"МУК 4.1.3134-13. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств ципроконазола и эпоксиконазола в зерне и масле сои методом газожидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 12.11.2013)

1. Разработаны сотрудниками ГНУ "Всероссийский НИИ защиты растений" (В.И. Долженко, И.А. Цибульская, О.К. Остроухова).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 29 октября 2013 г. N 3).

3. Утверждены врио руководителя Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главного государственного санитарного врача Российской Федерации А.Ю. Поповой 12 ноября 2013 г.

4. Введены впервые.

Свидетельство о метрологической аттестации N 01.5.04.144/01.00043/2013.

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода капиллярной газожидкостной хроматографии для определения массовой концентрации ципроконазола в зерне сои в диапазоне 0,025 - 0,25 мг/кг, масле сои - в диапазоне 0,05 - 0,5 мг/кг и эпоксиконазола в зерне и масле сои в диапазоне концентраций 0,05 - 0,5 мг/кг.

Методические указания носят рекомендательный характер.

Название действующего вещества по ИСО: ципроконазол.

Название действующего вещества по ИЮПАК: 1-(1H-1,2,4-триазол-1-ил)-2-(4-хлорфенил)-3-циклопропилбутан-2-ол.

Структурная формула:

Эмпирическая формула: .

Молекулярная масса: 291,8.

Ципроконазол представляет собой смесь двух диастереоизомеров (в соотношении 1:1).

Бесцветная жидкость.

Температура плавления: 106,2 - 106,9 °C; давление пара при 25 °C: .

Коэффициент распределения н-октанол - вода: .

Растворимость: в воде - 93 мг/дм3 (22 °C); в гексане - 1,3, метаноле - 410, этаноле - 230, толуоле - 100, октаноле - 100, ксилоле - 120, ацетоне - 360, этилацетате - 240, дихлорметане - 430, диметилсульфоксиде - 180 (все в г/дм3, 25 °C).

Вещество разлагается: 5% при хранении в течение 2 лет. Вещество стабильно в водном растворе при pH 1 - 9 в течение 35 дней при 50 °C, 14 дней при 80 °C; медленно гидролизуется в 1N HCl и NaOH.

В почвах ципроконазол не аккумулируется и умеренно быстро разлагается, около 3 месяцев.

Краткая токсикологическая характеристика. Острая пероральная токсичность для крыс 1 020 - 1 333, мышей 200 - 218 мг/кг, острая дермальная токсичность для крыс и кроликов > 2 000 мг/кг; не оказывает раздражающего действия на кожу и глаза кролика.

Область применения. Системный фунгицид, действует на грибной патоген внутри растения за счет нарушения процесса биосинтеза стеролов в клеточной мембране.

Гигиенические нормативы для ципроконазола в России. МДУ для сои не установлен.

Название действующего вещества по ИСО: эпоксиконазол.

Название действующего вещества по ИЮПАК: 1-{2-(4-фторфенил)-[3-(2-хлорфенил)оксиран-2-ил]метил}-1H-1,2,4-триазол.

Структурная формула:

Эмпирическая формула: .

Молекулярная масса: 329,8.

Эпоксиконазол представляет собой 2R,3S - 2S,3R энантиомерную пару.

Бесцветные кристаллы без запаха.

Температура плавления: 136,2 °C; давление пара при 20 °C: 0,01 мПа.

Коэффициент распределения н-октанол - вода: (pH 7).

Растворимость: в воде - (20 °C); в гептане 0,04; ацетоне - 14,4; дихлорметане - 29,1 (г/100 см3).

Вещество не гидролизуется при pH 5 - 7 в течение 12 дней.

В биологически активных почвах эпоксиконазол разлагается почвенными микроорганизмами - около 2 - 3 месяцев, в растениях экстенсивно деградирует.

Краткая токсикологическая характеристика. Острая пероральная токсичность для крыс > 5 000 мг/кг, острая дермальная токсичность для крыс > 2 000 мг/кг; не оказывает раздражающего действия на кожу и глаза кролика.

Область применения. Системный фунгицид широкого спектра действия, обладает профилактическим и лечебным свойствами, эффективен против возбудителей ржавчины, мучнистой росы и пятнистости на зерновых и сое.

Гигиенические нормативы для эпоксиконазола в России. МДУ для сои не установлен.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1, для соответствующих диапазонов концентраций.

Методика основана на определении ципроконазола и эпоксиконазола в одной пробе методом капиллярной газожидкостной хроматографии с использованием термоионного детектора после их извлечения из образцов зерна сои водным ацетоном, из масла после его растворения в гексане ацетонитрилом и очистки экстракта в системе двух несмешивающихся растворителей.

Идентификация ципроконазола и эпоксиконазола проводится по времени удерживания, количественное определение - методом абсолютной калибровки.

Избирательность метода обеспечивается сочетанием условий подготовки проб и хроматографирования.

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.

Примечание. Допускается применение оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-09, а также требования, изложенные в технической документации на газовый хроматограф.

4.2. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией, соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленные ГН 2.2.5.1313-03 и 2.2.5.2308-07. Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004-90.

4.3. При работе с газами, находящимися в баллонах под давлением до 15 мПа (150 кгс/см2), необходимо соблюдать "Правила устройства и безопасной эксплуатации стационарных компрессорных установок, воздуховодов и газопроводов под давлением" ПБ-03-576-03. Запрещается открывать вентиль баллона, не установив на нем понижающий редуктор.

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом капиллярной газожидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 13.

При выполнении измерений выполняют следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на газовом хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Перед началом анализа капиллярную колонку кондиционируют в токе азота при температуре термостата колонок 250 °C до стабилизации нулевой линии.

Растворители, используемые для анализа, специальной подготовки не требуют. Рекомендуется проверить чистоту применяемых растворителей. Для этого 100 см3 растворителя испаряют при помощи вакуумного ротационного испарителя при температуре 40 °C до объема 1 см3 и хроматографируют. При обнаружении примесей, которые могут мешать определению, растворители очищают общепринятыми методами.

7.3.1, 7.3.2. Основной раствор с концентрацией 0,5 мг/см3: точную навеску ципроконазола или эпоксиконазола (50 +/- 0,1) мг помещают в мерную колбу на 100 см3, растворяют в ацетоне и доводят объем до метки тем же растворителем.

Градуировочные растворы ципроконазола с концентрациями 0,5; 1,0; 2,0 и 5,0 мкг/см3 готовят методом последовательного разбавления основного раствора по объему, используя гексан.

7.3.1.1. Раствор N 1 с концентрацией ципроконазола 5 мкг/см3: в мерную колбу на 100 см3 вносят 1 см3 основного раствора и доводят объем до метки гексаном.

7.3.1.2. Раствор N 2 с концентрацией ципроконазола 2,0 мкг/см3: в мерную пробирку вместимостью 10 см3 вносят 4 см3 раствора N 1 и доводят объем до метки гексаном.

7.3.1.3. Раствор N 3 с концентрацией ципроконазола 1,0 мкг/см3: в мерную пробирку вместимостью 10 см3 помещают 2 см3 раствора N 1 и доводят объем до метки гексаном.

7.3.1.4. Раствор N 4 с концентрацией ципроконазола 0,5 мкг/см3: в мерную пробирку вместимостью 10 см3 вносят 1 см3 раствора N 1 и доводят объем до метки гексаном.

Градуировочные растворы эпоксиконазола с концентрациями 1,0; 2,0; 5,0 и 10,0 мкг/см3 готовят методом последовательного разбавления основного раствора по объему, используя гексан.

7.3.2.1. Раствор N 1 с концентрацией эпоксиконазола 10 мкг/см3: в мерную колбу на 100 см3 вносят 2 см3 основного раствора и доводят объем до метки гексаном.

7.3.2.2. Раствор N 2 с концентрацией эпоксиконазола 5,0 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 100 см3 вносят 1 см3 раствора N 1 и доводят объем до метки гексаном.

7.3.2.3. Раствор N 3 с концентрацией эпоксиконазола 2,0 мкг/см3: в мерную пробирку вместимостью 10 см3 помещают 4 см3 раствора N 1 и доводят объем до метки гексаном.

7.3.2.4. Раствор N 4 с концентрацией эпоксиконазола 1,0 мкг/см3: в мерную пробирку вместимостью 10 см3 вносят 2 см3 раствора N 1 и доводят объем до метки гексаном.

Основной раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0 - 4 °C в течение 6 месяцев, градуировочные растворы - в течение 2 недель.

Для внесения в образец зерна или масла сои при определении полноты извлечения используют соответствующие градуировочные растворы ципроконазола или эпоксиконазола.

Для построения градуировочного графика (площадь пика - концентрация ципроконазола или эпоксиконазола в растворе) в хроматограф вводят по 1 мм3 градуировочных растворов (не менее 3 параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4 точек по диапазону измеряемых концентраций). Затем измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации определяемого компонента в градуировочном растворе.

Методом наименьших квадратов рассчитывают градуировочный коэффициент (K) в уравнении линейной регрессии:

S - площадь пика градуировочного раствора.

Градуировку признают удовлетворительной, если значение коэффициента линейной корреляции оказывается не ниже 0,99.

Градуировочную характеристику необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы, а также при отрицательном результате контроля градуировочного коэффициента.

Градуировочную зависимость признают стабильной при выполнении следующего условия:

C - аттестованное значение массовой концентрации определяемого компонента в градуировочном растворе;

- результат контрольного измерения массовой концентрации определяемого компонента в градуировочном растворе;

- норматив контроля градуировочного коэффициента, % ( при P = 0,95).

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79), а также в соответствии с ГОСТ 10852-86 "Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб".

Для длительного хранения зерно сои подсушивают при комнатной температуре в отсутствие света. Сухие образцы могут храниться в течение года. Перед анализом пробы зерна доводят до стандартной влажности и измельчают. Пробы масла хранят в холодильнике при 0 - 4 °C в герметично закрытой стеклянной таре не более 2 месяцев.

9.1.1. Экстракция ципроконазола и эпоксиконазола из семян сои

Навеску измельченного зерна сои (20 +/- 0,1) г вносят в колбу вместимостью 250 см3, добавляют 70 см3 смеси ацетон - вода (8:2) и помещают в ультразвуковую ванну на 10 мин. Полученный экстракт фильтруют через бумажный фильтр в круглодонную колбу для упаривания. Экстракцию повторяют еще раз с 50 см3 смеси ацетон - вода (8:2) в ультразвуковой ванне в течение 10 мин. К объединенному фильтрату добавляют 50 см3 дистиллированной воды и упаривают полученный раствор до полного удаления ацетона на ротационном испарителе при температуре бани не выше 30 °C. Водный остаток очищают переэкстракцией по п. 9.2.

9.1.2. Экстракция ципроконазола и эпоксиконазола из масла сои

Навеску масла сои (10 +/- 0,1) г помещают в плоскодонную коническую колбу вместимостью 250 см3, добавляют 30 см3 гексана и 100 см3 ацетонитрила, колбу встряхивают и оставляют на ночь. Затем гексаноацетонитрильный раствор переносят в делительную воронку, после разделения слоев гексановый слой отбрасывают. К ацетонитрильному раствору добавляют 50 см3 дистиллированной воды и фильтруют полученный раствор через двойной бумажный фильтр (предварительно смоченный водой) в круглодонную колбу-концентратор. Полученный фильтрат упаривают до полного удаления ацетонитрила при температуре бани не выше 40 °C. Водный остаток помещают на 2 ч в холодильник, затем снова фильтруют через двойной бумажный фильтр (предварительно смоченный водой). Водный остаток очищают переэкстракцией по п. 9.2.

К водному остатку, полученному по пп. 9.1.1 или 9.1.2 и помещенному в делительную воронку на 250 см3, добавляют 10 см3 насыщенного раствора хлористого натрия и экстрагируют ципроконазол и эпоксиконазол дихлорметаном трижды по 30 см3, интенсивно встряхивая воронку в течение 2 - 3 мин. После полного разделения слоев дихлорметановый слой собирают, сушат над безводным сернокислым натрием (10 г) и упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре не выше 40 °C. Сухой остаток растворяют в 1 см3 гексана и 1 мм3 раствора вводят в хроматограф.

Газовый хроматограф с термоионным детектором. Капиллярная кварцевая колонка длиной 30 м, внутренним диаметром 0,25 мм с толщиной слоя полярной неподвижной фазы 0,25 мкм. Температура колонки: программирование от 180 °C (1 мин) до 300 °C (4 мин) со скоростью 25 °C/мин. Температура испарителя 300 °C. Температура детектора 380 °C. Расход газов: газа-носителя (азот) - 6,7 см3/мин (170 кПа), водорода и воздуха к детектору - 13 и 200 см3/мин соответственно, дополнительного газа (азот) к детектору - 20 см3/мин, сброс 4,2 см3/мин. Деление потока 1:2,7. Объем конечного экстракта 1 см3, хроматографируемый объем 1 мм3.

Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки. Содержание ципроконазола или эпоксиконазола в пробе (X, мг/кг) вычисляют по формуле:

- площадь пика определяемого компонента на хроматограмме испытуемого образца, мм2 (AU);

K - градуировочный коэффициент, найденный на стадии построения соответствующей градуировочной зависимости;

V - объем пробы, подготовленной для хроматографического анализа, см3;

P - навеска анализируемого образца, г;

f - полнота извлечения определяемого компонента, приведенная в табл. 2, %.

Содержание остаточных количеств ципроконазола или эпоксиконазола в образце вычисляют как среднее из двух параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор ципроконазола с концентрацией 5 мкг/см3 или раствор эпоксиконазола с концентрацией 10 мкг/см3, разбавляют гексаном.

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предел повторяемости:

, - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости .

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

при вероятности P = 0,95, где

- среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

- граница абсолютной погрешности, мг/кг:

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

В случае если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"Содержание вещества в пробе менее нижней границы определения" (например: менее 0,05 мг/кг*, где * - 0,05 мг/кг - предел обнаружения ципроконазола и эпоксиконазола в масле сои).

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-02 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода "добавок".

Величина добавки должна удовлетворять условию:

, - характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно), мг/кг;

при этом:

- граница абсолютной погрешности, мг/кг:

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

Результат контроля процедуры рассчитывают по формуле:

X', X, - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки соответственно, мг/кг.

Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

Проводят сопоставление результата контроля процедуры с нормативом контроля (К).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предел воспроизводимости (R):

, - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций), %.