"МУК 4.1.3412-17. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств индоксакарба в белокочанной капусте методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 14.02.2017)

1. Разработаны Российским государственным аграрным университетом - МСХА им. К.А. Тимирязева, Учебно-научный консультационный центр "Агроэкология пестицидов и агрохимикатов" Минсельхоза России (А.В. Довгилевич, Е.В. Довгилевич, Е.Н. Тестова, Ю.Н. Савушкин).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 22 декабря 2016 г. N 2).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 14 февраля 2017 г.

4. Введены впервые.

Свидетельство о метрологической аттестации МВИ N РОСС RU.0001.310430/0252.12.02.2016 от 12.02.2016.

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения уровня остаточных количеств индоксакарба в белокочанной капусте в диапазоне 1,0 - 10,0 мг/кг. Методические указания носят рекомендательный характер.

Индоксакарб

Метил(S)-N-[7-хлоро-2,3,4а,5-тетрагидро-4а-(метоксикарбонил)индено[1,2-e] [1,3,4] оксадиазин-2-илкарбонил]-4'-(трифторметокси) карбанилат

Эмпирическая формула: C₂₂H₁₇ClF₃N₃O₇.

Молекулярная масса: 527,8.

Агрегатное состояние: порошок.

Цвет, запах: белого цвета.

Давление паров: 2,5 x 10^-5 МПа (25 °C).

Коэффициент распределения октанол/вода (при 25 °C): K_ow logP = 4,65.

Температура плавления: 88,1 °C.

Растворимость в воде (мг/дм³, 25 °C): 0,2.

Растворимость в органических растворителях (г/дм³, при 25 °C): ацетон - более 250; ацетонитрил - 139; метанол - 103; н-октанол - 14,5.

Гидролитически стоек в кислой и нейтральной среде - ДТ₅₀ более 30 дней (pH 5), 38 дней (pH 7), но быстро разрушается в щелочном растворе - ДТ₅₀ 1 день (при pH 9).

В почве индоксакарб умеренно персистентен, в аэробных условиях ДТ₅₀ от 3 до 23 дней, в анаэробных условиях ДТ₅₀ - 186 дней. В илистой почве ДТ₅₀ - 17 дней.

Краткая токсикологическая характеристика. Индоксакарб относится к умеренно опасным веществам по острой пероральной (ЛД₅₀ для крыс от 268 до 1 732 мг/кг) и по ингаляционной токсичности (ЛК₅₀ для крыс (4 часа) более 2 000 мг/м³) и к мало опасным веществам по дермальной токсичности (ЛД₅₀ для кроликов более 5 000 мг/кг). Не раздражает слизистую глаз и кожу кроликов.

Область применения. Индоксакарб - инсектицид из класса оксадиазинов контактного и кишечного действий, блокирует натриевые каналы нервных волокон активным S-изомером. Насекомые прекращают питаться, у них нарушается координация, наступает паралич и затем смерть.

Применяется для борьбы с широким спектром различных бабочек на хлопчатнике, овощных культурах и в фруктовых садах при нормах расхода 12,5 - 125 г/га.

Проходит регистрационные испытания в России в качестве инсектицида для борьбы с вредителями яблоневых садов и виноградников с нормой расхода 0,4 - 0,5 л/га и пятью обработками за сезон.

В России установлены следующие гигиенические нормативы:

ДСД - 0,01 мг/кг массы человека;

ОДК в почве - 0,9 мг/кг;

ПДК в воде водоемов - 0,015 мг/дм³;

ОБУВ в воздухе рабочей зоны - 0,3 мг/м³;

ОБУВ в атмосферном воздухе - 0,005 мг/м³;

МДУ в продукции (мг/кг): яблоки - 0,5; томаты - 0,5; семена и масло рапса - 0,05; лук, виноград - 2,0.

ВМДУ для импортируемой продукции (мг/кг): капуста кочанная - 3,0.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительные интервалы среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в табл. 2.

Метод основан на определении индоксакарба с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием тандемного масс-спектрометрического детектора (ВЭЖХ-МС-МС) после его экстракции путем гомогенизации аналитического образца с органическим растворителем, очистки экстракта перераспределением между двумя несмешивающимися фазами, а также дополнительной очистки путем фильтрования пробы.

Идентификация индоксакарба проводится по времени удерживания, наличию характеристичных ионов в масс-спектрах хроматографически выделенного вещества и соотношению интенсивности (площади) пиков, отвечающих характеристичным ионам идентифицируемого компонента и аналитического стандарта на регистрируемых ионных масс-хроматограммах. Концентрацию индоксакарба определяют по площадям соответствующих хроматографических пиков на ионных масс-хроматограммах по методу абсолютной калибровки.

В предлагаемых условиях анализа метод специфичен. Избирательность метода достигается за счет использования масс-спектрометрического детектора по ионам, характеризующим вещество.

Примечание. Допускается использование средств измерений с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание. Допускается использование реактивов иных производителей с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание. Допускается применение оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ Р 12.1.019-09, а также требования, изложенные в технической документации на комплекс жидкостного хроматографа с масс-спектрометрическим детектором.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 "Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны". Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004-91.

К выполнению измерений и обработке их результатов допускаются специалисты, имеющие опыт работы в химической лаборатории, прошедшие обучение и владеющие техникой проведения анализа, освоившие метод анализа в процессе тренировки и уложившиеся в нормативы контроля при проведении процедуры контроля погрешности анализа.

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C, относительной влажности не более 80% и нормальном атмосферном давлении;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Выполнению измерений предшествуют следующие операции: очистка растворителей (при необходимости), приготовление растворов, кондиционирование хроматографической колонки, подготовка колонок с окисью алюминия и концентрирующих патронов N 1 для очистки экстракта, проверка хроматографического поведения вещества на колонках с окисью алюминия и на концентрирующих патронах N 1, установление градуировочной характеристики.

Ацетонитрил, содержащий воду, предварительно осушают, добавляя в него гранулированный безводный хлористый кальций из расчета не менее 100 г/дм³. Выдерживают его над осушителем в течение 5 - 6 ч. Затем ацетонитрил сливают с осушителя в круглодонную колбу со шлифом объемом 4 000 см³ аппарата для перегонки растворителей.

Ацетонитрил перегоняют при температуре 81,5 °C, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 81,5 °C, отбрасывают.

Дистиллированную воду помещают в круглодонную колбу со шлифом объемом 4 000 см³ от аппарата для перегонки растворителей, добавляют к ней марганцовокислый калий из расчета 1 г/дм³ и кипятят в течение 6 ч.

Собирают фракции, отогнанные при температуре 100,0 °C, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 100,0 °C, отбрасывают.

Гексан, содержащий воду, предварительно осушают, добавляя в него гранулированный безводный хлористый кальций из расчета не менее 100 г/дм³. Выдерживают его над осушителем в течение 5 - 6 ч. Затем гексан сливают с осушителя в круглодонную колбу со шлифом объемом 4 000 см³ аппарата для перегонки растворителей.

Гексан перегоняют при температуре 68,7 °C, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 68,7 °C, отбрасывают.

7.2.1.1. Стандартный раствор N 1 с концентрацией индоксакарба 1,0 мг/см³. Взвешивают 50 мг индоксакарба в мерной колбе объемом 50 см³. Навеску растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом. Полученный стандартный раствор N 1 используется для приготовления стандартных растворов для хроматографического исследования и установления градуировочной характеристики. Стандартный раствор N 1 хранится в холодильнике в течение 6 месяцев.

7.2.1.2. Стандартный раствор N 2 с концентрацией индоксакарба 10,0 мкг/см³. Из стандартного раствора N 1 отбирают пипеткой 1 см³, помещают в мерную колбу объемом 100 см³ и доводят объем до метки ацетонитрилом. Стандартный раствор N 2 используется для приготовления стандартных растворов для установления градуировочной характеристики. Стандартный раствор N 2 хранится в холодильнике не более 30 суток.

7.2.1.3. Стандартный раствор N 3 с концентрацией индоксакарба 1,0 мкг/см³. Из стандартного раствора N отбирают пипеткой 1 см³, помещают в мерную колбу объемом 10 см³ и доводят объем до метки ацетонитрилом. Стандартный раствор N 3 используется для хроматографического исследования и установления градуировочной характеристики и хранится в холодильнике не более 15 суток.

7.2.1.4. Стандартный раствор N 4 с концентрацией индоксакарба 0,5 мкг/см³. Из стандартного раствора N 3 отбирают пипеткой 5 см³, помещают в мерную колбу объемом 10 см³ и доводят объем до метки ацетонитрилом. Стандартный раствор N 4 используется для хроматографического исследования и установления градуировочной характеристики и хранится в холодильнике не более 15 суток.

7.2.1.5. Стандартный раствор N 5 с концентрацией индоксакарба 0,2 мкг/см³. Из стандартного раствора N 2 отбирают пипеткой 1 см³, помещают в мерную колбу объемом 50 см³ и доводят объем до метки ацетонитрилом. Стандартный раствор N 5 используется для хроматографического исследования и установления градуировочной характеристики и хранится в холодильнике не более 15 суток.

7.2.1.6. Стандартный раствор N 6 с концентрацией индоксакарба 0,1 мкг/см³. Из стандартного раствора N 2 отбирают пипеткой 1 см³, помещают в мерную колбу объемом 100 см³ и доводят объем до метки ацетонитрилом. Стандартный раствор N 6 используется для установления градуировочной характеристики и хранится в холодильнике не более 15 суток.

7.2.1.7. Стандартные растворы с концентрацией индоксакарба 100,0; 50,0; 20,0 и 10,0 мкг/см³ для внесения в контрольные образцы. Методом последовательного разведения ацетонитрилом готовят растворы, содержащие по 100,0; 50,0; 20,0 и 10,0 мкг/см³, и используют эти растворы для внесения в контрольные образцы капусты. Стандартные растворы для внесения в контрольные образцы хранятся в холодильнике не более 30 суток.

Градуировочную характеристику, выражающую отклик целевого иона (Response) от концентрации индоксакарба в растворе (мкг/см³), устанавливают путем определения соотношения интенсивности (площади) пиков, отвечающих характеристичным ионам идентифицируемого компонента и аналитического стандарта на регистрируемых ионных масс-хроматограммах по 4 растворам для градуировки с концентрацией 0,1; 0,2; 0,5 и 1,0 мкг/см³.

В инжектор хроматографа вводят по 5 мм³ каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.2. Осуществляют не менее 5 параллельных измерений.

Хроматографическую колонку с предколонкой устанавливают в термостате хроматографа и стабилизируют при температуре 25 °C и скорости потока подвижной фазы 0,3 см³/мин 3 - 4 ч.

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" N 2051-79 от 21.08.79, а также в соответствии с ГОСТ Р 51809-01 "Капуста белокочанная свежая, реализуемая в розничной торговой сети" и ГОСТ 1724-85 "Капуста белокочанная свежая, заготовляемая и поставляемая. ТУ".

Пробы капусты хранят в холодильнике в полиэтиленовых пакетах при температуре 0 - 4 °C в течение суток. Для длительного хранения пробы замораживают и хранят в морозильной камере при температуре -18 °C.

Образец измельченных кочанов капусты массой 10 г помещают в стеклянный стакан объемом 100 см³, затем навеску переносят в стеклянный стакан объемом 500 см³ двумя порциями ацетонитрила по 50 см³. С помощью погружного миксера перемешивают содержимое в течение 1 мин. Экстракт фильтруют в коническую колбу объемом 250 см³ с 5 г хлорида натрия через фильтр низкой плотности, остаток на фильтре промывают 10 см³ ацетонитрила, перемешивают и выдерживают 5 мин.

Затем объединенный экстракт переносят в делительную воронку (нерастворившуюся соль оставляют в колбе) и после разделения фаз нижний водный слой отбрасывают. Ацетонитрильный экстракт в делительной воронке промывают двумя порциями гексана объемом по 50 см³, каждый раз интенсивно встряхивая воронку по 2 мин. После полного разделения фаз отбрасывают выделившийся нижний водный слой и верхний гексановый слой. Ацетонитрильный экстракт переносят в концентратор объемом 250 см³ через слой безводного сульфата натрия, осушитель в колбе промывают 10 см³ ацетонитрила, объединяют с основным экстрактом и упаривают досуха при температуре не выше 40 °C.

К сухому остатку в концентраторе, полученному по п. 9.1.1, прибавляют 5 см³ ацетонитрила, обмывают стенки концентратора, затем прибавляют 100 см³ дистиллированной воды, 5 г хлорида натрия, перемешивают и переносят в делительную воронку объемом 250 см³. Индоксакарб экстрагируют тремя порциями гексана объемом по 30 см³, встряхивая делительную воронку каждый раз по 2 мин. После полного разделения фаз в делительной воронке верхний слой (гексан) собирают через слой безводного сульфата натрия в концентратор объемом 250 см³ и выпаривают досуха при температуре не выше 40 °C.

Сухой остаток растворяют в 100 см³ ацетонитрила (методом последовательного разведения). С помощью инъекционного шприца однократного применения объемом 5 см³ и шприцевого фильтра с размером пор 0,20 мкм фильтруют пробу в виалу объемом 2 см³ для автоматического дозатора проб и 5 мм³ пробы вводят в хроматограф.

Система высокоэффективной жидкостной хроматографии с тандемным масс-спектрометрическим детектором, включающая:

- модульный жидкостной хроматограф, состоящий из градиентного насоса на два растворителя, позволяющий регулировать поток элюента от 0,001 до 5,0 см³/мин и создавать давление от 0 до 600 бар;

- вакуумный дегазатор;

- термостат колонок с двумя независимо нагреваемыми зонами с диапазоном температур от 10 до 80 °C;

- автоматический дозатор проб с использование виал на 2 см³.

ВЭЖХ-система соединена с тандемным масс-спектрометрическим детектором типа тройной квадруполь с двумя высокопроизводительными турбомолекулярными насосами, позволяющим регистрировать отдельные ионы с заданными массами от 5 до 3 000 а.е.м.

Система оснащена компьютерной системой обработки данных, контролирующей работу всего прибора, обеспечивающей сбор и хранение всех масс-хроматограмм в процессе проведения хромато-масс-спектрометрического анализа, обеспечивающее обработку результатов измерений, вывод и расчет масс-хроматограмм и количественный анализ.

Режим хроматографа

Колонка хроматографическая стальная длиной 50 мм, с внутренним диаметром 2,1 мм, зернением 1,8 мкм, заполненная сорбентом с привитыми полярными группами C18.

Предколонка хроматографическая стальная длиной 12,5 мм, внутренним диаметром 2,1 мм, зернением 5 мкм, заполненная сорбентом с привитыми полярными группами C18.

Температура колонки: 25 °C.

Подвижная фаза: ацетонитрил-вода (% по объему) в градиентном режиме.

Градиент потока элюента: до 1 мин - 5:95; к 3 мин - 70:30; к 5 мин - 95:5; к 10 мин - 95:5; к 12 мин - 5:95.

Скорость потока элюента: 0,3 см³/мин.

Длина волны: 300 нм.

Объем вводимой пробы: 5 мм³.

Режим масс-спектрометра

Газ-осушитель - азот с температурой 320 °C, расход 10 м³/мин.

Расход газа периферийного слоя 11 м³/мин с температурой 250 °C.

Давление в распылителе 30 psi.

Напряжение ионизации 3 500 В.

Метод ионизации - электроспрей.

Режим ионизации - положительная.

Режим сканирования - мониторинг множественных реакций (MRM) с двумя MRM-переходами: - переход количественного определения, энергия соударения 10 В; - подтверждающий переход, энергия соударения - 15 В. Энергия фрагментации - 130 В, время сканирования - 50 мс.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор индоксакарба с концентрацией 1,0 мкг/см³, соответственно разбавляют.

Для обработки результатов хроматографического анализа используется компьютерное программное обеспечение химического анализа, которое входит в хроматографическую систему.

Альтернативная обработка результатов.

Содержание индоксакарба в пробах рассчитывают по формуле, без учета полноты извлечения вещества из проб:

X - содержание индоксакарба в пробе, мг/кг;

S_ст - высота (площадь) пика стандарта, мм;

S_пр - высота (площадь) пика образца, мм;

A - концентрация стандартного раствора, мкг/см³;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, см³;

m - масса анализируемого образца, г (см³);

P - содержание индоксакарба в аналитическом стандарте, %.

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предел повторяемости:

X₁, X₂ - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости (табл. 1), при этом .

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

- среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

- граница абсолютной погрешности, мг/кг:

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

В случае если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе менее 1,0 мг/кг". <*>

--------------------------------

<*> 1,0 мг/кг - предел обнаружения.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений, а также контроль стабильности градуировочной характеристики осуществляют в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-02 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Контроль стабильности градуировочной характеристики.

Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

Контроль стабильности градуировочной характеристики для индоксакарба проводят при смене основного градуировочного раствора N 1 каждые 6 месяцев, при смене основного градуировочного раствора N 2 каждый месяц, при смене основных градуировочных растворов N 3, 4, 5 и 6 - каждые 15 суток, а также в начале и окончании каждой серии анализов.

При контроле стабильности градуировочной характеристики проводят измерения не менее трех образцов концентраций для градуировки, содержание индоксакарба в которых должно охватывать весь диапазон концентраций от 0,1 до 1,0 мкг/см³.

Градуировочная характеристика считается стабильной, если для каждого из используемого для контроля градуировочного раствора сохраняется соотношение:

X - концентрация индоксакарба контрольного измерения, мкг/см³;

C - известная концентрация градуировочного раствора индоксакарба в ацетонитриле, взятая для контроля стабильности градуировочной характеристики, мкг/см³;

2,62 - погрешность градуировочной характеристики, %.

Если величина расхождения (A) превышает 2,62%, делают вывод о невозможности применения градуировочной характеристики для дальнейших измерений. В этом случае выясняют и устраняют причины нестабильности градуировочной характеристики и повторяют контроль ее стабильности с использованием других градуировочных растворов индоксакарба, предусмотренных МВИ. При повторном обнаружении нестабильности градуировочной характеристики определяют ее заново согласно п. 7.3.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.

Величина добавки C_д должна удовлетворять условию:

- характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно) мг/кг, при этом:

- граница абсолютной погрешности, мг/кг:

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

Результат контроля процедуры K_к рассчитывают по формуле:

, , C_д - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11), содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце и концентрация добавки соответственно, мг/кг.

Норматив контроля K рассчитывают по формуле:

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (K_к) с нормативом контроля (K).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предел воспроизводимости (R):

X₁, X₂ - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.