"МУК 4.1.3185-14. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств прохлораза в зеленой массе, семенах и масле подсолнечника и рапса методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 24.07.2014)

Разработаны сотрудниками "Всероссийского НИИ защиты растений", С.-Петербург (Долженко В.И., Цибульская И.А., Комарова А.С.).

Свидетельство о метрологической аттестации N 01.5.04.175/01.00043/2014.

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения остаточных количеств прохлораза в зеленой массе, семенах подсолнечника и рапса в диапазоне концентраций 0,025 - 0,250 мг/кг; в масле подсолнечника и рапса 0,05 - 0,50 мг/кг.

Методические указания носят рекомендательный характер.

Название действующего вещества по ИСО: прохлораз.

Название действующего вещества по ИЮПАК: N-пропил-N-[2-(2,4,6-трихлорфенокси)этил]-имидазол-1-карбоксамид.

Структурная формула:

Эмпирическая формула: C₁₅H₁₆Cl₃N₃O₂.

Молекулярная масса: 376,7.

Химически чистое вещество, бесцветный кристаллический порошок без запаха.

Температура плавления: 46,5 - 49,3 °C.

Давление пара при 20 °C: 9 x 10^-2 мПа, K_owlogP = 4,12.

Растворимость: в воде (25 °C) - 34,4 мг/л; ксилоле - 2,5; ацетоне - 3,5; гексане - 7,5 x 10^-3 кг/л (25 °C). Легко растворим в хлороформе, диэтиловом эфире, толуоле. Гидролитически стабилен в диапазоне pH от 5,0 до 7,22 при 22 °C (период наблюдения 30 дней). Разлагается под действием света в присутствии сильных кислот и оснований, а также при длительном нагревании при температуре 200 °C. Слабое основание (pK_a 3,8).

Краткая токсикологическая характеристика. Острая оральная токсичность ЛД₅₀ для крыс 1 600 - 2 400 мг/кг, для мышей - 2 400 мг/кг. Дермальная токсичность ЛД₅₀ превышает 2 100 мг/кг для крыс и 3 000 мг/кг - для кроликов. Ингаляционная токсичность LC₅₀ для крыс превышает 2,16 мг/м³ воздуха (период наблюдения 4 ч). Не оказывает раздражающего действия на кожу.

Область применения препарата. Фунгицид защитного и уничтожающего действия. Эффективен против возбудителей болезней Pseudocercosprella, Pyrenophora, Rhynchosporium, Septoria, Alternaria, Botrytis и др. в посевах зерновых, овощных, технических и плодовых культур при нормах расхода 400 - 600 г д.в./га.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Методика основана на определении прохлораза методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием УФ-детектора после его извлечения из образцов смесью гексан-ацетон, очистки перераспределением в системе несмешивающихся растворителей и последующей очистки твердофазной экстракцией на патронах.

Идентификация прохлораза проводится по времени удерживания, количественное определение - методом абсолютной калибровки.

Избирательность метода обеспечивается сочетанием условий подготовки проб и хроматографирования.

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.

Примечание. Допускается применение оборудования и материалов с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-09, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

4.2. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией, соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и 2.2.5.2308-07.

Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004-90.

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 13.

При выполнении измерений выполняют следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Перед началом анализа колонку кондиционируют в потоке подвижной фазы (0,1 - 0,2 см³/мин) до стабилизации нулевой линии.

Установка и подготовка всех приборов и средств измерения проводится в соответствии с требованиями технической документации.

Кондиционирование патронов, заполненных силикагелем 60 (0,5 г), осуществляют пропусканием 2,5 см³ гексана.

7.4.1. Раствор ортофосфорной кислоты 0,005 М. В мерную колбу объемом 1 дм³ помещают (0,5 +/- 0,01) г 98%-й ортофосфорной кислоты, растворяют в бидистиллированной воде и доводят объем до метки.

7.4.2. Для приготовления подвижной фазы смешивают ацетонитрил с 0,005 М раствором ортофосфорной кислоты в соотношении 50:50 по объему, используя мерные цилиндры.

7.5.1. Основной раствор с концентрацией 0,5 мг/см³. Точную навеску прохлораза (50 +/- 0,5) мг помещают в мерную колбу вместимостью 100 см³, растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом.

7.5.2. Приготовление градуировочных растворов.

Градуировочные растворы с концентрациями прохлораза 0,25; 0,5; 1,25 и 2,5 мкг/см³ готовят методом последовательного разбавления по объему, используя раствор подвижной фазы.

7.5.2.1. Раствор N 1 с концентрацией 2,5 мкг/см³. В мерную колбу вместимостью 100 см³ вносят 0,5 см³ основного раствора и доводят до метки подвижной фазой.

7.5.2.2. Раствор N 2 с концентрацией 1,25 мкг/см³. В мерную колбу вместимостью 10 см³ вносят 5,0 см³ раствора N 1 и доводят до метки подвижной фазой.

7.5.2.3. Раствор N 3 с концентрацией 0,5 мкг/см³. В мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 2,0 см³ раствора N 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.5.2.4. Раствор N 4 с концентрацией 0,25 мкг/см³. В мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 1,0 см³ раствора N 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

Основной раствор можно хранить в холодильнике в силанизированном или тефлоновом флаконе при температуре 0 - 4 °C в течение месяца, градуировочные растворы используют в течение рабочего дня.

При изучении полноты извлечения прохлораза используют ацетонитрильные растворы вещества.

Для построения градуировочного графика (площадь пика - концентрация прохлораза в растворе) в хроматограф вводят по 10 мм³ градуировочных растворов (не менее 3 параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4 точек по диапазону измеряемых концентраций). Затем измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации прохлораза в градуировочном растворе.

Методом наименьших квадратов рассчитывают градуировочный коэффициент (К) в уравнении линейной регрессии:

S - площадь пика градуировочного раствора.

Градуировку признают удовлетворительной, если значение коэффициента линейной корреляции оказывается не ниже 0,99.

Градуировочную характеристику необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы, а также при отрицательном результате контроля градуировочного коэффициента.

Градуировочную зависимость признают стабильной при выполнении следующего условия:

C - аттестованное значение массовой концентрации прохлораза в градуировочном растворе;

C_К - результат контрольного измерения массовой концентрации прохлораза в градуировочном растворе;

- норматив контроля градуировочного коэффициента, % ( при P = 0,95).

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (от 21.08.79 N 2051-79), а также отбор проб семян подсолнечника и рапса для анализа проводят в соответствии с ГОСТ 0852-86 "Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб".

Семена хранят при комнатной температуре в полотняных мешочках, перед анализом доводят до стандартной влажности и измельчают. Растительное масло хранят в холодильнике при температуре 0 - 4 °C в герметично закрытой стеклянной таре в течение 6 месяцев.

В коническую колбу вместимостью 100 см³ помещают (10 +/- 0,1) г измельченных семян подсолнечника (рапса) или зеленой массы, прибавляют 30 см³ смеси гексан-ацетон в соотношении 70:30 и экстрагируют в ультразвуковой бане в течение 15 мин. Суспензию фильтруют на воронке Бюхнера через бумажный фильтр быстрой фильтрации. Экстракцию повторяют дважды. Объединенный экстракт помещают в делительную воронку и отделяют нижний слой. Органический слой упаривают на ротационном испарителе при температуре бани не выше 40 °C до полного удаления растворителя. Остаток растворяют в 10 см³ гексана и вносят в предварительно кондиционированный по п. 7.3 патрон. Патрон последовательно промывают 10 см³ гексана и 2,5 см³ элюента 1. Фильтрат и промывку отбрасывают. Прохлораз элюируют 6 см³ элюента 2. Элюат упаривают досуха на ротационном испарителе (40 °C). Сухой остаток растворяют в 2 см³ гексана и вносят в такой же предварительно кондиционированный патрон. Промывают 5 см³ элюента 1. Фильтрат и промывку отбрасывают. Прохлораз элюируют 5 см³ элюента 2. Элюат упаривают досуха на ротационном испарителе (40 °C). Сухой остаток растворяют в 1 см³ подвижной фазы и 10 мм³ образца вводят в жидкостный хроматограф.

Масло в количестве (5 +/- 0,05) г растворяют в 25 см³ гексана и пропускают через патрон, кондиционированный по п. 7.3. Промывают последовательно 25 см³ гексана и 2,5 см³ элюента 1. Фильтрат и промывку отбрасывают. Прохлораз элюируют 6 см³ элюента 2. Элюат упаривают досуха на ротационном испарителе (40 °C). Остаток растворяют в 2 см³ гексана и вносят в аналогичный, кондиционированный по п. 7.3 патрон. Фильтрат отбрасывают, а прохлораз элюируют 10 см³ элюата 2. Элюат упаривают досуха на ротационном испарителе (40 °C). Сухой остаток растворяют в 1 см³ подвижной фазы и 10 мм³ полученного раствора вводят в хроматограф.

Ультраэффективный жидкостный хроматограф с быстросканирующим УФ-детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки. Аналитическая колонка, заполненная сорбентом с привитыми монофункциональными полярными группами C18, (100 x 2,1) мм, 1,7 мкм. Температура колонки: (30 +/- 1) °C. Подвижная фаза: смесь ацетонитрила и 0,005 М ортофосфорной кислоты в соотношении 50:50. Скорость потока элюента: 0,15 см³/мин. Рабочая длина волны УФ-детектора: 230 нм. Объем вводимой пробы: 10 мм³. Абсолютное время удерживания прохлораза составляет (3,5 +/- 0,1) мин.

Содержание прохлораза в образцах зеленой массы, семенах и масле подсолнечника и рапса (X, мг/кг) вычисляют по формуле:

S₁ - площадь пика прохлораза в стандартном растворе (мВ·с);

S₂ - площадь пика прохлораза в анализируемой пробе (мВ·с);

V - объем пробы, подготовленной для хроматографического анализа, см³;

P - навеска анализируемого образца, г;

C - концентрация стандартного раствора прохлораза, мкг/см³.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор прохлораза 1 мкг/см³, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:

X₁, X₂ - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости .

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

при вероятности P = 0,95, где

X - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

- граница абсолютной погрешности, мг/кг:

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

В случае, если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе менее нижней границы определения" (например: менее 0,025 мг/кг <*>, где <*> - 0,025 мг/кг - предел обнаружения прохлораза в семенах подсолнечника).

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-02 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

3.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

Величина добавки C_д должна удовлетворять условию:

- характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно), мг/кг;

при этом:

- граница абсолютной погрешности, мг/кг:

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

Результат контроля процедуры К_к рассчитывают по формуле:

X', X, C_д - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 4) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки соответственно, мг/кг.

Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (К_к) с нормативом контроля (К).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

X₁, X₂ - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций), %.