секунд и наносят на колонку, подготовленную по п. 7.7. Колбу обмывают дважды смесью гексан-ацетон (9:1, по объему) порциями по 2,5 см³, которые также наносят на колонку.

Затем колонку промывают 40 см³ смеси гексан-ацетон (9:1, по объему) со скоростью 1 - 2 капли в секунду. Фракционно (по 10 см³) отбирают элюат, упаривают, остатки растворяют в 1 см³ ацетона, анализируют содержание ципродинила по п. 9.4.

Фракции, содержащие ципродинил, объединяют и вновь анализируют.

Устанавливают уровень вещества в элюате, определяют полноту смывания с колонки и необходимый для очистки объем элюента.

Примечание. Проверку хроматографического поведения ципродинила следует проводить обязательно, поскольку профиль вымывания может изменяться при использовании новой партии сорбентов и растворителей.

Отбор проб производится в соответствии с правилами, определенными: зерно - ГОСТ 13586.3-83 "Зерно. Правила приемки и методы отбора проб", ГОСТ Р 50436-92 (ИСО 950-79) "Зерновые. Отбор проб зерна"; солома - ГОСТ 27262-87 "Корма растительного происхождения. Методы отбора проб" и ГОСТ 26313-84 "Продукты переработки плодов и овощей. Правила приемки, методы отбора проб" и "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79).

Пробы зерна и соломы хранят в бумажной или тканевой упаковке при комнатной температуре.

Для длительного хранения образцы замораживают и хранят при температуре -18 °C.

Перед анализом образцы зерна и соломы зерновых измельчают на гомогенизаторе.

Образцы измельченного зерна массой 10 г, помещают в плоскодонную колбу вместимостью 250 см³, добавляют 80 см³ смеси ацетонитрил-вода (80:20, по объему) и помещают на аппарат для встряхивания на 30 минут. Пробе дают отстояться, затем надосадочную жидкость фильтруют на воронке Бюхнера с помощью разряжения, создаваемого водоструйным насосом, через двойной фильтр средней плотности. Экстракцию повторяют еще два раза, используя 50 см³ смеси ацетонитрил-вода (80:20, по объему), выдерживая каждый раз по 1 мин на ультразвуковой бане и 30 мин на аппарате для встряхивания.

Объединенный отфильтрованный экстракт переносят в круглодонную колбу для упаривания вместимостью 250 см³, перемешивают, упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 35 °C до водного остатка (объем 5 - 10 см³) и подвергают очистке перераспределением в системе несмешивающихся растворителей по п. 9.2, затем на колонке с флорисилом по п. 9.3.

Образцы измельченной соломы массой 5 г помещают в плоскодонную колбу вместимостью 250 см³, добавляют 100 см³ смеси ацетонитрил-вода (80:20, по объему) и помещают на аппарат для встряхивания на 30 минут. Пробе дают отстояться, затем надосадочную жидкость фильтруют на воронке Бюхнера с помощью разряжения, создаваемого водоструйным насосом, через двойной фильтр средней плотности. Экстракцию повторяют еще два раза, используя 75 см³ смеси ацетонитрил-вода (80:20, по объему), выдерживая каждый раз по 1 мин на ультразвуковой бане и 30 мин на аппарате для встряхивания.

Объединенный отфильтрованный экстракт переносят в делительную воронку вместимостью 500 см³, добавляют 50 см³ гексана и интенсивно встряхивают в течение 2 мин. После полного разделения фаз нижний водный слой отделяют, переносят в коническую колбу. Верхний гексановый слой отбрасывают. Водную фазу вновь переносят в делительную воронку и повторяют операцию промывки, используя 50 см³ гексана.

Полученный экстракт переносят в круглодонную колбу для упаривания вместимостью 250 см³, перемешивают, упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 35 °C до водного остатка (объем 5 - 10 см³) и подвергают очистке перераспределением в системе несмешивающихся растворителей по п. 9.2, затем на колонке с флорисилом по п. 9.3.

К водному экстракту, полученному по п. 9.1.1 и 9.1.2, добавляют 50 см³ 2%-го раствора хлорида натрия, перемешивают и помещают в делительную воронку вместимостью 250 см³. Колбу дополнительно обмывают 50 см³ 2%-го раствора хлорида натрия, которые также переносят в воронку, затем добавляют 50 см³ дихлорметана и интенсивно встряхивают в течение 5 мин. После полного разделения фаз нижний дихлорметановый слой фильтруют через слой безводного сульфата натрия (толщиной около 1 см), помещенный на бумажном фильтре в конусной воронке, в круглодонную колбу вместимостью 150 см³. Экстракцию ципродинила повторяют еще дважды порциями дихлорметана объемом 50 см³, встряхивая в течение 2 мин.

Безводный сульфат натрия, помещенный на фильтре, дополнительно промывают 10 см³ дихлорметана.

Для полного разделения фаз содержимое воронки должно отстояться 10 - 15 мин. Следы дихлорметана в водной фазе недопустимы, поскольку это снижает полноту извлечения вещества.

Объединенную органическую фазу, пропущенную через слой сульфата натрия, помещенного на бумажном фильтре высокой плотности в конусной воронке, упаривают на ротационном испарителе при температуре не выше 35 °C досуха. Сухой остаток растворяют в 20 см³ гексана, отбирают ¹/₅ экстракта и подвергают дополнительной очистке на колонке с флорисилом по п. 9.3.

Остаток, полученный по п. 9.2, находящийся в круглодонной колбе, растворяют в 4 см³ гексана, помещая на ультразвуковую баню на 30 с. Раствор наносят на колонку, подготовленную по п. 7.7. Колбу обмывают дважды смесью гексан-ацетон (9:1, по объему) порциями по 2,5 см³, которые также наносят на колонку. Скорость прохождения растворителя через колонку - 1 - 2 капли в секунду.

Ципродинил элюируют с колонки 40 см³ смеси гексан-ацетон (9:1, по объему) со скоростью 1 - 2 капли в секунду, собирая элюат в круглодонную колбу вместимостью 100 - 150 см³, раствор упаривают досуха при температуре не выше 35 °C.

Остаток, находящийся в круглодонной колбе, растворяют в 1 см³ ацетона при анализе проб зерна; в 2,5 см³ - проб соломы и анализируют содержание ципродинила по п. 9.4.

Хроматографическая капиллярная кварцевая колонка длиной 30 м, внутренним диаметром 0,25 мм, содержащая сорбент: 5% фенил- и 95% диметилполисилоксана (толщина пленки сорбента 0,25 мкм).

Температура детектора: квадруполя - 150 °C, источника - 230 °C, переходной камеры - 280 °C.

Температура испарителя: 275 °C.

Температура термостата колонки программированная. Начальная температура - 180 °C, выдержка 2 мин, нагрев колонки со скоростью 10 градусов в минуту до температуры 260 °C, выдержка 18 мин.

Газ 1 (гелий): поток в колонке 1,0 см³/мин.

Давление: 99,8 кПа.

Средняя линейная скорость: 38 см/с.

Хроматографируемый объем: 1 мм³.

Режим сканирования - SIM, m/z: 224; 77.

Линейный диапазон детектирования: 0,02 - 0,2 нг.

Содержание ципродинила в пробе (X, мг/кг) рассчитывают по формуле:

X - содержание ципродинила в пробе, мг/кг;

A - концентрация ципродинила, найденная по градуировочной характеристике в соответствии с величиной площади хроматографического пика, мкг/см³;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, см³;

m - масса (объем) анализируемого образца, г;

K - коэффициент, учитывающий объем аликвоты экстракта, взятый для анализа (K = 5 (зерно, солома хлебных злаков)).

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:

X₁, X₂ - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости (табл. 1), при этом .

При невыполнении условия выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

- среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

- граница абсолютной погрешности, мг/кг:

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

Если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе зерна - 0,01 мг/кг, соломы зерновых культур - менее 0,05 мг/кг". <*>

--------------------------------

<*> 0,01 мг/кг, 0,05 мг/кг - предел обнаружения ципродинила в пробах зерна и соломы зерновых культур соответственно.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-02 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят в начале и по окончании каждой серии анализов.

При контроле стабильности градуировочной характеристики проводят измерения не менее двух образцов концентраций для градуировки, содержание ципродинила в которых должно охватывать весь диапазон концентраций от 0,02 до 0,2 мкг/см³.

Градуировочная характеристика считается стабильной, если для каждого из используемого для контроля градуировочного раствора сохраняется соотношение:

X - концентрация ципродинила в пробе при контрольном измерении, мкг/см³;

C - известная концентрация градуировочного раствора ципродинила, взятая для контроля стабильности градуировочной характеристики, мкг/см³;

B - норматив контроля погрешности градуировочной характеристики, % (B = 10% при P = 0,95).

Если величина расхождения (A) превышает 10%, делают вывод о невозможности применения градуировочной характеристики для дальнейших измерений. В этом случае выясняют и устраняют причины нестабильности градуировочной характеристики и повторяют контроль ее стабильности с использованием других градуировочных растворов ципродинила, предусмотренных МВИ. При повторном обнаружении нестабильности градуировочной характеристики устанавливают ее заново согласно п. 7.3.

Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом "добавок".

Величина добавки C_д должна удовлетворять условию:

- характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно), мг/кг. При этом:

- граница абсолютной погрешности, мг/кг:

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

Результат контроля процедуры K_к рассчитывают по формуле:

, , C_д - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки соответственно, мг/кг.

Норматив контроля K рассчитывают по формуле:

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (K_к) с нормативом контроля (K).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (1) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (1) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости. Расхождение между результатами измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), не должно превышать предела воспроизводимости (R):

X₁, X₂ - результаты измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), мг/кг;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.