"МУК 4.1.3189-14. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств тиофанат-метила и карбендазима в зеленой массе, соломе и зерне хлебных злаков, ботве и корнеплодах сахарной свеклы, яблоках и яблочном соке методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 24.07.2014)

Разработаны сотрудниками "Всероссийского НИИ защиты растений", С.-Петербург (Долженко В.И., Цибульская И.А., Черменская Т.Д., Комарова А.С.).

Свидетельство о метрологической аттестации N 01.5.04.173/01.00043/2014.

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения массовой концентрации тиофанат-метила в зеленой массе и соломе в диапазоне концентраций 0,5 - 5,0 мг/кг, в зерне, корнеплодах, ботве, яблоках и яблочном соке - 0,1 - 1,0 мг/кг; карбендазима в зеленой массе и соломе в диапазоне концентраций 0,5 - 5,0 мг/кг, в зерне, яблоках и яблочном соке - 0,1 - 1,0 мг/кг, в корнеплодах и ботве - 0,05 - 0,50 мг/кг.

Методические указания носят рекомендательный характер.

Название действующего вещества по ИСО: тиофанат-метил.

Название действующего вещества по ИЮПАК: Dimethyl 4,4'-(o-phenylene)bis(3-thioallophanate).

Структурная формула:

Эмпирическая формула: C₁₂H₁₄N₄O₄S₂.

Молекулярная масса: 342,39.

Химически чистое вещество представляет собой белое кристаллическое вещество.

Температура плавления: разлагается до плавления.

Давление пара при 25 °C: 8,8 x 10^-3 МПа.

Растворимость (в мг/дм³ при 20 °C): вода - 20, гексан - 0,47, ксилол - 110, метанол - 7 800, этилацетат - 8 400.

Константа диссоциации (pKa) при 25 °C: 7,28 (слабая кислота).

Стабильность к гидролизу при 20 °C: DT₅₀ = 867 дней (pH 5), 36 дней (pH 7), 0,7 дней (pH 9). Период полураспада в почве: DT₅₀ = 0,6 дня.

Краткая токсикологическая характеристика. Острая пероральная токсичность LD₅₀ для крыс более 5 000 мг/кг, острая дермальная токсичность LD₅₀ для крыс превышает 2 000 мг/кг.

Оказывает раздражающее действие на дыхательные пути, обладает репродуктивной токсичностью и мутагенностью.

Умеренно токсичен для пчел и дождевых червей.

Область применения препарата. Контактно-системный фунгицид с защитными и лечебными свойствами.

Механизм действия. В грибах, растениях и других биологических средах вещество превращается в карбендазим, поэтому считается, что по механизму действия тиофанат-метил аналогичен бензимидазолам.

Название действующего вещества по ИСО: карбендазим.

Название действующего вещества по ИЮПАК: Метилбензимидазол-2-илкарбамат.

Структурная формула:

Эмпирическая формула: C₉H₉N₃O₂.

Молекулярная масса: 191,2.

Химически чистое вещество представляет собой кристаллический порошок без цвета и запаха.

Температура плавления: 302 - 307 °C (с разложением).

Давление пара: 0,09 мПа (20 °C); 0,15 мПа (25 °C); 1,3 мПа (50 °C).

Коэффициент распределения в системе н-октанол-вода K_ow lgP = 1,38 (pH 5); 1,51 (pH 7); 1,49 (pH 9).

Растворимость в воде (мг/дм³, 24 °C): 29 (pH 4); 8 (pH 7); 7 (pH 8).

Растворимость в органических растворителях (г/дм³, 24 °C): диметилформамид - 5; ацетон - 0,3, этанол - 0,3; хлороформ - 0,1; этилацетат - 0,135; дихлорметан - 0,068; бензол - 0,036; циклогексан и диэтиловый эфир - < 0,01; н-гексан - 0,0005.

Субстанция карбендазима стабильна по крайней мере в течение 2 лет при температуре хранения ниже 50 °C, а также после 7 дней интенсивного облучения светом (20 000 люкс). В щелочных растворах медленно разлагается. При 22 °C DT₅₀ превышает 350 дней (pH 5 и 7) и равен 124 дням (pH 9). Будучи слабым основанием (pK_a 4,2), в кислых растворах образует стабильные водорастворимые соли.

Краткая токсикологическая характеристика. Острая оральная токсичность - LD₅₀ для крыс - 6 400 мг/кг; для собак - более 2 500 мг/кг; дермальная - LD₅₀ для кроликов более 10 000 мг/кг; для крыс - более 2 000 мг/кг; не оказывает раздражающего действия на кожу и слизистую оболочку глаз; ингаляционная - при использовании водной суспензии 10 г/л эффект не обнаружен для крыс, кроликов, морских свинок и кошек. Период наблюдения 4 ч.

Область применения. Фунгицид системного действия с длительным защитным и целебным эффектом. Эффективно подавляет развитие заболеваний растений, вызываемых грибами из родов Septoria, Fusarium, Erysiphe и Pseudocercosprella на зерновых культурах; Sclerotinia, Alternaria и Cylindrosporium на семенах рапса.

Гигиенические нормативы для карбендазима, установленные в России: МДУ в сахарной свекле - 0,1 мг/кг; в зерне хлебных злаков - 0,5 мг/кг; в плодовых семечковых - 0,2 мг/кг.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1, для соответствующих диапазонов концентраций.

Методика основана на определении тиофанат-метила и карбендазима методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием ультрафиолетового (УФ) детектора после извлечения из образцов ацетонитрилом, последующей очистки на сорбенте и в системе несмешивающихся растворителей.

Идентификация тиофанат-метила и карбендазима проводится по времени удерживания, количественное определение - методом абсолютной калибровки.

Избирательность метода обеспечивается сочетанием условий подготовки проб и хроматографирования.

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.

Примечание. Допускается применение оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-09, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

4.2. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией, соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и 2.2.5.2308-07.

Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004-90.

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 13.

При выполнении измерений выполняют следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Перед началом анализа аналитическую колонку кондиционируют в потоке подвижной фазы (0,1 - 0,2 см³/мин) до стабилизации нулевой линии.

7.2.1. Раствор трифторуксусной кислоты 0,05%-й. В мерную колбу объемом 1 дм³ помещают (0,5 +/- 0,01) г трифторуксусной кислоты, растворяют в бидистиллированной воде и доводят объем до метки.

7.2.2. Раствор гидроксида натрия 2М. В мерную колбу объемом 100 см³ помещают 8,0 г гидроксида натрия, растворяют в дистиллированной воде и доводят объем до метки.

7.2.3. Раствор соляной кислоты 0,1М. В мерную колбу объемом 1 дм³ помещают 8,1 см³ концентрированной соляной кислоты, растворяют в дистиллированной воде и доводят объем до метки.

7.3.1. Основной раствор тиофанат-метила с концентрацией 0,5 мг/см³. Точную навеску тиофанат-метила (50 +/- 0,5 мг) помещают в мерную колбу вместимостью 100 см³, растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом.

Градуировочные растворы с концентрациями тиофанат-метила 0,05; 0,1; 0,2; 0,5 и 1,0 мкг/см³ готовят методом последовательного разбавления по объему, используя смесь ацетонитрила и 0,05%-й трифторуксусной кислоты в соотношении 50:50.

7.3.2.1. Раствор N 1 с концентрацией 1,0 мкг/см³. В мерную колбу вместимостью 100 см³ вносят 0,2 см³ основного раствора и доводят до метки смесью ацетонитрила и 0,05%-й трифторуксусной кислоты в соотношении 50:50.

7.3.2.2. Раствор N 2 с концентрацией 0,5 мкг/см³. В мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 5,0 см³ раствора N 1 и доводят объем до метки смесью ацетонитрила и 0,05%-й трифторуксусной кислоты в соотношении 50:50.

7.3.2.3. Раствор N 3 с концентрацией 0,2 мкг/см³. В мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 2 см³ раствора N 1 и доводят объем до метки смесью ацетонитрила и 0,05%-й трифторуксусной кислоты в соотношении 50:50.

7.3.2.4. Раствор N 4 с концентрацией 0,1 мкг/см³. В мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 1 см³ раствора N 1 и доводят объем до метки смесью ацетонитрила и 0,05%-й трифторуксусной кислоты в соотношении 50:50.

7.3.2.5. Раствор N 5 с концентрацией 0,05 мкг/см³. В мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 0,5 см³ раствора N 1 и доводят объем до метки смесью ацетонитрила и 0,05%-й трифторуксусной кислоты в соотношении 50:50.

7.3.3. Основной раствор карбендазима с концентрацией 0,5 мг/см³. Точную навеску тиофанат-метила (50,0 +/- 0,5 мг) помещают в мерную колбу вместимостью 100 см³, растворяют в метаноле и доводят объем до метки метанолом.

Градуировочные растворы с концентрациями карбендазима 0,05; 0,1; 0,2; 0,5 и 1,0 мкг/см³ готовят методом последовательного разбавления по объему, используя 0,05%-ю трифторуксусную кислоту.

7.3.4.1. Раствор N 1 с концентрацией 1,0 мкг/см³. В мерную колбу вместимостью 100 см³ вносят 0,2 см³ основного раствора и доводят до метки 0,05%-й трифторуксусной кислотой.

7.3.4.2. Раствор N 2 с концентрацией 0,5 мкг/см³. В мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 5,0 см³ раствора N 1 и доводят объем до метки 0,05%-й трифторуксусной кислотой.

7.3.4.3. Раствор N 3 с концентрацией 0,2 мкг/см³. В мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 2 см³ раствора N 1 и доводят объем до метки 0,05%-й трифторуксусной кислотой.

7.3.3.4. Раствор N 4 с концентрацией 0,1 мкг/см³. В мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 1 см³ раствора N 1 и доводят объем до метки 0,05%-й трифторуксусной кислотой.

7.3.4.5. Раствор N 5 с концентрацией 0,05 мкг/см³. В мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 0,5 см³ раствора N 1 и доводят объем до метки 0,05%-й трифторуксусной кислотой.

Основные растворы тиофанат-метила и карбендазима можно хранить в холодильнике при температуре 0 - 4 °C в течение 1 месяца, градуировочные растворы - в течение суток.

При изучении полноты определения тиофанат-метила и карбендазима используют ацетонитрильные растворы веществ, приготовленные из основного раствора методом последовательного разбавления по объему ацетонитрилом.

Для установления градуировочной характеристики (площадь пика - концентрация тиофанат-метила или карбендазима в растворе) в хроматограф вводят по 10 мм³ градуировочных растворов (не менее 3 параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4 точек по диапазону измеряемых концентраций). Затем измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации тиофанат-метила или карбендазима в градуировочном растворе.

Методом наименьших квадратов рассчитывают градуировочный коэффициент (K) в уравнении линейной регрессии:

где S - площадь пика градуировочного раствора.

Градуировку признают удовлетворительной, если значение коэффициента линейной корреляции оказывается не ниже 0,99.

Градуировочную характеристику необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы, а также при отрицательном результате контроля градуировочного коэффициента.

Градуировочную зависимость признают стабильной при выполнении следующего условия:

где C - аттестованное значение массовой концентрации тиофанат-метила (или карбендазима) в градуировочном растворе;

C_K - результат контрольного измерения массовой концентрации тиофанат-метила (или карбендазима) в градуировочном растворе;

- норматив контроля градуировочного коэффициента, % ( при P = 0,95).

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (от 21.08.79 N 2051-79), а также в соответствии с ГОСТ Р 50436-92 (ИСО 950-79) "Зерновые. Отбор проб зерна". Пробы зерна и соломы для определения остатков в урожае хранят в бумажной или тканевой упаковке при комнатной температуре. Отбор проб свеклы производится в соответствии с ГОСТ 1722-85 "Свекла столовая свежая, заготовляемая и поставляемая". Для длительного хранения аналитические пробы свеклы (ботва и корнеплоды) помещают в морозильную камеру с температурой -18 °C и хранят в герметично закрытой полиэтиленовой таре. Отбор проб яблок производят в соответствии с ГОСТ 27572-87 "Яблоки свежие для промышленной переработки". Пробы яблок и яблочного сока хранят до анализа в герметичной таре в морозильной камере при температуре не выше -18 °C, в холодильнике сок хранят при температуре 0 - 4 °C в стеклянной таре с притертой пробкой в течение недели.

Навеску измельченной матрицы (10 г - зерно, корнеплоды и ботва сахарной свеклы, яблоки и яблочный сок; 2 г - зеленая масса и солома) помещают в полипропиленовую центрифужную пробирку вместимостью 50 см³, последовательно добавляют 10 см³ ацетонитрила, 4 г безводного сульфата магния, 1 г хлористого натрия, 1 г цитрата натрия двуводного и 0,5 г динатрия цитрата сесквигидрата. Пробирку плотно закрывают и помещают в перемешивающее устройство на 10 мин, затем центрифугируют в течение 10 мин при скорости 4 000 об./мин. От верхнего ацетонитрильного слоя отбирают 5 см³, переносят в центрифужную пробирку вместимостью 15 см³, содержащую 150 мг смеси первичных и вторичных аминов и 900 мг безводного сульфата магния. Пробирку плотно закрывают и помещают в перемешивающее устройство на 10 мин, затем центрифугируют в течение 10 мин при скорости 4 000 об./мин.

Для определения тиофанат-метила отбирают аликвоту 0,5 см³, переносят ее в виалу для хроматографирования, добавляют 0,5 см³ 0,05%-й трифторуксусной кислоты и 10 мм³ вводят в хроматограф.

Для определения карбендазима отбирают аликвоту 1,0 см³, переносят в круглодонную колбу и быстро упаривают досуха на ротационном испарителе. К сухому остатку добавляют 5 см³ 0,1 М соляной кислоты и переносят в делительную воронку. Кислый раствор промывают двумя порциями по 2 см³ этилацетата, подщелачивают 2 М раствором гидроксида натрия до pH 9 и экстрагируют карбендазим двумя порциями по 3 см³ этилацетата. Органические фракции пропускают через слой безводного сульфата натрия, собирая в круглодонную колбу, и упаривают на роторном испарителе. Сухой остаток растворяют в 1,0 см³ 0,05%-й трифторуксусной кислоты и 10 мм³ вводят в хроматограф.

Примечание. Определение тиофанат-метила необходимо проводить незамедлительно после приготовления пробы, так как он быстро разрушается, частично превращаясь в карбендазим. Пробы для определения карбендазима допускается хранить в холодильнике только после очистки в системе несмешивающихся растворителей.

Ультраэффективный жидкостный хроматограф с быстросканирующим УФ-детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки. Аналитическая колонка, заполненная сорбентом с привитыми монофункциональными полярными группами C18, (100 x 2,1) мм, 1,7 мкм. Температура колонки (30 +/- 1) °C.

Тиофанат-метил. Подвижная фаза: смесь ацетонитрила и 0,05%-й трифторуксусной кислоты в соотношении 30:70. Скорость потока элюента: 0,2 см³/мин. Рабочая длина волны УФ-детектора: 265 нм. Объем вводимой пробы: 10 мм³. Время удерживания тиофанат-метила: (5,9 +/- 0,1) мин.

Карбендазим. Подвижная фаза: смесь ацетонитрила и 0,05%-й трифторуксусной кислоты в соотношении 10:90. Скорость потока элюента: 0,2 см³/мин. Рабочая длина волны УФ-детектора: 281 нм. Объем вводимой пробы: 10 мм³. Время удерживания карбендазима: (4,3 +/- 0,1) мин.

Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки. Содержание тиофанат-метила или карбендазима в пробе (X, мг/кг) вычисляют по формуле:

где S_x - площадь пика тиофанат-метила или карбендазима на хроматограмме испытуемого образца, мм² (AU);

K - градуировочный коэффициент, найденный на стадии построения соответствующей градуировочной зависимости;

V - объем пробы, подготовленной для хроматографического анализа, см³;

P - навеска анализируемого образца, г;

f - полнота извлечения определяемого вещества, приведенная в табл. 2, %.

Содержание остаточных количеств определяемого вещества в образце вычисляют как среднее из двух параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор тиофанат-метила или карбендазима с концентрацией 1,0 мкг/см³, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:

где X₁, X₂ - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости .

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

где - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

- граница абсолютной погрешности, мг/кг:

где - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

В случае если содержание компонента меньше нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе менее нижней границы определения" (например: менее 0,1 мг/кг <*>, где <*> - 0,1 мг/кг - предел обнаружения тиофанат-метила в зерне).

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1 - 6-02 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

Величина добавки C_д должна удовлетворять условию:

где - характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно), мг/кг;

при этом:

где - граница абсолютной погрешности, мг/кг:

где - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

Результат контроля процедуры К_к рассчитывают по формуле:

где X', X, C_д - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки соответственно, мг/кг.

Норматив контроля K рассчитывают по формуле:

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (К_к) с нормативом контроля (К).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

где X₁, X₂ - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций), %.